ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד
23 בפברואר 2018
וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשר לנו לעקוב אחר תרביות תאים ישירות בתוך החממה. כאן נתאר את פרוטוקול מלא נהגה לרכוש וניתוח של 2.7 היום רכישת בתרבית תאים הלה, שמוביל dataset של 2.2 x 10 שירים6 מדידות של תא בודד ומורפולוגיה 10584 מחזור התא.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לרכוש ולנתח את הדינמיקה של האוכלוסייה הגדולה של תאים נצמדים המנוטרים באמצעות מיקרוסקופ וידאו ללא עדשות. לכן, אנו חושבים שהטכניקה הזו מעניינת בתחומים רבים של ביולוגיה ולחקר התפשטות תאים או דלקת שלפוחית השתן או סינון תרופות, או ניטור תהליכים ביולוגיים שונים. אז הטכניקה הזו היא ללא תוויות והיא מאוד פשוטה.
אבל זה יעיל מאוד בחקר אוכלוסיות תאים גדולות. איזה רעיון לשיטה הזו, כשעברנו מתחום איתור חיידקים לתחום הדמיית תאי יונקים. אז זה היה שימושי שהביולוג, הם יצטרכו רכישת זמן-lapse של המעגל ישירות לתוך החממה.
לאחר מכן בנינו מיקרוסקופ וידאו מותאם אישית ללא עדשות שתואם לחממה ופיתחנו אלגוריתם שחזור הולוגרפי כדי לקבל תמונה של אלפי תאים שנמצאים בשדה הראייה הגדול מאוד. התחל הליך זה על ידי ציפוי צלחת תחתונה מזכוכית 6 בארות עם פיברונקטין בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שעה, הסר עודפי פיברונקטין ושטוף את צלחת הזכוכית התחתונה של 6 בארות עם PBS.
תאי הלה, הגדלים ב-DMEM, בתוספת מדיום גלוטמין, בתוספת 10% חום בסרום עגל עוברי פעיל, ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין משמשים בהדגמה זו. זרע עשרים אלף תאים לצלחת תרבות. חשוב להשתמש במיכל עם תחתית זכוכית.
לאיכות הרכישה ללא עדשות. הנח את לוחית התרבות לתוך החממה על גבי מיקרוסקופ הווידיאו נטול העדשות. מיקרוסקופ הווידיאו נטול העדשות המשמש לרכישת זמן-lapse זה זמין מסחרית.
יש לו חיישן תמונה מוליך למחצה תחמוצת מתכת עם שטח הדמיה של 29.4 מילימטרים רבועים, וגובה פיקסלים של 1.67 מיקרומטר. תאורה מרובת אורכי גל מסופקת על ידי מכשיר דיודה פולטת אור מרובה שבבים הממוקם מעל חור סיכה של 150 מיקרומטר במרחק של כ -5 סנטימטרים מהתאים. לפני שמתחילים ברכישת זמן-lapse, חשוב לבדוק שאין עיבוי על לוחית הכיסוי.
מכיוון שעיבוי יפגע באיכות התמונה של הרכישה. אם התרחש עיבוי על כיסוי צלחת התרבות, נקה את המכסה. שלוט במיקרוסקופ נטול עדשות הווידאו באמצעות תוכנת רכישה זמינה מסחרית.
אשר מבצע הן את רכישת ה-Time-lapse והן את השחזור ההולוגרפי. הזן את פרמטרי הקלט הנדרשים בממשק התוכנה. הגדר את קצב הפריימים, לרכישה אחת כל 10 דקות, את סוג תרבית התאים להדבקה, ואת משך הניסוי ל-3 ימים.
התחל את רכישת קיטועי הזמן. תמונה זו מציגה דוגמה לשדה הראייה המלא של רכישה גולמית בערוץ הכחול על שטח של 29.4 מילימטר רבוע במסגרת אחת. פאנל B הוא הפרט של פאנל A, ופאנל C הוא הפרט של פאנל B.אלגוריתם השחזור ההולוגרפי יעבד אוטומטית את הרכישה ללא עדשה כדי לקבל את תמונת הפאזה של תרבית התא.
מוצגת תמונה לדוגמה של תאים לפני ביטול גלישת פאזה, ואחריה תמונה לאחר פתיחת גלישת פאזה. מעקב אחר תאים מתבצע באמצעות אלגוריתם TrackMate, תוסף פיג'י בקוד פתוח למעקב אוטומטי אחר חלקיקים בודדים. לאחר הטעינה, רכישת ה-Time-lapse המלאה לפיג'י והגדרת האלגוריתמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הגדירו את פרמטרי הקלט.
הגדר את קוטר הכתם המשוער ל-15 פיקסלים, את סף הגלאי ל-0.25, את המרחק המקסימלי לקישור ל-15 פיקסלים, את המרחק המקסימלי לסגירת הפער ל-15 פיקסלים ואת מספר הנקודות במסלול ל-3.5. השלב הראשון באלגוריתם מעקב התאים הוא זיהוי תאים ברכישה ללא עדשות. התוצאות של אלגוריתם מעקב התאים מוצגות, כאשר כל מסלולי התאים מוצגים מעל חמישים פריימים, או כ-8 שעות.
עם קוד צבע המתאים למהירות החציונית. הפאנל התחתון הוא תמונה מפורטת של המלבן הצהוב מהפאנל העליון. סרטון וידאו מייצג של מעקב סלולרי מוצג כאן.
בסוף תהליך המעקב אחר התאים, בחר בלחצן הניתוח כדי ליצור את התוצאות בצורה של 3 קבצי טקסט. על בסיס נתונים אלה, לבצע פילוח תאים ולזהות חלוקות תאים באמצעות אלגוריתמים ייעודיים, כמפורט בפרוטוקול הטקסט ובקבצי הקוד המשלימים. הידור כל מדידות התא הבודד על פני רכישת זמן-lapse מלאה, מייצר עלילות פיזור של מספר מדדים כפונקציה של זמן.
המספר הכולל של תאים בשדה הראייה המלא, גדל מאלפיים לחמישה עשר אלף תוך 2.7 ימים. מוכפל במספר נקודות הזמן, זה מוביל למערך נתונים גדול של תאים שזוהו. כל אחד מהם מאופיין בקואורדינטות ובתכונות המורפולוגיות שלו, כגון מסה יבשה, שטח, עובי ממוצע, אורך גישה עיקרי ויחס גובה-רוחב.
השילוב של אלגוריתמים למעקב אחר תאים ופילוח תאים, מאפשר מדידות קינטיות ברמת התא הבודד. דוגמה זו מציגה את הניתוח של מסלול התאים שנמשך כשישים ושש שעות, ומציג 4 חלוקות תאים בנקודות הזמן המוקפות בעיגול צהוב. מספר מדדים חושבו כפונקציה של זמן: שטח פנים התא, מסה יבשה, עובי ממוצע ותנועתיות התא.
התפלגות משך מחזור התא לתצפית של 2.7 ימים הייתה קרובה לאגוזיאן. עם ממוצע של 16.5 שעות. אורכי מחזור התא, הנמדדים אוטומטית, מתואמים היטב לאלה הנמדדים באופן ידני.
כמוכן נבדקו פרמטרים נוספים, כגון המסה היבשה הראשונית של התא, המסה היבשה הסופית וקצב הגידול הממוצע במהלך מחזור התא. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ניתוח הנתונים המלא של רכישת ה-Time-lapse, תוך מספר שעות, בהתאם לתצורת המעבד וביצועי החומרה. בזמן ניסיון הליך זה חשוב מאוד להקפיד על ריכוז התאים הראשוני.
אם ריכוז התא הראשוני גדול מדי, אלגוריתם מעקב התאים ייכשל בהגדרה נכונה של מסלולי התא. אבל, אם ריכוז התאים נמוך מדי, גם הסטטיסטיקה של הניתוח המלא תהיה נמוכה מדי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוחים אוטומטיים כמו מעקב אחר תאים כדי לענות על שאלות אחרות בתחומים: ביולוגיה, ביולוגיה בסיסית או כימוטקסיס.
טכניקה חדשה זו, סוללת גם את הדרך לניטור שושלת התאים שבתקווה תביא תובנה מעניינת לחקר מחזור התא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע רכישת זמן-lapse באמצעות מיקרוסקופ וידאו ללא עדשות וכיצד לנתח אוכלוסייה גדולה של תאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן במתודולוגיה המשתמשת במיקרוסקופיית וידאו ללא עדשה (lens-free) לצורך ניטור תרביות תאים ישירות בתוך אינקובטור. הפרוטוקול מאפשר רכישה וניתוח של מערכי נתונים נרחבים על מורפולוגיית תאים ודינמיקה של מחזור התא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
- מחקרים של ת proliferation תאים
רקע
- מיקרוסקופיית וידאו ללא עדשות היא טכניקת דימוי ללא סימון.
- הוא מאפשר רכישת תמונות בשיטת Time-lapse של תרביות תאים.
- שיטה זו יעילה לחקר אוכלוסיות גדולות של תאים נצמדים.
- יש לה יישומים בתחומים ביולוגיים שונים, כולל סריקת תרופות.
מטרת המחקר
- לרכישה ולניתוח של הדינמיקה של אוכלוסיות גדולות של תאים דבקים.
- לספק שיטה פשוטה אך יעילה לניטור התנהגות תאים.
- להקל על מחקר בשגשוג תאים ובתהליכים ביולוגיים אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיית וידאו ללא עדשות לצורך דימוי.
- רכישת תמונות בשיטת Time-lapse של תאי HeLa בתרבית.
- ניתוח של מורפולוגיית תאים בודדים.
- מעקב אחר דינמיקת מחזור התא לאורך 2.7 ימים.
תוצאות עיקריות
- רכישת סט נתונים המכיל 2.2 x 106 מדידות.
- מעקב אחר 10,584 מסלולי מחזור תא.
- הדגמה של יעילותה של מיקרוסקופיה ללא עדשות במחקרי תאים.
- תובנות לגבי שגשוג והתנהגות של תאים בסביבה מבוקרת.
מסקנות
- מיקרוסקופיית וידאו ללא עדשות היא כלי בעל ערך למחקר בביולוגיה של התא.
- המתודולוגיה מאפשרת איסוף נתונים נרחב על דינמיקה של תאים.
- טכניקה זו יכולה לשפר מחקרים ביישומים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית וידאו ללא עדשות מאפשרת ניטור כמותי ובעל תפוקה גבוהה של תרביות תאים נצמדים ישירות בתוך אינקובטורים, ובכך תומכת בניתוח דינמי של שגשוג ותצורת תאים ברזולוציה של תא בודד. יכולת זו מגבירה את הביטחון בחיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ופיתוח בדיקות (assays) באמצעות יצירת סטים של נתונים רחבי היקף בעלי רזולוציית זמן. גישה זו ממוקמת באופן אסטרטגי לשיפור קבלת ההחלטות בנקודות תפנית מרכזיות בשרשראות הפיתוח (R&D pipelines) של התעשייה הביופרמצבטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח קינטי של אלפי תאים בודדים לבחינת תהליכי שגשוג ודינמיקה של מחזור התא.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של היפותזות ביולוגיות באמצעות מעקב כמותי ואורכי של תאים בודדים.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת הטרוגניות בהתנהגות התאים ובדפוסי החלוקה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת דימות סטנדרטי ללא סימון (label-free) לניטור הדיר שחזור של תרביות תאים בתהליכי סריקה.
- מייצרת פלטים מורפולוגיים וקינטיים כמותיים המתאימים לאופטימיזציה ותיקוף של בדיקות.
- מאפשרת רכישת נתונים אוטומטית וניתנת להרחבה עבור יישומים של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק מערכי נתונים בעת רחבה (time-resolved) שיכולים להנחות גילוי של ביומרקרים תרגומיים כאשר הם מיושרים עם מודלים רלוונטיים למחלה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור ניתוח כמותי ורובסטי של התנהגות תאים.
- מפחית את חוסר הוודאות הביולוגית בבחירת מודלים פרה-קליניים באמצעות מדדי שושלת תאים ושגשוג מפורטים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קלנייすることで שהיא מאפשרת תצפית כמותית וישירה של תרביות תאים, ובכך תומכת הן בבדיקת היפותזות והן בהכנה של הבדיקה (assay readiness).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשר בדיקה מונחית-השערה של קינטיקת השכפול והחלוקה של תאים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מערכי נתונים רחבי היקף בשיטת צילום במרווחי זמן (time-lapse) לצורך השוואה סטטיסטית של תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מציע פוטנציאל להתאמת סמנים ביולוגיים כאשר הוא מיושם על מערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמת דימוי נתינת-קנה-מידה (scalable) ללא סמניות, הניתנת להתאמה למספר R&תוכניות D.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מבוססי תאים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של תהליכי ניטור תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים.
שיקולים ביישום
- דורש מומחיות בתרבית תאים, דימות בזמן אמת (time-lapse imaging) וניתוח חישובי.
- תלוי בגישה לחומרה של מיקרוסקופיה וידאו ללא עדשות ובתוכנה אנליטית תואמת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי רכישה ותהליכי עבודה של עיבוד נתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים אדהרנטיים שונים, אך רגיש לריכוז התאים הראשוני ולתנאי התרבית.
- קצב עיבוד הנתונים מושפע מהתשתית החישובית ומביצועי החומרה.
