Name: מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: למד מיפוי וכימות בו זמניים של ריבונוקלאוטידים ב-DNA מיטוכונדריאלי אנושי ברזולוציית נוקלאוטיד בודד. שיטה זו משלבת עיכול אנזימטי והידרוליזה בסיסית לחקר שלמות DNA ומנגנוני תיקון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר השבדי (www.vr.se) מעניקה קשת (2014-6466 וקרן שבדי למחקר אסטרטגי (www.stratresearch.se) כדי ארק (ICA14-0060). האוניברסיטה הטכנולוגית של צ'אלמרס מסופקים תמיכה כספית MKME במהלך עבודה זו. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

פרוטוקול זה המותווה באיור 1, כולל את ניתוקה של gDNA, מערכת העיכול עם אנזימי הגבלה ביכולת quantitate מספר ribonucleotides, טיפול עם אלקליות כדי hydrolyze הקשרים phosphodiester של ribonucleotides שולבו gDNA, זרחון קצות 5´-אוו, ssDNA מצדו של מתאמי, סינתזת גדיל השני ו- PCR הגברה לפני רצף.
 1. מתאמי, אינדקס תחל <ol><li>תחל אינדקס להשיג ARC49, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, מתאם, ARC78-ARC107 (ראה טבלה 1). 
	הערה: Oligonucleotides צריך להיות HPLC מטוהרים. ARC76/77 מסודרות כמו דופלקס.</li>
	<li>להכין 100 מיקרומטר פתרונות מניות של כל oligonucleotide במאגר טריס-EDTA (TE) (ראה את הטבלה של חומרים) ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להכין 10 מיקרומטר פתרונות של ARC67/77 ו- 2 מיקרומטר פתרונות של תחל ARC49 ואינדקס על ידי דילול במאגר • תנאי (EB; ראה הטבלה של חומרים). חנות ב-20 ° C</li>
</ol> 2. וצמיחה של הקציר של תאים <ol><li>הלה לגדל תאים ב- 70 מ ל Dulbecco &#39; s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית בבקבוקון טווה 250 מ ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לספור את מספר התאים, לאסוף 5 x 10 תאים 6 בשפופרת 50-mL, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 גרם x, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לרחוץ את התאים עם 20 מ ל 1 x PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 גרם x, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להקפיא את כדורי ב-20 ° C או להמשיך בטהרה דנ א.</li>
</ol> 3. כימות והערכה טיהור DNA <ol><li>לטהר gDNA באמצעות פנול-כלורופורם החילוץ, כפי שמתואר להלן.
	<ol><li>Resuspend התאים במאגר פירוק 2 מ"ל (ראה את הטבלה של חומרים) דגירה למשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס על בלוק חימום. 
		התראה: פירוק המאגר מכיל מרכיבים מסוכנים. פתרון מרחביות. הוא מרגיז, Proteinase K sensitizing, מעצבן, רעיל. ללבוש כפפות וביגוד מגן.</li>
		<li>פיצול הדגימה שני צינורות 2 מ"ל ולהוסיף 1 נפח (V) של אלכוהול פנול-כלורופורם-isoamyl (25:24:1). 
		זהירות: אלכוהול פנול-כלורופורם-isoamyl היא רעילה, מוטגן, מאכל ו מסוכנים לסביבות הימית. להשתמש בברדס fume ללבוש כפפות וביגוד מגן, למחוק ב פסולת פנול מיוחד-כלורופורם.</li>
		<li>מיקס על ידי היפוך עבור 30-60 s צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 15,000 x g בטמפרטורת החדר. 
		הערה: האם לא מערבולת DNA כדי למנוע הצגת מעברי סטרנד אקראיים, אשר לעוות את התוצאות.</li>
		<li>להעביר את השלב העליון, מימית צינור 2 מ"ל ולהוסיף 1 V של אלכוהול פנול-כלורופורם-isoamyl (25:24:1).</li>
		<li>מיקס על ידי היפוך צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 15,000 g x-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>להעביר את השלב העליון, מימית mL 2 חדש צינור ולהוסיף 20 µL NaCl (5 מ') ו- 1 V של אלכוהול איזופרופיל קר. 
		התראה: אלכוהול איזופרופיל הוא דליק, מעצבן, רעיל. אחסן אותו בארון מאוורר ללבוש כפפות וביגוד מגן, להרחיקו להבות.</li>
		<li>מיקס על ידי היפוך דגירה במשך לפחות שעה ב-20 מעלות צלזיוס</li>
		<li>צנטריפוגה כעשרים דקות בכ-15,000 x g, 4 ° C ותגובת שיקוע להשליך.</li>
		צנטריפוגה כעשרים דקות ב g x 15,000 ב 4 ° C <li>צנפה DNA לשטוף עם 200 µL קר 70% אתנול, ולמחוק תגובת שיקוע. 
		התראה: 70% אתנול הוא דליק, מעצבן. לשמור על הפתרון עובד ב-20 ° C, חנות אחרת ארון מאוורר, ללבוש בגדים מגן, כפפות, ולשמור אותה הרחק להבות.</li>
		<li>יבש בגדר DNA בטמפרטורת החדר במשך 20-25 דק...</li>
		<li>כדורי DNA להמיס 100 טה µL מאגר, בריכה הדגימות צינור אחד.</li>
	</ol></li> <li>Quantitate DNA ריכוז באמצעות תגובה כימית כימות dsDNA על פי יצרן &#39; s מפרטים (ראה את הטבלה של חומרים). 
	הערה: השתמש ריאגנט כימות dsDNA, כי spectrophotometric כימות ה-DNA עשויה להיות מושפעת פנול שיורית.</li>
	<li>מאגר DNA ב-20 ° C או להמשיך בטיפול HincII.</li>
</ol> 4. הידרוליזה אלקליין וטיפול HincII <ol><li>µg 1 תקציר של ה-DNA בתגובה תערובת המכילה 5 µL 10 x מאגר 3.1, µL 1 (10 U) HincII, ו- H נטולת נוקלאז 2 O לאמצעי הסופי של 50 µL- 
	הערה: כדי להשיג תנאים אופטימליים מצדו, סינתזת גדיל השני ו- PCR-הגברה, ייתכן צורך להגדיל את כמות ה-DNA קלט אם הוא צפוי כי ה-DNA מכיל מספר נמוך מאוד של ribonucleotides. באופן דומה, ייתכן צורך להקטין DNA קלט אם מספר ribonucleotides הוא גבוה מאוד.</li>
	<li>תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>HincII לטהר שטופלו DNA חרוזים פאראמגנטיים. 
	הערה: לשמור את הצינור המכסים פתח ב השלבים הבאים כדי לא להפריע כדורי על-ידי פתיחת הצינורות.
	<ol><li>להוסיף V 1.8 של פאראמגנטיים חרוזים לכל אחד לטעום, לערבב היטב על ידי pipetting, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות</li>
		<li>השתמש מתלה מגנטי כדי הצניפה החרוזים במשך 5 דקות, ואז להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף את גלולה עם 150 µL של 70% אתנול (טמפרטורת החדר) במשך כ- 30 s ולאחר מכן הסר ו להשליך תגובת שיקוע.</li>
		<li>שטיפת בגדר עם 200 µL של 70% אתנול (טמפרטורת החדר) כ 30 s ואז להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. 
		הערה: ניתן להסיר שאריות אתנול עם פיפטה 10 µL. טיפות יכול להיות טוו למטה בקצרה מראש.</li>
		<li>יבש הדגימות בטמפרטורת החדר במשך כ- 15-20 דקות 
		הערה: הזמן המדויק תלוי בכמויות החרוזים ואת צורת בגדר, לכן כדורי יש לבדוק חזותית.</li>
		<li>להסיר צינורות מהמדף מגנטי, elute צנפה ב 45 µL EB, מיקס על ידי pipetting בזהירות.</li>
		<li>דגירה במשך 5 דקות ואז הצניפה החרוזים על מתלה מגנטי ולהשתמש µL 45 של DNA מטוהרים בשלב 4.4.</li>
	</ol></li> <li>µL 5 להוסיף קו (3 מ') או אשלגן כלורי (3 מ') ל- DNA יצירת הנפח הכולל של 50 µL- 
	התראה: פתרון ז קו 3 הוא מאכל. ללבוש כפפות וביגוד מגן.</li>
	<li>Incubate עבור 2 h ב 55 ° C בהכלאה תנור ואחריו 5 דקות על קרח 
	הערה: מומלץ לבצע את הטיפול KOH תנור במקום בלוק חימום כדי לשמור על חימום אחיד של הצינור וכדי למנוע עיבוי על המכסה.</li>
	<li>לזרז את הדנ א על-ידי הוספת 10 µL סודיום אצטט (3 מ', pH = 5.2) ו- 125 µL קר 100% אתנול. דגירה על קרח במשך 5 דק 
	התראה: 100% אתנול הוא דליק, מעצבן. לאחסן בארון מאוורר, ללבוש כפפות וביגוד מגן ולשמור מן הלהבות.</li>
	<li>גלולה gDNA על ידי צריך שתוציאו ב 21,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>DNA שטיפת גלולה עם 250 µL קר 70% צנטריפוגה ב 21,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, EtOH, ולמחוק את תגובת שיקוע. 
	הערה: כדי להסיר טיפות, הצינור יכול להיות טוו למטה בקצרה שוב ואת תגובת שיקוע ניתן להסיר עם פיפטה 10 µl.</li>
	<li>תן בגדר יבש צינור פתוח למשך כ- 5-10 דקות עד כל נוזל גלוי התאדו.</li>
	<li>DNA תן התמוססות גלולה ב 20 µL EB במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol> 5. 5´ סוף זרחון <ol><li>להכין את תערובת התגובה עבור כל דגימה מראש אסיריםisting של 2.5 µL 10 x polynucleotide קינאז התגובה מאגר T4, µL (10 U) 1 3´-פוספטאז-חיסור T4 polynucleotide קינאז, µL 2.5 ATP (10 מ מ)-</li>
	<li>µL 19 העברה של כל ה-DNA לטעום לתוך צינור 200 µL ו denature למשך 3 דקות ב 85 מעלות צלזיוס ב התרמו-הצנטרפוגה.</li>
	<li>הדי מגניב דוגמאות על קרח ולהוסיף 6 µL של התגובה לערבב כל דגימה.</li>
	<li>התגובה Incubate מתערבב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולהפסיק התגובה על ידי המקננת הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דק.</li>
	<li>לטהר דנ א כמו שמתואר 4.3, באמצעות 1.8 V של חרוזים פאראמגנטיים אבל elute ב- 14 µL EB-</li>
</ol> 6. ssDNA מצדו <ol><li>להכין את תערובת התגובה עבור כל דגימה מראש בהיקף של 0.5 µL ATP (2 מ מ), µL 5 10 x T4 RNA ליגאז התגובה מאגר, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 מ מ), 0.5 µL ARC140 (100 מיקרומטר), ו- 25 µL 50% 8000 פג. לערבב היטב על ידי pipetting. 
	התראה: CoCl 3 (NH 3) 6 הוא מסרטנים, sensitizing ומסוכנים לסביבה הימית. ללבוש כפפות וביגוד מגן.</li>
	<li>µL 13 העברה של DNA מטוהרים צעד 5.5 צינור 200 µL ו denature למשך 3 דקות ב 85 מעלות צלזיוס ב התרמו-הצנטרפוגה.</li>
	<li>מגניב הדנ א על קרח, להוסיף µL 36 של תערובת התגובה אחד לטעום, לערבב על ידי pipetting ואת ספין למטה בקצרה.</li>
	<li>µL להוסיף 1 (10 U) של T4 רנ א ליגאז על כל תגובה, לערבב על ידי pipetting, ספין למטה בקצרה.</li>
	<li>דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר ב הלילה האפל.</li>
</ol> 7. השני-strand סינתזה <ol><li>Purify מאתרים DNA כמתואר ב- 4.3, אבל להשתמש 0.8 V של חרוזים פאראמגנטיים, גלולה החרוזים 10 דקות ו elute ב- 20 µL EB- 
	הערה: בשל צמיגות גבוה יותר של המיקס התגובה מצדו, הצעד הראשון pelleting מוארך.</li>
	µL <li>20 העברה של דנ א כדי צינור PCR 200 µL. חזור על השלב טיהור באמצעות 0.8 V של חרוזים פאראמגנטיים בעקבות היצרן &#39; s מפרטים ו elute ב- 14 µL EB-</li>
	<li>להכין את תערובת התגובה עבור כל דגימה מראש בהיקף של 2 µL 10 x T7 DNA פולימראז התגובה מאגר, 2 µL ARC76/77 (2 מיקרומטר), µL 2 dNTPs (2 מ מ), ואת µL 0.8 BSA (1 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>µL 12.8 להעביר מטוהרים דנ א כדי צינור 200 µL, denature למשך 3 דקות ב 85 מעלות צלזיוס ב התרמו-הצנטרפוגה.</li>
	<li>מגניב הדנ א על קרח ולהוסיף 6.8 µL של התגובה מיקס אחד לטעום, לערבב על ידי pipetting, ספין למטה לזמן קצר ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להוסיף 0.4 µL (4 U) T7 DNA פולימראז כל תגובה, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לטהר דנ א כמו שמתואר 4.3, באמצעות 0.8 V של חרוזים פאראמגנטיים ו elute ב- 11 µL EB-</li>
</ol> 8. PCR-הגברה, כימות ספריית <ol><li>להכין תערובת התגובה עבור כל דגימה ב 200 חדש µL צינור המורכב מראש 7.5 µL ARC49 (2 מיקרומטר), µL 7.5 מדד פריימר (2 מיקרומטר, ייחודי עבור כל דגימה) ולאחר 25 µL 2 x התחלה לוהטת מוכן לערבב.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של דנ א כדי כל תגובה. להגביר את הספרייה באמצעות התנאים הבאים: denature ב 95 מעלות צלזיוס במשך 45 s, ואחריו 18 מחזורים של 98 ° C 15 s, 65 ° C ל 30 s, 72 ° C ל 30 s, המסתיימים התארכות הסופי ב-72 מעלות לדוגמאות להחזיק 2 דק ב 4 ° ג לאחר הגברה.</li>
	<li>לטהר ספריות כמתואר ב- 4.3, באמצעות 0.8 V פאראמגנטיים חרוזים, ו elute במאגר טה µL 20-</li>
	<li>Quantitate ספריות באמצעות ריאגנט כימות dsDNA, על פי היצרן &#39; s מפרטים (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
	<li>לאחסן דגימות ב-20 ° C או להמשיך עם ניתוח הספרייה.</li>
</ol> 9. ספריית ניתוח ו- Pooling <ol><li>לקבוע את האיכות של כל ספריה, להעריך את הגודל הממוצע פרגמנט באמצעות מערכת אלקטרופורזה דיגיטלי. 
	הערה: גודל המקטע הממוצע הוא מוערך על ידי הערכת היכן האזור מתחת העקומה של electropherogram זה חצוי, התעלמות פסגות של סמנים. התוצאות נציג של ספריית מתאימים פרופילים לאחר טיפול קו או אשלגן כלורי מקבלים איור 2 א.</li>
	<li>לחשב את הריכוז (ננומטר) של הספריות כמו: 
	/(p*650) (c/10 3)] * 10 9 איפה c הוא הריכוז של הספרייה ב- ng/µL ו- p מייצג גודל המקטע הממוצע ב- bp, כמו 9.1 מוערך ב-</li>
	<li>בריכה שווה טוחנת כמויות של ספריות עד 24 מוגבר עם צבעי יסוד שונים אינדקס רצף. טה מאגר להוסיף נפח סופי של 25 µL וריכוז של 10 ננומטר. 
	הערה: בהתאם למספר ספריות כדי להיות איחדו, כמות ה-DNA של כל ספריה מותאמת. אם אותרו הדימרים פריימר בשלב 9.1 בתור ברורים לשיא של-130 bp, הנפח הסופי של הבריכה הספרייה יכולים לחרוג 25 µL, כי הצעד טיהור הוא חזר כמתואר ב- 4.3, באמצעות 0.8 V פאראמגנטיים חרוזים, הדנ א הוא eluted ב 25 µL TE buf fer.
	<ol><li>לקבוע ריכוז בריכת ספריה חדשה באמצעות תגובה כימית כימות dsDNA לפי יצרן &#39; s מפרטים לבין הממוצע לשיא הגודל כמתואר לעיל. להמשיך רצף וניתוח נתונים (סעיפים 10 ו-11).</li>
	</ol></li></ol> 10. קביעת רצף <ol><li>לבצע 75-בסיס לזווג-קצה הרצף על ספריות במאגר 12.</li></ol>
 11. ניתוח נתונים <ol><li>חיתוך כל קורא כדי להסיר את המתאם רצפים, סינון עבור איכות ולקרוא אורך. 
	הערה: ניתן לבצע זאת באמצעות cutadapt 1.2.1 20 באמצעות הפקודה ' cutadapt -f fastq - התאמה-קריאה-תווים כלליים - שקט -מ' 15 - q 10, אבנר כהן &#60; קובץ &#62;', איפה אבנר כהן מוחלף הרצף מתאם בפועל, &#60; קובץ &#62; הוא החליף את שם הקובץ fastq.</li>
	<li>להסיר חברים הקריאות שנזרקו בשלב הקודם באמצעות קבצי script מותאמים אישית.</li>
	<li>ליישר 1 חבר של הנותרים זוגות לאינדקס המכיל את רצף כל oligonucleotides בהכנת ספריה (למשל, באמצעות עניבת הפרפר 0.12.8 21 ושורת הפקודה אפשרויות - m1-v2). למחוק את כל זוגות עם יישורים מוצלח.</li>
	<li>ליישר זוגות הנותרים הגנום הפניה האורגניזם באמצעות עניבת הפרפר עם שורת הפקודה אפשרויות - v2 -X הטוב 10000....</li>
	<li>מפה קורא את טווח בין מולקולה מיטוכונדריאלי ההתחלה והסוף על ידי יישור 1 חבר של כל זוגות unaligned (באמצעות עניבת הפרפר עם שורת הפקודה אפשרויות - v2).</li>
	<li>לקבוע הרוזן 5´-מסתיימת כל סוף יחיד ומשויכים במערכים. משמרת את המיקום של אלה עד לבסיס אחד במעלה הנהר עד למיקום שבו היו ribonucleotides הידרוליזה.</li>
	<li>יצא נתונים מהקובץ עניבת הפרפר תבנית לתבנית קובץ bedgraph באמצעות קבצי script מותאמים אישית עבור ויזואליזציה במשותף הגנום דפדפנים. לנרמל את הקריאות על גדיל אחד כדי קריאות לכל מיליון.</li>
	<li>באמצעות את המיקום ואת ספירות מהקובץ bedgraph, להפנות את רצף הגנום של האורגניזם כדי לקבוע את זהותו של incorporated ribonucleotides. 
	הערה: עבור גנום מיטוכונדריאלי האדם קורא מתוך האזורים 16,200-300 ו 5,747-5,847 על גדיל אחד לא להיות כלולים מאז אזורים אלה מכילים הרבה 5´-הפנויות שאינן קשורות ההתאגדות ribonucleotide על ידי ה-DNA פולימראז γ-</li>
	<li>לחלק את סכום קוראת, לא כולל קריאות באתרים HincII 11, עם המספר הממוצע של קורא לכל אתר HincII כדי לקבל את מספר ribonucleotides לכל הפסקה לחוט אחד, (קרי מספר ribonucleotides לכל מולקולה מיטוכונדריאלי).</li>
</ol>

<ol><li>Traut, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Concentrations+of+Purines+and+Pyrimidines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines.</a> Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).</li>
<li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).</li>
<li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).</li>
<li>Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotide+incorporation%2C+proofreading+and+bypass+by+human+DNA+polymerase+delta%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta.</a> DNA Repair. 12, 121-127 (2013).</li>
<li>Potenski, C. J., Klein, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+misincorporation+of+ribonucleotides+into+genomic+DNA+can+be+both+harmful+and+helpful+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 10226(2014).</li>
<li>Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase-sensitive+DNA+modification%28s%29+initiates+S.+pombe+mating-type+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Dev%22%5BJournal%5D)">RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching.</a> Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).</li>
<li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+Are+Signals+for+Mismatch+Repair+of+Leading-Strand+Replication+Errors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors.</a> Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).</li>
<li>Ghodgaonkar, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+Misincorporated+into+DNA+Act+as+Strand-Discrimination+Signals+in+Eukaryotic+Mismatch+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair.</a> Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).</li>
<li>DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+Structure+of+the+Dickerson+DNA+Dodecamer+Containing+a+Single+Ribonucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide.</a> Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).</li>
<li>Li, Y. F., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja990592p">Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).</li>
<li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).</li>
<li>Berglund, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+pools+dictate+the+identity+and+frequency+of+ribonucleotide+incorporation+in+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA.</a> Plos Genet. 13, (2017).</li>
<li>Brown, J. A., Suo, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Sugar+%22Steric+Gate%22+of+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases.</a> Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+H2-Initiated+Ribonucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair.</a> Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).</li>
<li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Major+Roles+of+DNA+Polymerases+Epsilon+and+Delta+at+the+Eukaryotic+Replication+Fork+Are+Evolutionarily+Conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genet%22%5BJournal%5D)">The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved.</a> Plos Genet. 7, (2011).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat. Methods. 12, 251(2015).</li>
<li>Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ribonucleotides+in+genomic+DNA+and+exploring+replication+dynamics+by+polymerase+usage+sequencing+%28Pu-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq).</a> Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).</li>
<li>Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+embedded+ribonucleotides+and+other+noncanonical+nucleotides+using+emRiboSeq+and+EndoSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq.</a> Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאן אנו מציגים טכניקה כדי בו-זמנית למפות לכמת ribonucleotides gDNA, ואת mtDNA בפרט, על ידי המבוא פשוטה של ביקוע DNA באתרים ספציפיים רצף הגנום תוספת פרוטוקול ה-היידן-seq הוקמה. בעוד המחקר מתמקד mtDNA אנושי, השיטה היידן-seq פותחה במקור ב שמר האפייה, הממחישות התרגום של השיטה אורגניזמים אחרים,12,16.
עבור תוצאות אמינות המתקבל גישה זו, ראוי לציין כמה צעדים קריטיים: (א) מאז רצף מתאמי מאתרים ומפסיקים את כל הקצוות 5´ זמין, חשוב לעבוד עם ה-DNA מאוד ללא פגע. DNA הנשאים ספריות צריכה להיעשות רצוי מיד לאחר בידוד ה-DNA, או ה-DNA שניתן לאחסן ב-20 ° C. לא מומלץ לאחסן DNA במקרר במשך זמן רב או כדי שוב ושוב הקפאה והפשרה של זה. (ב) כדי ליצור ספריות מתאים בשיטה זו, חשוב לבצע את הטיפול קו ה-dna תנור דגירה, במקום בלוק חימום, שמבטיח חימום הומוגנית של כל דגימה, הידרוליזה כמותית. (ג) יתר על כן, חיוני כדי לקבוע את האיכות של ספריות לפני באגירת ורצף. הדנ א צריך ניתן לכמת, נותחה באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית כדי להבטיח כמות מספקת של ספריית ה-DNA, לאשר בגדלים המתאימים פרגמנט ובדוק הדימרים פריימר.
עבור ניתוח נתונים משמעותיים, חשוב גם לציין כי ערך אינפורמטיבי של שיטה זו הוא תלוי הפקדים המתאימים כדי להעריך ספירות הרקע והנטיות רצף או strand. אנחנו באופן שגרתי להשיג יעילות מיפוי של אשלגן כלורי דוגמאות קרוב 70% כאשר עיכול רק עם רצף ספציפי endonuclease (איור 2B, לוחות שמאלה). בנוסף, חשוב לוודא כי הטיפול endonuclease אינו משפיע הכולל זיהוי של ribonucleotides incorporated על-ידי השוואת HincII ובא לא מטופל דגימות (איור 3B). בניסויים אלה, השתמשנו HincII להציג את האתר הספציפי חתכים, למרות אנזימי הגבלה אחרים באיכות גבוהה יכול לשמש גם.
הפרוטוקול יכול להיות מותאם ללמוד סוגים אחרים של נגעים DNA זה יעובד 5´-פוספט או 5´-הו מסתיים. הדיוק של התוצאות תלוי יחודיות של עיבוד ודורש הפקדים המתאימים (למשל, פראי סוג או לא מטופל) לצורך אימות. יתר על כן, כאשר התאמת שיטה זו יישומים אחרים או לשימוש עם אורגניזמים אחרים, שצריך לשקול כי שיטת ההתקנה הנוכחית שלה דורש כ 1 µg של ה-DNA אשר מעובד בספריה. מאז מספר הקצוות של תלויה מספר ribonucleotides מוטבע, אשר משתנה בהתאם האורגניזם או מוטציה, דגימות כולל מספר נמוך יותר של ribonucleotides ידרוש יותר קלט דנ א כדי להפיק מספר מספיק של מסתיים ב ספריה הבאים בנייה. באופן דומה, אם דגימות די אן איי יש מספר גבוה יותר של ribonucleotides, זה גם ידרוש באמצעות DNA פחות קלט כדי להשיג תנאים אופטימליים מצדו השני סינתזת גדיל, הגברה PCR. ראוי לציין כי בניית ספריה כפי שמתואר פרוטוקול זה נוצר גם נתונים המכסים את הגנום הגרעיני (כפי שהוא מוצג ביישום איור דו-ממדי), רק ניתוח הנתונים היה ממוקד mtDNA. זה ממחיש כי הגנום גדול עם תדרים נמוכים למדי ribonucleotide גם בשבי על ידי שיטה זו.
כאשר בוחנים שיטה זו, מגבלות מסוימות צריכים להילקח בחשבון: אף על פי שיטה זו, תיאורטית, יהיה החלים כמעט כל אורגניזם, גנום התייחסות מתאימה יש צורך היישור של קריאות. יתר על כן, התוצאות המתקבלות מן הפרוטוקול שלנו לייצג את הקריאות בין מספר גדול של תאים. אין אפשרות לזהות דפוסי התאגדות ribonucleotide ספציפיים של קבוצת משנה של תאים על-ידי גישה זו. אם ribonucleotides ממופים ב הגנום גדולות יותר עם מספר נמוך מאוד של ribonucleotides, זה יכול להיות מאתגר להפלות ribonucleotides של ניקס אקראי, הפקדים המתאימים לכן נחוצים.
השיטה נתאר כאן, מרחיב את הטכניקות הזמינות ויוו כגון היידן-Seq16, ריבוז-Seq17, Pu-Seq18או emRiboSeq19. גישות אלה מנצלים הרגישות של ribonucleotides מוטבע אלקליין או טיפול RNase H2, בהתאמה, העסקת הדור הבא רצפי לזהות ribonucleotides הגנום כולו, אשר מאפשר מיפוי שלהם, השוואת יחסי שיתוף. על ידי ביקוע רצף הדנ א במיוחד, כפי שתוארה לעיל, בנוסף הידרוליזה אלקליין ב ribonucleotides מוטבע, הקריאות עבור ribonucleotides יכול להיות מנורמל לאתרים האלה המחשוף, ומאפשר לא רק הזיהוי ומיפוי ribonucleotides, אבל גם שלהם כימות עבור כל מולקולה DNA. היישום של הטכניקה שלנו בהקשר של מחלות הקשורות שכפול ה-DNA, תיקון ה-DNA, ו- TLS יכול לספק הבנה עמוקה יותר של התפקיד של ribonucleotides ב בבסיס המנגנונים המולקולריים ותקינות הגנום באופן כללי.

בתא האיקריוטים, הריכוז של ribonucleotides (rNTPs) הוא גבוה בהרבה מאשר ריכוז deoxyribonucleotides (dNTPs)1. DNA polymerases להפלות ribonucleotides, אבל האפליה אינו מושלם, כתוצאה מכך, ribonucleotides במקום deoxyribonucleotides יכול לשלב הגנום במהלך שכפול ה-DNA. Ribonucleotides עשוי להיות נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו את הגנום2. רוב ribonucleotides אלה יוסרו במהלך ההבשלה מקטע אוקאזקי RNase H2 ribonucleotide יזם כריתה תיקון (RER) או על ידי טופואיזומראז 1 (נבדקה הפניה3). Ribonucleotides שלא ניתן להסיר להישאר stably ועצוב ה DNA2,4 , עשוי להשפיע על זה בדרכים מזיקות וגם מועיל (נבדקה שנסקרה5). מלבד היכולת לשמש אותות חיובי, לדוגמה ב ההזדווגות סוג מחליף שמר הביקוע 6 , מסמן את הד המתהווה במהלך התאמה לתקן (MMR)7,8, ribonucleotides להשפיע מבנה9 ויציבות ב dna שמסביב עקב קבוצת 2´-הידרוקסיל שלהם ריבוז10, וכתוצאה מכך replicative מתח, הגנום יציבות11. השפע של ribonucleotides ב- DNA גנומי (gDNA) והרלוונטיות שלהם שכפול מנגנוני תיקון, כמו גם ההשלכות על יציבות הגנום, תן סיבה לחקור התרחשות מדויקת והתדירות שלהם באופן הגנום כולו.
RNase H2 פעילות לא נמצא בתוך המיטוכונדריה אנושי, ribonucleotides לכן יוסרו לא יעיל ב- DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA). כמה מסלולים מעורבים את האספקה של נוקלאוטידים כדי המיטוכונדריה אנושי, כדי לבדוק הפרעות בבריכה נוקלאוטיד מיטוכונדריאלי לגרום מספר גבוה של ribonucleotides ב mtDNA אנושי, פיתחנו פרוטוקול כדי למפות quantitate אלה ribonucleotides ב mtDNA האנושי מבודד fibroblasts תאים הלה, התא החולה קווים12.
רוב במבחנה גישות (נבדקה שנסקרה13) כדי לקבוע סלקטיביות של ה-DNA polymerases נגד rNTPs מבוססים על ribonucleotide יחיד ההכנסה או פריימר ניסויים סיומת שבו מתחרים rNTPs הינם כלולים התגובה מערבבים, המאפשר זיהוי או כימות יחסי התאגדות ribonucleotide בתבניות הדי קצר. גישות כמותיים על רצפים קצרים עשוי לא לשקף dNTP בריכות rNTP בריכוזים הסלולר, ולכן מספקים תובנה פולימראז סלקטיביות אבל משמעות מוגבלת בנוגע הגנום כולו. הוכח, כי הכמות היחסית של ribonucleotides שולבו במהלך השכפול של תבנית ה-DNA ארוך יותר, כגון פלסמיד, ניתן לאבחן על ג'ל רצף באמצעות radiolabeled dNTPs ו hydrolyzing ה-DNA חצרו אלקליין14. יתר על כן, gDNA נותחה על שהכלים בדרום בעקבות הידרוליזה אלקליין, ומאפשר סטרנד חיטוט וספציפיים קביעת תעריפים מוחלטת של התאגדות ויווribonucleotide15. גישות אלה לאפשר השוואה יחסית של התאגדות תדירות אך לספק שום תובנות המיקום או זהות ribonucleotides incorporated. גישות עדכניות יותר כדי לנתח את התוכן ribonucleotide gDNA ויוו, כמו היידן-Seq16, ריבוז-Seq17, Pu-Seq18או emRiboSeq19, נצל את היתרון של ribonucleotides' מוטבע רגישות אלקליין או טיפול RNase H2, בהתאמה, ולהעסיק את הדור הבא רצפי לזהות ribonucleotides הגנום כולו. שיטות אלה אינם מספקים תובנה תדירות ההתאגדות המוחלט ribonucleotides שזוהו. באמצעות הוספת השלב של פצילות אנזימטי ספציפי רצף פרוטוקול היידן-seq, השיטה שנתאר כאן בנוחות מרחיב את המידע שנצבר בגישה רצף, ומאפשר מיפוי בו זמנית, כימות של מוטבע ribonucleotides12. שיטה זו ישימה לאורגניזם כמעט כל נתון כי ניתן להפיק תמציות DNA מאוד ללא פגע, גנום התייחסות מתאימה הינו זמין. השיטה יכול להיות מותאם quantitate, לקבוע את המיקום של כל הנגע יכול להיות מתעכל על ידי נוקלאז ולא יוצאת 5´-פוספט או קצה 5´-הו.
כדי למפות quantitate ribonucleotides ב- DNA גנומי, השיטה משלבת המחשוף מאת endonuclease ספציפי רצף ומסתיים הידרוליזה אלקליין יצירת 5´-פוספט אתרי שבו ממוקם רצף זיהוי ספציפיות עבור endonuclease ו 5´- הו מסתיים עמדות איפה שהו ribonucleotides. כיוון הפנויות שנוצר כתוצאה מכך מאתרים עם מתאמי וסודרו באמצעות הדור הבא רצפי, יש חשיבות להשתמש DNA ללא פגע מאוד ולמנוע פיצול אקראי במהלך הכנת מיצוי וספריית הדנ א. הערכת אלה קריאות מנורמל ל הקריאות באתרים המחשוף endonuclease מאפשר כימות סימולטני של מיפוי של ribonucleotides זיהה. 5´ חינם-קצוות זוהו בניסויים שליטה בו אלקליין הידרוליזה של ה-DNA מוחלף על ידי טיפול עם אשלגן כלורי. הנתונים שהושגו לספק תובנות ribonucleotide מיקום וכמות ומאפשר ניתוח לגבי תוכן ribonucleotide ותדירות ההתאגדות.

<table><tbody><tr><td>10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216L</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>ממיסים טבליה אחת ב-H2O לנפח סופי של 1 ליטר</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP, 10 מ"מ)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>P0756S</td><td>לדלל עם EB עד 2 מ"מ</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 ערכת</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>BSA, דרגת ביולוגיה מולקולרית (20 מ"ג/מ"ל)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>דילטו עם H2O נטול נוקלאז עד 1 מ"ג/מ</td></tr><tr><td>"ל מאגר EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td>המכונה</td></tr><tr><td>חרוזים פרמגנטיים EB CleanPCR</td> תערובת תמיסות <td>CleanNA</td><td>CPCR-0050</td><td></td></tr><tr><td>דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) (10 מ"מ כל אחד)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>לדלל עם EB עד 2 מ"מ</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 96 Side</td><td>Thermo Fisher</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 99.5% בדרגה אנליטית</td><td>Solveco</td><td>1395</td><td>לדלל עם מים milliQ ל-70%</td></tr> <tr><td>תמיסת חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA, 0.5 מ')</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer pH 8.0 (1 M) סטרילי BC</td><td>AppliChem</td><td>A6906,0125</td><td></td></tr><tr><td>Hexammine cobalt(III) כלוריד (CoCl3(NH3)6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7891-5G</td><td>מתמוסס ב-H2O נטול נוקלאז למשך 10&nbsp; תמיסת M, פילטר סטרילי. זהירות: מסרטן, רגיש ומסוכן לסביבה מימית.</td></tr><tr><td>HincII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0103S</td><td>מסופק עם NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>Hybridiser HB-1D</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td> <td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> ליזה <td>50 מ"מ EDTA, 20 מ"מ HEPES, NaCl 75 מ"מ, פרוטאינאז K (200 ומיקרו; גרם/מ"ל), 1% SDS</td></tr><tr><td>מיקרו שפופרת 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה MiniStar סילברליין</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>כפל&nbsp; ומיקרו; StripPro 0.2 מ"ל צינור</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.992</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>אמביון</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>פנול &ndash; כלורופורם &ndash; אלכוהול איזואמיל (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>VWR</td><td>26764.232</td><td>מתמוסס ב-H2O ללא נוקלאז למשך 3&nbsp; תמיסת M, מסנן סטרילי</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>VWR</td><td>26668.296</td><td>מתמוסס ב-H2O נטול נוקלאז למשך 3&nbsp; תמיסת M, מסנן סטרילי</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>זהירות: מכיל רכיבים דליקים ורעילים</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>זהירות: מכיל רכיבים דליקים ורעילים</td></tr><tr><td>צנטריפוגות מעבדה בקירור 4K15</td><td>Sigma</td> מס' <td>10740</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת SDS, תמיסת חיץ נתרן אצטט 10%</td> <td>Invitrogen</td><td>15553-035,</td><td></td></tr><tr><td>pH 5.2, 3 M (NaAc)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>VWR</td><td>27810.295</td><td>להתמוסס ב-H2O נטול נוקלאז למשך 5&nbsp; תמיסת M, מסנן סטרילי</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase (3' פוספטאז מינוס)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0236L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>מסופק עם PEG 8000 (50%)</td></tr><tr><td>T7 DNA פולימראז (לא שונה)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td>מסופק עם 10x T7 DNA Polymerase Reaction</td></tr><tr><td>Buffer TE</td><td>Invitrogen</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F2.0</td><td>Eppendorf</td><td>5387000013</td><td></td></tr></tbody></table>

מיפוי בו זמנית, כימות של ribonucleotides ב- dna מיטוכונדריאלי אנושי

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

גישות הוקמה כדי להעריך את מספר ribonucleotides נוכח גנום מוגבלות כימות של ribonucleotides incorporated שימוש קצר שברי DNA סינטטיים או פלסמידים כתבניות והשערות ואז התוצאות לכל הגנום. לחלופין, מספר ribonucleotides נוכח גנום עשוי להיות מוערך באמצעות ג'ל אלקליין או שהכלים הדרומי. גישות ויוו עדכנית יותר מעסיקים הדור הבא רצפי ומאפשר מיפוי הגנום כולו של ribonucleotides, מספק את המיקום ואת זהותו של ribonucleotides מוטבע. עם זאת, הם אינם מאפשרים כימות של מספר ribonucleotides אשר משולבים לתוך הגנום. כאן נתאר כיצד למפות בו זמנית, quantitate מספר ribonucleotides אשר משולבים האנושי מיטוכונדריאלי DNA ויוו מאת הדור הבא רצפי. עלינו להשתמש DNA מאוד ללא פגע, להציג רצף ספציפי גדיל כפול מעברי מאת לעכל את זה עם endonuclease, לאחר מכן hydrolyzing ribonucleotides incorporated עם אלקלי. הקצוות שנוצר מאתרים עם מתאמי, הקצוות האלה הם וסודרו על מכונת רצף הדור הבא. ניתן לחשב את המספר המוחלט של ribonucleotides כמספר הקריאות באתר זיהוי לפי המספר הממוצע של קריאות באתר זיהוי עבור endonuclease ספציפית הרצף. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מנוצל כדי למפות quantitate ניקס חינם ב- DNA ומאפשר התאקלמות למיפוי נגעים אחרים-DNA זה ניתן לעבד 5´-הו מסתיים או מסתיים 5´-פוספט. יתר על כן, שיטה זו ניתן ליישם כל אורגניזם, בהתחשב בכך גנום התייחסות מתאימה זמין. פרוטוקול זה ולכן מספק כלי חשוב ללמוד שכפול ה-DNA, עיבוד 5´-end, נזק לדנ א ו- DNA לתקן.

הממחישות את המתודולוגיה תוארו לעיל, נציג נתונים נוצרו ניתוח דנ א מיטוכונדריאלי האנושי של הלה תאים12. איור 2B מציג קריאות מסוכמים בכלל HincII אתרים כבדים (HS), אור גדיל (LS) של האדם mtDNA לאחר הטיפול אשלגן כלורי (לוחות שמאלה). בסביבות 70% של כל שזוהו 5´-מסתיים בתרגום כדי לחתוך-האתרים, הממחיש את יעילות גבוהה של עיכול HincII. בטיפול ספריות עם קו כדי hydrolyze את ה-DNA-ribonucleotides מוטבע מקטין את מספר הקריאות של אתרי HincII כ-40% (איור 2B, לוחות נכון). זה צפוי מאז מספר רב של קצוות 5´ נוצרות באתרים התאגדות ribonucleotide, מעידה על איכות הספרייה מספקת. איור 2C ממחיש את לוקליזציה ואת התדירות של 5´ שאינו נגמר (ירוק) לאחר טיפול אשלגן כלורי וקורא שנוצר מאת היידן-seq (מגנטה) לאחר טיפול קו, גילוי 5´ חינם-מסתיים והן הקצוות שנוצרו בשעה ribonucleotides על-ידי הידרוליזה אלקליין. 5´ חינם-קצוות, ribonucleotides ההתאמה לשפות אחרות כדי HS של האדם mtDNA מוצגים בחלונית השמאלית, אלה ההתאמה לשפות אחרות האם מוצגים בחלונית הימנית. המספרים היחסית הקריאות raw ribonucleotides (איור דו-ממדי, החלונית העליונה) או HincII אתרים (החלונית התחתונה) ב- HS ו- LS של mtDNA מציגים, בהתאמה, כיסוי חזק יותר 14-fold או 31-fold של הוא יחסי HS, בעוד דעה קדומה דומה נצפתה לא עבור DNA גרעיני. הנטיה סטרנד הזו עשויה להיות מוסברת על ידי ההבדל מובהק בהרכב בסיס שני הגדילים, ממחיש את החשיבות של נירמול כדי קריאות באתרים HincII.
נרמול לקריאה סופרת כדי HincII נותן מדד כמותי של מספר ribonucleotides לכל גנום מיטוכונדריאלי (איור 3 א). כמופיע ב- 3B איור, קריאות אחרי קו טיפול עבור כל ribonucleotide מנורמל להרכב רצף של גדיל אחד הראה יחס שונה מ- 1, המציין בהתפלגות שאינן אקראיות של קריאות רומז ribonucleotide נפרדים דפוס ואיכות גבוהה הספרייה. יחס זה אינו מושפע על ידי עיכול הקודם עם HincII, אימות המחשוף ירידה לפרטים של האנזים. נרמול הקורא את המקומות של ribonucleotides מוטבע לאלה באתרים פצילות HincII, כמו גם התוכן של נוקלאוטיד של הגנום, יוצרת מידה כמותית של כמה ribonucleotide כל משולבים לכל 1000 בסיסים משלימים ( איור 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
איור 1: סכימטי של ה-DNA עיבוד והכנת ספריית. (1) הדנ א כל הוא ביקע מאת HincII עבור נרמול ב כימות עוקבות של ribonucleotides, יצירת קצוות קהים באתרים HincII (ראש חץ שחור). (2) ה-DNA הוא טיפל עם קו כדי hydrolyze באתרים ribonucleotide, המוביל 2´, 3´-מחזורית פוספט (מחומש אדום)-3´-מסתיים ומסתיים 5´-אוו. (3) 5´-הו הקצוות הן phosphorylated על ידי T4 Polynucleotide קינאז 3´-פוספטאז-מינוס. (4) נגמר 5´ כל נושא קבוצת פוספט מאתרים כדי oligonucleotide ARC140 על ידי T4 RNA ליגאז. (5) יותר סטרנד השני הוא מסונתז באמצעות T7 DNA פולימראז ואת oligonucleotides ARC76-77 המכיל רצף אקראי של6 N. (6) הספרייה מוגבר על ידי אמינות גבוהה DNA פולימראז באמצעות ARC49 ו לאחד ARC78 כדי ARC107 תחל אינדקס המכיל ברקוד ייחודי עבור ריבוב. (7) 5´-הקצוות ממוקמות על ידי רצף לזווג-end. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
איור 2: שיטת אימות. (א) electropherograms נציג שנוצר באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית כדי לקבוע את האיכות שנוצר ספריות שטופלו אות קו או אשלגן-(B) Summarized HincII אתרים כבדים (HS), אור סטרנד (LS) mtDNA אנושי לאחר אשלגן כלורי (לוחות שמאלה) או טיפול קו (לוחות נכון). Circos (ג) איור של 5´ הפנויות (ירוק), היידן-Seq (הפנויות 5´ ו- ribonucleotides, מגנטה) HS (החלונית הימנית), mtDNA האנושי LS (לוח נכון). הפסגות הן מנורמל לכל קורא מיליון, הפסגה מרבי מותאם המספר המרבי של פעולות הקריאה של הספרייה היידן-seq. (ד) Summarized גלם קורא ribonucleotides (לוח העליון), HincII אתרים (החלונית התחתונה) כבד (H), אור (L) גדיל mtDNA אנושי (Mito.) או הפוכה (RV) או (FW) קדמי, תוך הגרעין (Nuc). ה-DNA. B, C ו- D הם ממאמרו של הפניה12. קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
איור 3: תוצאות נציג. (א) היחסית מספר ribonucleotides מנורמל כדי קריאות באתרים HincII עבור ספריות KOH שטופלו על כבד (H) או סטרנד אור (L). (B) היחס בין הזהות ribonucleotide להרכב הגנום mtDNA עבור קו (קו) ובא HincII ביקע עם קו מטופלים (HincII + קו) ספריות כבד (H) או (L) אור, לשריד mtDNA. (ג) Ribonucleotide תדירות מנורמל ל 1000 בסיסים משלימים עבור HincII ו KOH מטופלים ספריות כבד (H) או אור (L) לשריד mtDNA. דמויות מותאמים הפניה12. קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>שם</td>
			<td colspan="4">רצף</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>TCT
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/ 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

טבלה 1: Oligonucleotides. נקובים oligonucleotides המשמש היידן-תת סעיף. הפנים מודגש מציין יצירת אינדקס. * מציין כי איגרת חוב של phosphorothioate. ARC140 מכיל קבוצת אמינו 5´ במקום קבוצת 5´-הו, בשילוב עם מקשר C6. שינוי זה מפחית היווצרות ARC140 concatemers במהלך מצדו.

כאן נתאר שיטה לבצע בו זמנית quantitate ואת ribonucleotides מפה הגנום כולו ב- DNA מאוד שלם ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המשלב המחשוף אנזימטי של דנ א גנומי עם הידרוליזה אלקליין שלה סוף-5´ הבאים . רצף.

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למפות את מיקומם של ריבונוקלאוטידים משולבים ברמת רזולוציית נוקלאוטידים בודדים, ולכמת את מספר הריבונוקלאוטידים הקיימים ב-DNA המיטוכונדריאלי האנושי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לשלמות ה-DNA, מנגנוני שכפול DNA, מנגנוני תיקון DNA וכיצד פגמים בכל אחד מהמנגנונים הללו גורמים למחלות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שניתן לקבוע הן את המיקום והן את מספר הריבונוקלאוטידים המשולבים ב- DNA המיטוכונדריאלי בניסוי יחיד.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תכולת ריבונוקלאוטידים ב-DNA המיטוכונדריאלי האנושי, ניתן ליישם אותה גם לחקר DNA גרעיני ותכולת ריבונוקלאוטידים בגנומים של רצף של אורגניזמים מודל אחרים. DNA גנומי שבודד בעבר מתאי HeLa ותואר בסעיפים 2 ו-3 של פרוטוקול הטקסט משמש בניסוי זה. כדי לעכל את ה- DNA, מערבבים בזהירות את הדברים הבאים בצינור מיקרופוגה.מיקרוגרם אחד של DNA, חמישה מיקרוליטרים של מאגר 10X 3.1, מיקרוליטר אחד של HincII ומים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 50 מיקרוליטר. דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בסיום העיכול, הוסיפו 1.8 נפחים של חרוזים פרמגנטיים לכל דגימה, מעורבבים בזהירות על ידי פיפטינג, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.הנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך חמש דקות כדי לגלול את החרוזים, ולאחר מכן הסר והשליך את הסופרנטנט. שטפו את הגלולה עם 150 מיקרוליטר של אתנול 70% למשך כ-30 שניות, ואז הסירו והשליכו את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עם 200 מיקרוליטר אתנול 70% למשך 30 שניות נוספות.יבש את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך כ- 15 עד 20 דקות. לאחר מכן, הסר את הצינורות מהמתלה המגנטי. יש להוציא כל כדור ב-45 מיקרוליטר של מאגר פליטה, לערבב על ידי פיפטינג בזהירות, ולדגור במשך חמש דקות.גלולה את החרוזים על המדף המגנטי, והעבירו 45 מיקרוליטר מכל דגימת DNA לצינור חדש. לכל 45 מיקרוליטר של DNA מבודד או מטוהר, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של שלושה אשלגן הידרוקסיד מולרי או חמישה מיקרוליטרים של שלושה אשלגן כלורי מולארי, וצרו נפח כולל של 50 מיקרוליטר. שמונה התגובות מסוכמות בטבלה זו.דגרו בתנור הכלאה בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן דגרו את הדגימות על קרח למשך חמש דקות. זרז את ה- DNA על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי ב- pH 5.2, ו -125 מיקרוליטר קר, 100% אתנול ודגירה על קרח למשך חמש דקות. גלולה את ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-21,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.השליכו את הסופרנטנט ושטפו כל כדור דנ"א עם 250 מיקרוליטר של קור, 70% אתנול, צנטריפוגה שוב, והשליכו את הסופרנטנט. הניחו לגלולה להתייבש בצינור הפתוח למשך כחמש עד 10 דקות, עד שכל נוזל גלוי יתאדה. לבסוף, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה, ותן לכדור ה-DNA להתמוסס בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.התחל הליך זה על ידי הכנת תערובת התגובה עבור כל דגימה כתערובת מאסטר. עבור כל דגימה, הוסף 2.5 מיקרוליטר של מאגר תגובת פולינוקלאוטיד קינאז 10x T4, 2.5 מיקרוליטר ATP ומיקרוליטר אחד של שלושה פוספטאז ראשוני מינוס T4 פולינוקלאוטיד קינאז. מעבירים 19 מיקרוליטר מכל דגימת DNA לתוך שפופרת חדשה של 200 מיקרוליטר, ומבצעים דנטורציה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס בתרמו-סייקלר למשך שלוש דקות.לאחר מכן, קררו את דגימות ה-DNA על קרח, והוסיפו שישה מיקרוליטרים מתערובת התגובה המוכנה לכל דגימה. דגירה של תערובת התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לעצור את התגובה. טהר את ה-DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים, כפי שהודגם קודם לכן, אך נמחק עם 14 מיקרוליטר של מאגר פליטה.הכן מראש את תערובת התגובה כתערובת מאסטר, המכילה את הדברים הבאים עבור כל דגימה. חמישה מיקרוליטרים של מאגר תגובה של 10x T4 RNA ligase, חמישה מיקרוליטרים של hexamminecobalt (III) כלוריד, 0.5 מיקרוליטר של ARC140 oligonucleotide, 0.5 מיקרוליטר ATP ו-25 מיקרוליטר של 50% PEG 8000. מערבבים היטב על ידי פיפטינג.העבירו 13 מיקרוליטר מכל DNA מטוהר לצינור חדש של 200 מיקרוליטר, ועברו דנטורציה ב-85 מעלות צלזיוס בתרמו-סייקלר למשך שלוש דקות. מצננים את ה-DNA על קרח, ולאחר מכן מוסיפים 36 מיקרוליטר של תערובת תגובה לכל דגימה, מערבבים על ידי פיפטינג וסובבים לזמן קצר. הוסף מיקרוליטר אחד של T4 RNA ligase לכל תגובה, ערבב על ידי פיפטינג וסובב לזמן קצר.דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך למשך הלילה. כאשר קשירת ה-DNA של גדיל יחיד הושלמה, טהר את ה-DNA כפי שהודגם קודם לכן, אך השתמש ב-0.8 נפחים של חרוזים פרמגנטיים וגלול את החרוזים למשך 10 דקות. הוצא פנימה 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה, והעביר 20 מיקרוליטר מכל דגימת DNA לצינור חדש של 200 מיקרוליטר.חזור על הטיהור עם 0.8 נפחים של חרוזים פרמגנטיים, והוציא פנימה 14 מיקרוליטר של מאגר פליטה. עבור כל דגימה, הכינו את תערובת התגובה כתערובת מאסטר המורכבת משני מיקרוליטרים של מאגר תגובה פולימראז 10x T7 DNA, שני מיקרוליטרים של ARC76/77, שני מיקרוליטרים של dNTPs ו-0.8 מיקרוליטר BSA. העבירו 12.8 מיקרוליטר של DNA מטוהר לצינור חדש של 200 מיקרוליטר, ועברו דנטורציה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס בתרמו-סייקלר למשך שלוש דקות.מצננים את ה-DNA על קרח, ולאחר מכן מוסיפים 6.8 מיקרוליטר של תערובת תגובה לכל דגימה, מערבבים על ידי פיפטינג, מסתובבים לזמן קצר ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף 0.4 מיקרוליטר של T7 DNA פולימראז לכל תגובה, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר טיהור ה-DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים, יש לשטוף פנימה 11 מיקרוליטר של מאגר פליטה.כדי להתחיל בהגברת ה-PCR, הכינו את תערובת התגובה בנפרד עבור כל דגימה בשפופרת חדשה של 200 מיקרוליטר המורכבת מ-7.5 מיקרוליטר של ARC49, 7.5 מיקרוליטר של פריימר אינדקס ייחודי ו-25 מיקרוליטר של תערובת מוכנה להתחלה חמה פי 2. הוסף 10 מיקרוליטר של דגימת DNA לכל תגובה. הגבירו את הספרייה באמצעות התנאים הבאים.דטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, ולאחר מכן 18 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וסיום התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. החזק את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס לאחר ההגברה. טהר את הספריות כמתואר בפרוטוקול הטקסט והוציא פנימה 20 מיקרוליטר של מאגר TE.קבע את האיכות וגודל השבר הממוצע של כל ספרייה באמצעות מערכת אלקטרופורזה דיגיטלית. מוצגות תוצאות מייצגות של פרופילי ספרייה מתאימים לאחר טיפול באשלגן הידרוקסיד או אשלגן כלורי. לאחר חישוב הריכוז של כל ספרייה, משוך כמויות טוחנות שוות של עד 24 ספריות מוגברות עם פריימרים שונים לאינדקס לריצוף כמתואר בסעיפים 9 ו-10 בפרוטוקול הטקסט.הוסף מאגר TE לנפח סופי של 25 מיקרוליטר וריכוז של 10 ננו-מולר. לאחר הרצף, בצע ניתוח נתונים ביואינפורמטיים כמפורט בסעיף 11 לפרוטוקול הטקסט. גרפים אלה מציגים את הקריאות המסוכמות בכל אתרי HincII ב-DNA מיטוכונדריאלי אנושי גדיל קל וכבד לאחר טיפול באשלגן כלורי.כ-70% מכולם זיהו חמישה קצוות ראשוניים הממוקמים באתרי החיתוך, מה שמדגים את היעילות הגבוהה של עיכול HincII. טיפול בספריות עם אשלגן הידרוקסיד להידרוליזה של ה-DNA בריבונוקלאוטידים משובצים מקטין את מספר הקריאות ב-HincII לכ-40%המספר היחסי של קריאות ב-DNA המיטוכונדריאלי והגרעיני חושף הבדלים בכיסוי וממחיש את החשיבות של נורמליזציה מתאימה להסרת הטיית הגדיל. נורמליזציה של ספירת הקריאה ל-HincII נותנת מדד כמותי של מספר הריבונוקלאוטידים לכל גנום מיטוכונדריאלי על הגדיל הכבד או הקל.הקריאות לאחר טיפול באשלגן הידרוקסיד עבור כל ריבונוקלאוטיד, מנורמל להרכב הרצף של כל גדיל, מראות יחס שונה מאחד, המצביע על התפלגות לא אקראית של קריאות ומרמז על דפוס ריבונוקלאוטיד מובהק ואיכות ספרייה גבוהה. נורמליזציה של הקריאות באתרים של ריבונוקלאוטידים משובצים לאלה באתרי HincII, כמו גם לתכולת הנוקלאוטידים של הגנום, מייצרת מדד כמותי של כמה מכל ריבונוקלאוטיד משולב לכל 1,000 בסיסים משלימים. לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך יומיים אם הוא מבוצע כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על ה-DNA בטקט גבוה ולהימנע מהכנסת שברים של גדיל כפול במהלך הכנת הספרייה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו על מנת לאשר את נתוני כימות הריבונוקלאוטיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין ספריות למיפוי וכימות של ריבונוקלאוטידים ו-DNA באמצעות ריצוף הדור הבא.אל תשכח שעבודה עם כימיקלים כמו אשלגן הידרוקסיד עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מגן עיניים וכפפות בעת ביצוע הליך זה.

simultaneous-mapping-quantitation-ribonucleotides-human-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

פיתחנו טכניקה רגישה תווית הדנ"א המיטוכונדרי מסונתז החדש (mtDNA) בתוך תאים בודדים כדי ללמוד biogenesis mtDNA. הטכניקה משלבת שילוב של Edu יחד עם פרוטוקול tyramide הגברה (TSA) אות לדמיין שכפול mtDNA בתוך תאים subcellular של נוירונים.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA מיטוכונדריאלי של תאים בודדים על ידי הגברה אות Edu

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת RT-PCR על-ידי שילוב מעגלי RT-PCR, כמותי RT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז-טיפול, ואת הכתם הצפוני. פרוטוקול זה כולל שלב נורמליזציה כדי למזער את השפעתה של 5 ' טריפוספט לא יציב, והוא מתאים להפלות ולמיפוי התעתיקים הראשוניים והמעובדים שהצטברו באופן בלתי נשכח במיטוכונמיטוייז.

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

מבחני Pyrosequencing מאפשרים גנוטיפ חזק ומהיר של DNA מיטוכונדריאלי, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתאים או רקמות הטרופלזמיים.

גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing

מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג'ל.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

בידול בימוי של hESCs לתוך תאים ספציפיים יצרה עניין רב ברפואה רגנרטיבית. אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול...

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

למד מיפוי וכימות בו זמניים של ריבונוקלאוטידים ב-DNA מיטוכונדריאלי אנושי ברזולוציית נוקלאוטיד בודד. שיטה זו משלבת עיכול אנזימטי והידרוליזה בסיסית לחקר שלמות DNA ומנגנוני תיקון.

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

גלה סרטונים נוספים