אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה

המטרה הכוללת היא לקבוע את ההשפעה של שינויים ניסיוניים על רפרטואר הרחבת התאים וכיצד הוא קשור לתפקוד הידבקות התאים בסרטן. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי תפקידי מפתח של רפרטואר הרחבת קרום התא בוויסות התנהגות התאים כגון הידבקות תאים, תנועתיות ופלישה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית לביצוע וניתנת להתאמה בקלות לתנאי ניסוי שונים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול או האבחון שלנו של סרטן מתקדם מקומי או גרורתי מכיוון שהיא עוזרת לכמת במדויק שינויים ברפרטואר הרחבת התאים הקשורים לשינויים בתאי הגידול ביכולות דבק ופולשניות. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון ויסות תעלות יונים, הידוע כממלא תפקיד חשוב ביצירת הארכת תאים ותהליכים פיזיולוגיים תקינים. הדגמה חזותית והקלטה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את ספירת שלבי הארכת התאים בגלל הדקויות של הופעתם לפעמים.

יום לפני ההדמיה, ספרו תאי SW 13, SW Neo ו-SW DKK3 שגדלו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים של פחמן דו חמצני באמצעות המוציטומטר. הנח כיסויי זכוכית סטריליים לבארות בודדות של שלוש שש צלחות באר. השתמש בצלחת נפרדת לכל שורת תאים וצלחת את שלושת קווי התאים בצפיפות של 5, 000 תאים לבאר לתוך שש לוחות הבאר הללו.

הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך הלילה. למחרת, מכל באר שואבים את מצע הגידול. לאחר מכן, שטפו תאים במיליליטר אחד של PBS חם.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 3.7 אחוז פורמלדהיד לכל באר כדי לתקן את התאים. השאירו את התאים בקיבוע למשך 10 דקות. לאחר סיום הקיבוע, שאפו את הפורמלדהיד.

הוסף מיליליטר אחד של 0.05 אחוז סגול קריסטל לכל באר כדי להכתים את התאים למשך 30 דקות. לאחר מכן, נקה את הכתם העודף על ידי שטיפת תאים במיליליטר מים נטולי יונים לבאר שלוש פעמים. לאחר מכן, הניחו טיפה של מגיב הרכבה שקוף על שקופית זכוכית מסומנת.

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים בעלי קצה עדין, אחזר בעדינות את החלקות הכיסוי והנח אותם עם הפנים כלפי מטה מעל ריאגנטים ההרכבה. לאחר הרכבת כל הכיסויים המוכתמים על שקופיות, תחת מיקרוסקופ אור בחר 20 תצוגות אקראיות של תאים לא חופפים מכל כיסוי. צלם מיקרוגרפים של תמונות בהגדלה של 400 חוזק עבור כל שדה ראייה.

לאחר מכן, התבונן וספור את מספר סוגי ההרחבות בכל אחד מ -20 התאים המייצגים. השתמש בהגדרות ובפרוטוקול הטקסט כדי להנחות את הסיווג שלך של הרחבת הממברנה כפילופודיה, לובופודיה או למליפודיה. כאשר סופרים לראשונה סוגי סיומות תאים, זה עשוי להיות מועיל לשמור תמונת התייחסות זמינה לסקירה.

במידת האפשר, ספירה בצורה עיוורת ביחס לדגימות הניסוי שלהם תספק אובייקטיביות נוספת. קבע את המספר הממוצע של הרחבות מכל סוג לכל תא בכל אחת משלוש שורות התאים שנבדקו. השתמש באנובה חד כיוונית כדי לבדוק שההבדל באחוז הממוצע של הרחבות קרום התא בין סוגי התאים השונים הוא מובהק סטטיסטית.

יום לפני הבדיקה, באמצעות המוציטומטר, ספרו תאי SW 13, SW Neo ו-SW DKK3. צלחת תאים אלה בצפיפות של 100,000 תאים לבאר לשש לוחות באר באמצעות צלחת אחת לכל אחת משש נקודות הזמן המיועדות שייבדקו. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך הלילה.

למחרת, הוציאו את הצלחת מהחממה ושטפו תאים פעם אחת עם PBS חם. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים בעוצמה אחת לכל באר. סובבו בעדינות את הצלחות כדי לפזר אפילו את התמיסה הנוספת.

דגרו את הצלחות עם התמיסה לזמנים מוגדרים. שאפו את הצלחת המיועדת בסוף כל נקודת זמן. זמן קצר לאחר כל שאיפה, יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של PBS חם.

לאחר מכן הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק תאים המחוברים באופן רופף. חזור על הכביסה יחד עם הקשה לסירוגין פעמיים נוספות. לבסוף, שאפו את כל ה-PBS שנותר וקבעו את התאים שנותרו בצלחת עם מיליליטר אחד של 3.7 אחוז פורמלדהיד.

לאחר סיום הקיבוע, שאפו את הפורמלדהיד. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 0.05 אחוז סגול קריסטל לכל באר כדי להכתים את התאים. לאחר השלמת הצביעה, נקה את הכתם העודף על ידי שטיפת תאים במיליליטר אחד של מים נטולי יונים לבאר שלוש פעמים.

בעזרת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 100 עוצמה, ספרו את התאים המחוברים הנותרים בכל באר עבור כל צלחת. לאחר מכן קבע את אחוז התאים שנותרו מנותקים במהלך נקודות הזמן השונות עבור שלושת קווי התאים שנבדקו. באמצעות אנובה דו-כיוונית, בדיקת ההבדלים ושיעורי ניתוק התאים בין שלושת קווי התאים הם מובהקים סטטיסטית.

תאי בקרה מוכתמים בסגול קריסטל SW 13 ו-SW Neo יצרו בעיקר פילופודיה ולמליפודיה. לעומת זאת, תאים המבטאים DKK3 יצרו יותר לובופודיה עם היעדר כמעט מוחלט של lamellipodia ומעט מאוד פילופודיה. כמו כן, שימו לב להבדלים בקוטביות בין התאים המבטאים DKK3 לבין קווי תאי הבקרה.

הגרף מציג את השיעור של הרחבות תאים שונות בשלושת קווי התאים שנבדקו. שימו לב, השיעור הגבוה משמעותית של לובופודיה בתאים המבטאים DKK3. גרפים קוויים מראים את אחוז התאים שנשארו מחוברים לצלחת לאחר הטיפול בתמיסת הדיסוציאציה עבור נקודות הזמן המצוינות בציר X.

בכל נקודות הזמן עד 10 דקות, תאים המבטאים DKK3 הראו חוזק חיבור תאים גבוה משמעותית בהשוואה לתאי הביקורת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו בפרק זמן של יום עד יומיים בהתאם למערך הניסוי שלך אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה חשוב לזכור להעריך כיצד שינויים במורפולוגיה של הארכת התאים משפיעים על יכולת ההדבקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת במדויק הרחבות תאים ביחס לשינויים במאפייני ההידבקות של תאים סרטניים. בהצלחה ותודה על הצפייה.