וזמינותו כתב המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית פשוט לזהות את מרכיבי התא הדרושות רעלן ריצין שרשרת (RTA) סחר בבני אדם שמרים

המטרה הכוללת של מבחן מדווח מבוסס פלואורסצנטי פשוט זה היא לסנן רכיבים תאיים הנדרשים לסחר תקין של רעלן ריצין A או שרשרת RTA באורגניזם מודל השמרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות להובלה בין-תאית של ריבוזום בהפעלת רעלן B. במקרה שלנו, תת-היחידה הציטוטוקסית של הרעלן הרגיל ריצין מקרום הפלזמה לתוך הציטוזום.

היתרון העיקרי של בדיקה זו הוא ההזדמנות לנתח את ההשפעה של גן שמרים בודד על הובלת RTA בצורה מהירה וזולה. התחל פרוטוקול זה בטרנספורמציה של תאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לחסן חמישה מיליליטר של מדיום קנמיצין LB עם תאים המכילים פלסמיד ביטוי RTA או הווקטור הריק.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 24 שעות. השלם ליטר אחד של מדיום קנמיצין LB עם חמישה מיליליטר של תרבית מוקדמת. לאחר מכן דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד עד שהתאים הגיעו לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.8 עד 1.0.

לאחר מכן, הפחיתו את טמפרטורת התרבות ל -28 מעלות צלזיוס. לגרום לביטוי RTA של ה-E.Coli על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של מילימולר אחד. לאחר 3.5 שעות בחום של 28 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 10, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן שטפו את הגלולה עם חמישה מיליליטר של מאגר מחייב וגלולה בטמפרטורה של 10, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר חזרה על הכביסה פעם אחת, השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מאגר כריכה. סוניקציה של התאים על הקרח באמצעות חמישה מחזורים של פולס של 15 שניות והפסקה של 30 שניות.

לאחר צנטריפוגה של רישיון התא ב -21, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, סנן את הסופרנטנט באמצעות מערכת סינון מזרק סטרילית. השתמש במערכת טיהור אוטומטית, המצוידת בעמודת זיקה מבוססת ניקל של חמישה מיליליטר כדי לטהר את חלק ה-RTA המתויג ב-HIS מחומר ה-E.Coli המסונן הסטרילי. באופן כללי, השתמש במהירות רמז של מיליליטר לדקה וקרר את כל מערכת הטיהור כדי למנוע קשירת רעלנים לא יעילה ואובדן פעילות רעלן.

אזן בקצרה את עמודת הזיקה עם 20 מיליליטר של מאגר כריכה כדי להסיר את מאגר האחסון. לאחר מכן מרחו את הסופרנטנט הסטרילי והמסונן על עמוד הזיקה באמצעות מזרק. שטפו את העמודה עם 25 עד 35 מיליליטר של מאגר מחייב כדי להסיר את החלבונים הלא קשורים מהעמודה.

בצע את שלב הכביסה עד שסופגי ה-UV ב-280 ננומטר קרובים לערך ה-UV הראשוני. לאחר מכן הסירו את שבר ה-RTA הקשור עם 20 עד 35 מיליליטר של מאגר פליטה ושמרו את הדגימה על קרח. חשוב להתחיל את דגימת שבר ה-RTA זמן קצר לאחר עליית ערך ה-UV, 280 ולהפסיק את דגימת שבר ה-RTA כאשר היא מגיעה שוב לקו הבסיס המקורי.

כדי להפיל את שבר ה-RTA החמקמק, החלף את עמוד הזיקה של מערכת הטיהור בעמוד התפלה ואזן את העמודה ב-20 מיליליטר של סורביטול מולארי של 0.8. החל את שבר ה-RTA החמקמק על העמודה באמצעות מזרק. שטפו את העמוד עם 100 מיליליטר של סורביטול מולארי 0.8 ודללו את שבר ה-RTA המומלח בצינור של 15 מיליליטר ברגע שספיגת ה-UV מתחילה לעלות.

כדי למנוע זיהום מלח, עצור בדגימת השבר ישירות כאשר המוליכות עולה. אחסן את שבר ה-RTA החמקמק בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הפיכת השמרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בחר שלושה שיבוטי שמרים שונים מכל צלחת.

חסנו את השיבוטים ב-100 מיליליטר של מדיום רפינוז נושר לוצין ב-220 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 1.0 עד 2.0. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בטמפרטורה של 10,000 גרם. לאחר שטיפת התאים פעמיים בחמישה מיליליטר מים סטריליים, השעו מחדש את התאים ב -50 מיליליטר של מאגר ספרופלסטי.

דגרו את תרבית 50 מיליליטר ב -100 סל"ד ו -30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר צנטריפוגה בטמפרטורה של 400 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, יש לשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של מדיום רפינוז מיוצב. לאחר מכן השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר מאותו מדיום כדי להשתמש בתאים ישירות למדידות בדיקת מדווח GFP.

זרע את ספרופלסט תאי השמרים ל 96 צלחות באר. לכל באר, הוסף 70 מיקרוליטר של מדיום רפינוז נושר לוצין מיוצב, המכיל את הבקרה השלילית, המבטא את הווקטור הריק או ה-RTA המטוהר בריכוז RTA סופי של חמש מיקרומולר. הוסף 70 מיקרוליטר של מדיום נשירה של לוצין מיוצב לכל אחת מהבארות הנותרות כדי להביא את הנפח הכולל שלהן ל-270 מיקרוליטר.

לבקרה חיובית על עיכוב חלבון, הוסף 70 מיקרוליטר של תמיסת G418 מיוצבת סורביטול 0.8 מולארית, מכיוון ש-G418 מונע ביטוי GFP בשמרים. הוסף מיד 30 מיקרוליטר של תמיסת גלקטוז מיוצבת כדי לגרום לביטוי GFP. הכן בקרה שלילית נוספת על ידי הוספת 30 מיקרוליטר של מדיום רפינוז מיוצב במקום 30% גלקטוז.

לאחר סיום הכנת הדגימה, הכניסו את צלחת 96 הבאר לקורא פלואורסצנטי והתכוננו למדידה באמצעות סט המסננים של 475, 509 ננומטר הנדרש לזיהוי פלואורסצנטי GFP. בצע מדידות ב-30 מעלות צלזיוס 120 סל"ד וקוטר טלטול של מילימטר אחד בחלון זמן של 20 שעות במרווחי מדידה של 10 דקות. מוצג כאן גרף טיהור מייצג של כרומטוגרפיית הזיקה של RTA ובקרת הווקטור הריק.

הפסגה הכחולה בתיבה השחורה מייצגת את שבר ה-RTA המאוגד. כפי שמוצג בקופסה השחורה, לא חומקים חלבונים מהעמודה בבקרה השלילית. מוצג כאן דיאגרמת התפלה של שבר RTA מטוהר זיקה.

התרשים מציג את ההפרדה בין חלק החלבון RTA לשבר המלח. תוצאות צביעת Coomassie לאחר טיהור והתפלה מוצלחים מראות ליזאט תאים או דגימות מטוהרות של גרסאות RTA שונות. במחקר זה נעשה שימוש ב-RTA ללא שינוי.

כדי לאמת את מבחן המדווח במרווח הקרינה, נמדדה פלואורסצנטיות GFP יחסית של ספרופלסטים של שמרים מסוג בר בתנאים מושרים ולא מושרים לאחר 20 שעות של השראת GFP. פלואורסצנטיות GFP יחסית נותחה גם בנוכחות RTA, G418 או הבקרה השלילית. פלואורסצנטיות GFP יחסית נמדדה גם עבור מוטציות נבחרות שבהן ידוע כי חלבונים מתאימים מעורבים ואינם מעורבים בסחר RTA בשמרים.

הקו המקווקו ייצג סף מובהקות. לאחר שליטה בביטוי וטיהור ה-RTA, ניתן לקבל את תוצאות בדיקת דוח הקרינה ביום אחד. בנוסף, שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום נטרול הריבוזום של רעלני B לחקור את שורשי השיכרון שלהם בשמרי אורגניזם מודל אוקריוטי.