שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק תנאים סטנדרטיים לעיקור זרעים מוצלח של מספר רב של גנוטיפים של Arabidopsis תוך מניעת צמיחה מיקרוביאלית. שיטה זו מאפשרת לעקר מאות דגימות זרעים בכל פעם, ובכך לפשט שלב קריטי של הכנת חומר צמחי בתחומי גנומיקה, פרוטאומיקה, מטבולומיקה ומחקרים אחרים בעלי תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תנאים בהם עיקור יעיל משולב עם קצב נביטה גבוה למספר רב של דגימות זרעים.

כדי להתחיל, הכינו תמיסת אקונומיקה של 50% עם מים מזוקקים. לכל 200 מיליליטר תמיסת אקונומיקה, הוסף 50 מיקרוליטר חומר ניקוי TWEEN 20. ניתן לאחסן את תמיסת האקונומיקה עד חודש כל עוד היא נפתחת רק בתנאים סטריליים.

לאחר מכן, הכניסו 100 זרעים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. ניתן לעשות זאת באופן ידני, או באמצעות רובוט זרעים בהתאמה אישית. כעת, במכסה זרימה למינרית, הוסיפו 500 מיקרוליטר מתמיסת האקונומיקה של 50% לזרעים.

לאחר מכן, העבירו את הצינורות למסובב ודגרו את הזרעים באקונומיקה בתסיסה קלה למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות יש לשאוב את תמיסת האקונומיקה מהצינורות ולהסיר ככל האפשר. לאחר מכן, הוסיפו בחזרה 500 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים והפכו את הצינורות לערבוב.

הניחו לזרעים להתייצב, ואז שאפו את המים והחליפו אותם בבקבוק אחר כדי לשטוף את הזרעים שוב. בצע בסך הכל שש שטיפות כאלה עם מים מזוקקים מעוקרים. לאחר שהזרעים נשטפו היטב במים, השעו אותם במיליליטר מים לפני הציפוי.

לפני שמתחילים בתהליך העיקור, יש לחשב את נפחי האקונומיקה והחומצה ההידרוכלורית הנדרשים לייצור גז כלור. השתמש במשוואה שסופקה כדי להשיג את גז הכלור המומלץ של 6%. הקפידו לחשב במדויק את נפח ה-HCl הנדרש כדי להבטיח עיקור מוצלח ולמנוע התזות.

הקפד ללבוש כפפות וחלוק מעבדה במהלך פרוטוקול זה ולהחליף את הכפפות בכל פעם שהן נרטבות בחומצה או אקונומיקה. מתחת למכסה אדים, העבירו את בקבוקוני הזרעים לרשת כשמכסיהם פתוחים. לאחר מכן, הכניסו את המתלה למיכל פלסטיק בו ניתן לבצע את העיקור והכינו רצועות סרט פרפין כדי לאטום את המכסה למיכל.

כעת, טען את הכוס עם 100 מיליליטר אקונומיקה ואז הניח בפנים של 250 מיליליטר. שימוש בעודף אקונומיקה הוא תכונת בטיחות והכוס צריכה להיות לפחות פי שניים מהנפח הכולל של התמיסה שהיא מכילה. כמו כן, טפל תמיד באקונומיקה ובחומצות בנפרד.

לאחר מכן, הוסיפו לכוס שלושה מיליליטר של חומצה הידרוכלורית, ואז סגרו מיד את המיכל ואטמו אותו בפרפילם. עקוב אחר המיכל למשך שעה כדי לוודא שהגז מצטבר במהלך העיקור. גז כלור צריך להיות גלוי כאובך צהוב קלוש בתוך המיכל או שניתן לבדוק את התמיסה אם היא הופכת לצהובה.

בדוק מעת לעת את החותם על המיכל. אם המכסה מתפרק או שאטם הפרפין מתחיל להשתחרר, אטום היטב את המכסה בשכבה נוספת של סרט פרפין. לאחר העיקור של שעה, פתח פינה של המיכל כדי לאוורר את הגז במשך שלוש שעות.

לאחר שלוש שעות של אוורור, מכסים את כל הצינורות ומאחסנים את הזרעים המעוקרים בתנאים יבשים עד שהם מצופים. כעת, נטרלו את התגובה על ידי הוספה איטית של 1.5 גרם אבקת נתרן ביקרבונט תוך ערבוב עם מוט זכוכית להמסת המוצקים. המשיכו להוסיף נתרן ביקרבונט עד שבועות גז הפחמן הדו חמצני הפסיקו להיווצר.

לאחר מכן, מדוד את ה-pH של התמיסה, ובמידת הצורך הוסף נתרן ביקרבונט נוסף עד שה-pH ניטרלי. בתנאי שהתמיסה אינה מסריחה, ניתן להיפטר ממנה. אחרת, המתן עד שכל הריחות יתפוגגו.

הוסף 500 מיקרוליטר מים מזוקקים מעוקרים לכל צינור של זרעים מעוקרים בגז. לאחר מכן, שפכו את הזרעים על צלחת MS ופזרו אותם באופן שווה באמצעות לולאת חיסון סטרילית חד פעמית או קצה פיפטה סטרילי. לאחר שלושה ימים של ריבוד זרעים בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הלוחות ל-23 מעלות צלזיוס עם 16 שעות של חשיפה יומית לאור.

שמור את העפעפיים למעלה כך שהשורשים יגדלו למדיום. לאחר שמונה ימי צמיחה, קלעו את חלק הזרעים שנבטו. הנביטה נספרת כאשר הרדיקל מקרין מחוץ למעטפת הזרע, ושני הקוטילדון נראים לעין.

כמו כן, ספרו את מספר הזרעים המושפעים מעובש כדי לקבוע את יעילות תנאי העיקור. ארבעה ריכוזים שונים של אקונומיקה בחמישה זמני חשיפה שונים נבדקו על זרעי קולומביה מסוג בר. ריכוזי אקונומיקה גבוהים השפיעו לרעה על הנביטה בחשיפה רבה מדי.

עם זאת, שיעורי נביטה גבוהים נצפו עם אקונומיקה של 40 ו-50% בכל זמני החשיפה. זרעים שעוקרו בריכוזי אקונומיקה גבוהים היו בעלי תמותה גבוהה ולעתים קרובות הראו פגמי גדילה אך בדרך כלל היו נקיים לחלוטין מעובש. עיקור על ידי 50% אקונומיקה למשך 10 דקות נקבע כבעל איזון אופטימלי של עיכוב עובש ונביטה בריאה.

כדי לייעל את תנאי העיקור של גז הכלור, נעשה שימוש בשלושה ריכוזים שונים של גז כלור לעיקור זרעי קולומביה מסוג בר בשני פרקי זמן שונים. הייתה אינטראקציה משמעותית בין הזמן לריכוז הגז. בשעה אחת, לא הייתה השפעה על הנביטה, בעוד שריכוז הגז הגבוה ביותר היה מזיק לאחר שלוש שעות.

לפיכך, נבחרה תקופת עיקור של שעה. צמיחת עובש עוכבה ביעילות על ידי חשיפה לגז של שלוש שעות או לחשיפה של שעה באמצעות שישה או 17% גז. לפיכך, ריכוז גז של 6% למשך שעה נקבע כאופטימלי לנביטה ועיכוב עובש.

לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לעקר בהצלחה מאות קווי זרעים ביום אם היא מבוצעת כראוי. ניתן לאחסן זרעים מעוקרים בגז גם לתקופה ממושכת בתנאים יבשים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במשוואות שסופקו כדי לחשב את הנפחים הנדרשים של HCl ואקונומיקה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מחקרי אסוציאציות כלל-גנומיות על מנת לקשר בין מגוון גנוטיפים שונים לבין הפנוטיפים המעניינים. בהצלחה בניסויים שלך.