Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לקבוע את היישום של טומוגרפיה אלקטרונית בחתך סדרתי כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריאלי של שריר הטיסה העקיף של דרוזופילה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי המבנה, כגון המבנה והקשר התפקודי למיטוכונדריה. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהאולטרה-מבנה הסלולרי מתגלה בתלת מימד.

כדי להתחיל בניסוי, יש להרדים חמש דגימות של דרוסופולה על קרח ולטבול כל זבוב במיליליטר אחד של אגרוז נמס נמוך של 4% במאגר פוספט. הניחו לאגרוז להתמצק על הקרח. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום להב רוטט כדי לחתוך את הדרוסופולה המשובצת בג'ל אגרוז לפרוסות בעובי של 100 מיקרומטר.

טבלו את הפרוסות בתמיסה מקבעת המכילה 2.5% גלוטרלדהיד במאגר פוספט מולארי אחד בנקודת אפס. שטפו את חלקי הרקמה בשלוש טיפות של מאגר פוספט ולאחר מכן שטפו עם שתי טיפות מאגר פוספט עם 20% BSA. הנח את החלקים במנשאי זהב להקפאה בלחץ גבוה, או HPF, מלא במאגר ו-20% BSA.

לאחר מכן, טען את הדגימה המכילה את המנשאים למקפיא בלחץ גבוה בהתאם למדריך למשתמש. לאחר ההקפאה, שחרר את הנשאים מהמחזיק מתחת לחנקן נוזלי והעביר אותם למכשיר החלפה חופשי מקורר למינוס 140 מעלות צלזיוס. בצע את פרוטוקול ההחלפה החופשית עם קוקטייל FS המכיל 2% גלוטרלדהיד, 2% אוסמיום טטרוקסיד, 0.1% אורניל אצטט באצטון.

הטמיעו דגימות בשרף בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, פילמרו את השרף בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. חתוך את גושי הדגימה כדי לחשוף את פני הבלוק הרצויים המכילים רקמה.

לאחר מכן, טפל מראש בחלקיקי זהב 10 ננומטר עם 1% BSA למשך 30 דקות. שטפו והשעו את חלקיקי הזהב במי מלח חוצצים פוספט, או PBS. שכבו את חלקיקי הזהב על רשתות שקופיות נחושת המצופות בסרט פחמן ליצירת סמנים נאמנים.

חותכים חלקים סדרתיים בעובי של 200 עד 250 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום. לאחר מכן, אסוף את החלקים הסדרתיים על רשתות חריצים באמצעות לולאה מושלמת לקטעים דקים. מכתים את החלקים בציטראט עופרת ריינולדס למשך 10 דקות.

שכבו שכבה שנייה של חלקיקי זהב נאמנים בחלק העליון של החלקים. טען את הרשת על מחזיק טומוגרפיה דו-צירי והכנס למיקרוסקופ אלקטרוני השידור הפועל ב-200 קילו-וולט. יישר את המיקרוסקופ במוקד האוצנטרי.

הגדר את תוכנת איסוף הנתונים האוטומטית, התאם ויישר את אלומת האלקטרונים בהגדרת ההדמיה הרב-סקאלית, רכוש הפניות כהות ובהירות למצלמה באזור ריק ללא סרט פחמן תחת הגדרת איסוף הטומוגרפיה. לאחר מכן, אסוף אטלס רשת בהגדלה נמוכה. בחר מיטוכונדריה בחתכים טוריים כמטרות לאיסוף טומוגרפיה, רכוש סדרת הטיה משלילי 60 מעלות לחיובי 60 מעלות עם מרווחים של שתי מעלות על ציר A עבור כל מטרה.

לבסוף, אסוף את סדרת ההטיה השנייה. סובב את מחזיק הדגימה 90 מעלות. רכוש אטלס חדש.

בחר מיקומים מתאימים ורכוש את סדרת ההטיה על ציר B עבור כל מטרה. בשיטה זו נוצרו מיקרוגרפים דו-ממדיים וטומוגרפיות תלת-ממדיות ממקטעים סדרתיים המכסים את כל נפח המיטוכונדריון. הטומוגרמות המצורפות של החתך הטורי מוקרנות ליצירת חתך אורך עם ציר z מוצג אנכית.

טומוגרפיה אלקטרונית בחתך סדרתי יושמה לניתוח תכונות מבניות של קריסטה מיטוכונדריאלית המשקפת את מצבה האנרגטי והזדקנותה. פרוסות של שחזורים טומוגרפיים של אלקטרונים מיטוכונדריאלים חושפות מעברים בין ממברנות למלריות דרך ציר ה-z. פילוח טומוגרפי הממחיש ספירלה שמאלית בתלת מימד.

דפוסי המיתוג של Cristae נותחו ועובדו צבע במודל הפילוח. פרוסה טומוגרפית מציגה את מפגש המטריצה הרוחבית על פני ממברנות קריסטה. נוצר מודל פילוח של הטומוגרמה בהצגת מפגש מטריצה לרוחב וקריסטה מייצגת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע טומוגרפיה אלקטרונית בחתך סדרתי, שעשויה להיות מותאמת לחקר כל מבנה תאי בתלת מימד.