מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למפות את מיקומם של ריבונוקלאוטידים משולבים ברמת רזולוציית נוקלאוטידים בודדים, ולכמת את מספר הריבונוקלאוטידים הקיימים ב-DNA המיטוכונדריאלי האנושי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לשלמות ה-DNA, מנגנוני שכפול DNA, מנגנוני תיקון DNA וכיצד פגמים בכל אחד מהמנגנונים הללו גורמים למחלות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שניתן לקבוע הן את המיקום והן את מספר הריבונוקלאוטידים המשולבים ב- DNA המיטוכונדריאלי בניסוי יחיד.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תכולת ריבונוקלאוטידים ב-DNA המיטוכונדריאלי האנושי, ניתן ליישם אותה גם לחקר DNA גרעיני ותכולת ריבונוקלאוטידים בגנומים של רצף של אורגניזמים מודל אחרים. DNA גנומי שבודד בעבר מתאי HeLa ותואר בסעיפים 2 ו-3 של פרוטוקול הטקסט משמש בניסוי זה. כדי לעכל את ה- DNA, מערבבים בזהירות את הדברים הבאים בצינור מיקרופוגה.

מיקרוגרם אחד של DNA, חמישה מיקרוליטרים של מאגר 10X 3.1, מיקרוליטר אחד של HincII ומים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 50 מיקרוליטר. דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בסיום העיכול, הוסיפו 1.8 נפחים של חרוזים פרמגנטיים לכל דגימה, מעורבבים בזהירות על ידי פיפטינג, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

הנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך חמש דקות כדי לגלול את החרוזים, ולאחר מכן הסר והשליך את הסופרנטנט. שטפו את הגלולה עם 150 מיקרוליטר של אתנול 70% למשך כ-30 שניות, ואז הסירו והשליכו את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עם 200 מיקרוליטר אתנול 70% למשך 30 שניות נוספות.

יבש את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך כ- 15 עד 20 דקות. לאחר מכן, הסר את הצינורות מהמתלה המגנטי. יש להוציא כל כדור ב-45 מיקרוליטר של מאגר פליטה, לערבב על ידי פיפטינג בזהירות, ולדגור במשך חמש דקות.

גלולה את החרוזים על המדף המגנטי, והעבירו 45 מיקרוליטר מכל דגימת DNA לצינור חדש. לכל 45 מיקרוליטר של DNA מבודד או מטוהר, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של שלושה אשלגן הידרוקסיד מולרי או חמישה מיקרוליטרים של שלושה אשלגן כלורי מולארי, וצרו נפח כולל של 50 מיקרוליטר. שמונה התגובות מסוכמות בטבלה זו.

דגרו בתנור הכלאה בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן דגרו את הדגימות על קרח למשך חמש דקות. זרז את ה- DNA על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי ב- pH 5.2, ו -125 מיקרוליטר קר, 100% אתנול ודגירה על קרח למשך חמש דקות. גלולה את ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-21,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט ושטפו כל כדור דנ"א עם 250 מיקרוליטר של קור, 70% אתנול, צנטריפוגה שוב, והשליכו את הסופרנטנט. הניחו לגלולה להתייבש בצינור הפתוח למשך כחמש עד 10 דקות, עד שכל נוזל גלוי יתאדה. לבסוף, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה, ותן לכדור ה-DNA להתמוסס בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

התחל הליך זה על ידי הכנת תערובת התגובה עבור כל דגימה כתערובת מאסטר. עבור כל דגימה, הוסף 2.5 מיקרוליטר של מאגר תגובת פולינוקלאוטיד קינאז 10x T4, 2.5 מיקרוליטר ATP ומיקרוליטר אחד של שלושה פוספטאז ראשוני מינוס T4 פולינוקלאוטיד קינאז. מעבירים 19 מיקרוליטר מכל דגימת DNA לתוך שפופרת חדשה של 200 מיקרוליטר, ומבצעים דנטורציה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס בתרמו-סייקלר למשך שלוש דקות.

לאחר מכן, קררו את דגימות ה-DNA על קרח, והוסיפו שישה מיקרוליטרים מתערובת התגובה המוכנה לכל דגימה. דגירה של תערובת התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לעצור את התגובה. טהר את ה-DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים, כפי שהודגם קודם לכן, אך נמחק עם 14 מיקרוליטר של מאגר פליטה.

הכן מראש את תערובת התגובה כתערובת מאסטר, המכילה את הדברים הבאים עבור כל דגימה. חמישה מיקרוליטרים של מאגר תגובה של 10x T4 RNA ligase, חמישה מיקרוליטרים של hexamminecobalt (III) כלוריד, 0.5 מיקרוליטר של ARC140 oligonucleotide, 0.5 מיקרוליטר ATP ו-25 מיקרוליטר של 50% PEG 8000. מערבבים היטב על ידי פיפטינג.

העבירו 13 מיקרוליטר מכל DNA מטוהר לצינור חדש של 200 מיקרוליטר, ועברו דנטורציה ב-85 מעלות צלזיוס בתרמו-סייקלר למשך שלוש דקות. מצננים את ה-DNA על קרח, ולאחר מכן מוסיפים 36 מיקרוליטר של תערובת תגובה לכל דגימה, מערבבים על ידי פיפטינג וסובבים לזמן קצר. הוסף מיקרוליטר אחד של T4 RNA ligase לכל תגובה, ערבב על ידי פיפטינג וסובב לזמן קצר.

דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך למשך הלילה. כאשר קשירת ה-DNA של גדיל יחיד הושלמה, טהר את ה-DNA כפי שהודגם קודם לכן, אך השתמש ב-0.8 נפחים של חרוזים פרמגנטיים וגלול את החרוזים למשך 10 דקות. הוצא פנימה 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה, והעביר 20 מיקרוליטר מכל דגימת DNA לצינור חדש של 200 מיקרוליטר.

חזור על הטיהור עם 0.8 נפחים של חרוזים פרמגנטיים, והוציא פנימה 14 מיקרוליטר של מאגר פליטה. עבור כל דגימה, הכינו את תערובת התגובה כתערובת מאסטר המורכבת משני מיקרוליטרים של מאגר תגובה פולימראז 10x T7 DNA, שני מיקרוליטרים של ARC76/77, שני מיקרוליטרים של dNTPs ו-0.8 מיקרוליטר BSA. העבירו 12.8 מיקרוליטר של DNA מטוהר לצינור חדש של 200 מיקרוליטר, ועברו דנטורציה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס בתרמו-סייקלר למשך שלוש דקות.

מצננים את ה-DNA על קרח, ולאחר מכן מוסיפים 6.8 מיקרוליטר של תערובת תגובה לכל דגימה, מערבבים על ידי פיפטינג, מסתובבים לזמן קצר ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף 0.4 מיקרוליטר של T7 DNA פולימראז לכל תגובה, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר טיהור ה-DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים, יש לשטוף פנימה 11 מיקרוליטר של מאגר פליטה.

כדי להתחיל בהגברת ה-PCR, הכינו את תערובת התגובה בנפרד עבור כל דגימה בשפופרת חדשה של 200 מיקרוליטר המורכבת מ-7.5 מיקרוליטר של ARC49, 7.5 מיקרוליטר של פריימר אינדקס ייחודי ו-25 מיקרוליטר של תערובת מוכנה להתחלה חמה פי 2. הוסף 10 מיקרוליטר של דגימת DNA לכל תגובה. הגבירו את הספרייה באמצעות התנאים הבאים.

דטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, ולאחר מכן 18 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וסיום התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. החזק את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס לאחר ההגברה. טהר את הספריות כמתואר בפרוטוקול הטקסט והוציא פנימה 20 מיקרוליטר של מאגר TE.

קבע את האיכות וגודל השבר הממוצע של כל ספרייה באמצעות מערכת אלקטרופורזה דיגיטלית. מוצגות תוצאות מייצגות של פרופילי ספרייה מתאימים לאחר טיפול באשלגן הידרוקסיד או אשלגן כלורי. לאחר חישוב הריכוז של כל ספרייה, משוך כמויות טוחנות שוות של עד 24 ספריות מוגברות עם פריימרים שונים לאינדקס לריצוף כמתואר בסעיפים 9 ו-10 בפרוטוקול הטקסט.

הוסף מאגר TE לנפח סופי של 25 מיקרוליטר וריכוז של 10 ננו-מולר. לאחר הרצף, בצע ניתוח נתונים ביואינפורמטיים כמפורט בסעיף 11 לפרוטוקול הטקסט. גרפים אלה מציגים את הקריאות המסוכמות בכל אתרי HincII ב-DNA מיטוכונדריאלי אנושי גדיל קל וכבד לאחר טיפול באשלגן כלורי.

כ-70% מכולם זיהו חמישה קצוות ראשוניים הממוקמים באתרי החיתוך, מה שמדגים את היעילות הגבוהה של עיכול HincII. טיפול בספריות עם אשלגן הידרוקסיד להידרוליזה של ה-DNA בריבונוקלאוטידים משובצים מקטין את מספר הקריאות ב-HincII לכ-40%המספר היחסי של קריאות ב-DNA המיטוכונדריאלי והגרעיני חושף הבדלים בכיסוי וממחיש את החשיבות של נורמליזציה מתאימה להסרת הטיית הגדיל. נורמליזציה של ספירת הקריאה ל-HincII נותנת מדד כמותי של מספר הריבונוקלאוטידים לכל גנום מיטוכונדריאלי על הגדיל הכבד או הקל.

הקריאות לאחר טיפול באשלגן הידרוקסיד עבור כל ריבונוקלאוטיד, מנורמל להרכב הרצף של כל גדיל, מראות יחס שונה מאחד, המצביע על התפלגות לא אקראית של קריאות ומרמז על דפוס ריבונוקלאוטיד מובהק ואיכות ספרייה גבוהה. נורמליזציה של הקריאות באתרים של ריבונוקלאוטידים משובצים לאלה באתרי HincII, כמו גם לתכולת הנוקלאוטידים של הגנום, מייצרת מדד כמותי של כמה מכל ריבונוקלאוטיד משולב לכל 1,000 בסיסים משלימים. לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך יומיים אם הוא מבוצע כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על ה-DNA בטקט גבוה ולהימנע מהכנסת שברים של גדיל כפול במהלך הכנת הספרייה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו על מנת לאשר את נתוני כימות הריבונוקלאוטיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין ספריות למיפוי וכימות של ריבונוקלאוטידים ו-DNA באמצעות ריצוף הדור הבא.

אל תשכח שעבודה עם כימיקלים כמו אשלגן הידרוקסיד עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מגן עיניים וכפפות בעת ביצוע הליך זה.