זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר קלטת קטנה ומוכנה לשימוש שניתן ליישם לזיהוי חזותי של חומצות גרעין מרובות בבדיקה אחת וקלה לתפעול. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום זיהוי חומצות גרעין מרובות, כגון אורגניזמים מהונדסים גנטית, או זיהוי GMO. כדי לנקות את הנימים, לבשו מדי מעבדה, משקפי מגן וכפפות מגן כימיות.

מניחים נימים בכוס. נקו את הנימים עם 30 מיליליטר אצטון למשך חמש דקות כדי להסיר חומר אורגני. ואז, שטפו את הנימים במים נטולי יונים.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת הפיראנה על ידי שפיכת כעשרה מיליליטר מי חמצן לכוס. לאחר מכן, הוסף 30 מיליליטר חומצה גופרתית למי החמצן בניעור איטי כדי למנוע התחממות יתר. וודאו שהתמיסה מכסה לחלוטין את הנימים למשך 30 דקות לפחות.

לאחר מכן, שטפו את תמיסת הפיראנה בכמות גדולה של מים. שוטפים את הנימים באתנול ומים נטולי יונים למשך חמש דקות כל אחד. יבש את הנימים בתנור ייבוש.

לאחר מכן, שקלו בסיס PDMS וריאגנטים להילוכים ביחס של אחד לאחד בצינור של 50 מיליליטר. בדרך כלל, מערבבים חמישה גרם של בסיס אלסטומר עם חמישה גרם חומר ריפוי אלסטומר. ערבבו היטב את התערובת במשך כחמש דקות בעזרת מוט זכוכית.

מניחים את הכוס עם ה-PDMS בצנצנת פעמון ואקום למשך שלושים דקות להסרת גזים. לאחר מכן, שפכו את ה-PDMS לאט לתוך הגליל של תבנית הנירוסטה. הניחו ל-PDMS להתרפא במשך שלוש שעות בתנור ייבוש בחום של 60 מעלות צלזיוס.

לאחר ריפוי ה-PDMS הסר את התבנית על ידי שליפת התבנית בעזרת צילינדר. הסר את ה-PDMS מהגליל על ידי חיתוך שולי התבנית בעזרת אזמל. שטפו PDMS שלוש פעמים עם אתנול ומים נטולי יונים.

לאחר מכן, יבש את תמיכת ה-PDMS בחנקן. התייחס למשטח התחתון של תמיכת ה-PDMS כהידרופובי על ידי השריית תמיכת ה-PDMS בשכבה סופר הידרופובית למשך שנייה אחת. לאחר מכן, יבש אותו במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הכנס את הנימים הנקיים של ארבעת המילימטרים לתוך החורים של תומך ה-PDMS, והשאיר נקודת אפס חמישה מילימטרים מהנימים מחוץ למשטח העליון של תומך ה-PDMS. וודאו שקצות הנימים נמצאים באותה רמה. כדי לטפל במשטח החיצוני של הנימים ובמשטח העליון של תמיכת ה-PDMS להיות הידרופובי, הוסף 15 מיקרוליטר של המעיל הסופר הידרופובי על גבי פני השטח של תומך ה-PDMS.

יבש באוויר את מערך הנימים הסופר הידרופובי. לאחר מכן, הוסף נקודה אחת שישה מיקרוליטרים מתערובת קיבוע הפריימר של סט אחד של פריימרים כדי למלא נימים מקבילים אחד של מערך הנימים לפי סדר שתוכנן מראש. עוגן את המערך בבאר שקופה של צלחת סטנדרטית עם תחתית שטוחה של 96 בארות וייבש את המערך ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.

כדי להרכיב את הקסטה, הנח מתאם טעינה על החלק העליון של המערך המעוגן. ודא שהצלחת של המתאם מכסה רק את החלקים החשופים של כל עשרת הנימים. להכנת תערובת התגובה LAMP יש להוסיף ריאגנטים לתערובת לפי פרוטוקול הטקסט ולערבב את תערובת התגובה למשך חמש שניות לאחר הוספת סידן.

הפוך בעדינות את הצינור עשרים פעמים לאחר הוספת פולימראז Bst. ניתן לחסל עקבות DNA הקיים בסביבה על ידי ניקוי מוקדם יותר עם שומה אחת לליטר חומצה הידרוכלורית לפני מסירת תערובת ה-LAMP. שאפו 20 מיקרוליטר מתערובת התגובה LAMP עם קצה סטנדרטי של 100 מיקרוליטר.

הכנס את הקצה לכניסה של מתאם הטעינה כדי לנעול אותו. הזרקו בעדינות את תערובת התגובה לכלי המתאם. תערובת התגובה תמלא במהירות את המנה, ולאחר מכן תעמיס את הנימים באופן אוטומטי באמצעות כוח נימי.

הסר את המתאם עם קצה הנעילה ואטום את הבאר באמצעות סרט איטום שקוף תואם PCR. לאחר מכן, דגרו את מערך הנימים באינקובטור בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי להשיג תמונות של פליטת הקרינה, השתמש בפנס UV כדי לעורר את הסידן המנותק כדי לפלוט פלואורסצנטיות.

צלם תמונות מהחלק העליון של מערך הנימים באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם. בעת צילום תמונה, ודא שהמצלמה מתקרבת לאזור הנימים ככל האפשר כדי לקבל תמונות איכותיות וברורות. לאחר מכן, פתח את התמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

ואז בחר תמונה, תבנית, גווני אפור, כן ותמונה, תבנית, 16 סיביות, כן. בחר קובץ, שמור בשם, פורמט, TIFF, כדי להמיר את התמונה לפורמט TIFF של 16 סיביות. כדי לחלץ את הערך של עוצמת הקרינה, פתח את תוכנת ניתוח המיקרו-מערך.

גרור את התמונה בפורמט TIFF של 16 סיביות לממשק התוכנה, ולאחר מכן בחר את אורך הגל של 532 ננומטר וצבע ירוק כדי להציג את התמונה. לאחר מכן, צור בלוק חדש כדי לאתר את אות הקרינה מהנימים. בחר כלים, בלוקים חדשים ולאחר מכן מקם את מספר העמודות והשורות כאחד לאחד ושניים לחמש בממשקי הבלוקים והתכונות בנפרד.

לחץ לחיצה ימנית ובחר את מודל התכונות. לאחר מכן, התאם את המיקום והקוטר כך שיתאימו לאזור הקרינה של הנימים. בחר ניתוח כדי לחלץ את הערך של עוצמת הקרינה.

לבסוף, בחר קובץ, שמור הגדרות בשם, כדי לשמור את מסמכי הבלוק. לאחר מכן, בחר, תייק, שמור תוצאות כדי לשמור את תוצאות עוצמת הקרינה. מוצגת כאן הפריסה של מערך הנימים.

נימים אחד עד שמונה, עם קידומת ערכות פריימר LAMP נימים 9 ו-10 מייצגים שניים, ללא בקרות פריימר. מוצג כאן התצלום הפלואורסצנטי לזיהוי תירס מהונדס גנטית, MON863, כאשר הצבע הירוק מייצג את הגברת ה-LAMP החיובית.

הגברה מוצלחת, מוצגת רק בנימים צפויים 1, 6, 7 ו-8, ללא זיהום בין נימים ריקים. תצלום פלואורסצנטי זה מיועד לזיהוי תערובת ה-GMO. הצבע הירוק הציג את הגברת ה-LAMP החיובית.

הגברה מוצלחת הוצגה רק בנימים צפויים 1, 4, 5, 6, 7 ו-8 ללא זיהום בין נימים ריקים. התצלום הפלואורסצנטי המוצג כאן מיועד לזיהוי תירס שאינו מהונדס גנטית, כאשר הצבע הירוק מציג את הגברת ה-LAMP החיובית. הגברה מוצלחת הוצגה רק בשמונה הנימים הצפויים, וללא זיהום בין נימים ריקים.

לאחר שליטה, הליך זיהוי זה יכול להיעשות תוך נקודה אחת חמש שעות אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר קלטת מבוססת נימים כדי לבצע זיהוי חומצות גרעין מרובות.