שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה
21 בדצמבר 2017
כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתייג תעתיקים בודדים ב-E.Coli עבור בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית להדמיה בניסויי FiSH של מולקולה אחת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המערכות, כגון אפיון יכולת תעתיקים של תא לתא בתחום העניין. כמו גם תמלילים של לוקליזציה של דופן התא.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת כמות מידע על הסטטיסטיקה של תהליכי שעתוק. כדי להתחיל את הפרוטוקול, גדל E.Coli MG1655 במדיום LB בן לילה בשייקר מסלולי, ב-260 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. למחרת, יש לדלל את תרבית הלילה ב-1 עד 100 במדיום טרי ולמדוד את הצפיפות האופטית שלה בספקטרופוטומטר, עד לערך של 0.2 עד 0.4.
לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -4, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט מכל הצינורות. הוסף מיליליטר אחד של 1XPBS לכל צינור והשהה מחדש את הגלולה כדי למזער את הצטברות התא לתא.
לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של מאגר קיבוע ומערבל בעדינות את הצינור. דגרו את הדגימות בשייקר מסלולי. השעו מחדש את הגלולה על מנת למזער הצטברות תא לתא, מה שעלול להפריע להדמיית התאים.
לאחר הדגירה, גלולה את התאים, הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר אחד של 1XPBS. העבירו מתלים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה תחתונים חרוטיים בנפח 1.8 מיליליטר. גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה.
התחל את חדירת החיידקים על ידי הסרה זהירה של הסופרנטנט. השתמש בפיפטות בנפח קטן כדי להסיר את כל הנוזל מחוץ לגלולה. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במים שטופלו ב-300 מיקרוליטר DEPC.
הוסף 350 מיקרוליטר אתנול מוחלט בדרגה גבוהה וערבב את התמיסה בעדינות על ידי היפוך הצינור. מוסיפים עוד 350 מיקרוליטר אתנול ומערבבים שוב. לאחר מכן סובב את הדגימה עם מסובב הצינור ב -20 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר.
גלולה את התאים מהחדירה. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה של 20% לדגימות.
השאירו אותם עומדים מספר דקות. לאחר מכן, תאי גלולה על ידי צנטריפוגה למשך שבע דקות ב-750 גרם וארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט בעדינות רבה והשתמש בפיפטות בנפח קטן כדי להסיר את כל הנוזל מחוץ לגלולה.
לאחר מכן הוסף את תמיסת המלאי של ערכת בדיקת האוליגונוקלאוטיד למאגר ההכלאה כך שריכוז האוליגונוקלאוטיד הסופי יהיה 250 ננו-מולרי ומערבל את הצינור במרץ. השעו את הדגימות ב-50 מיקרוליטר של מאגר הכלאה המכיל את בדיקות האוליגונוקלאוטיד, תוך הימנעות מיצירת בועות. השאירו את הדגימות למשך הלילה, בחושך, על גוש חום בחום של 30 מעלות צלזיוס.
להכנת כביסה, השג צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש אחד עבור כל דגימה לתמונה. הוסף מאגר כביסה מיליליטר אחד לכל צינור. הוסף 10 עד 15 מיקרוליטר מהדגימות ההיברידיות לצינור החדש המכיל את מאגר הכביסה.
גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט. שוטפים את הדגימות פעמיים נוספות.
השעו מחדש את הגלולה במאגר כביסה של 25 מיקרוליטר. הכן ג'ל אגרוז על ידי הוספת 150 מיליגרם אגרוז ל-10 מיליליטר של מאגר SSC 2X. מיקרוגל את התמיסה למשך 10 עד 15 שניות בכל פעם, עד שהאגרוז נמס לחלוטין.
לאחר מכן הניחו את הצינור בצד להתקרר מספר דקות. לאחר מכן, הנח מסגרת סיליקון מפרידה על השקופית כך שמרכז השקופית יישאר חשוף. הנח טבעת קשיחה ברוחב 10 מילימטר ובעובי מילימטר אחד עד שניים במרכז השקופית.
הפקידו כמות קטנה של ג'ל במרכז לאיטום והמתינו מספר דקות עד שהג'ל יתקשה. לאחר מכן מוסיפים עוד ג'ל, עד שנוצרת צורת כיפה גבוהה. המתן כ -10 דקות עד שהג'ל יתקשה והסר את הטבעת.
הפקידו 10 מיקרוליטר של תאי חיידקים שוטפים על הג'ל ואטמו אותו עם שקופית החלקה של כיסוי מספר אפס. שמור את הדגימה בחושך כדי למנוע הלבנת תמונות. מדידות smFiSH של תאי E.coli מראות את רמת האינדוקציה של galK בתגובה לריכוזי D-fucose חוץ-תאיים משתנים.
אות הרקע מוצג על ידי זן galK שנמחק, או דלתא galK JW0740 כבקרה שלילית. כתמים רבים נראים ברוב התאים. מתאים לתעתיקי galK בודדים או מעטים כאשר מוסיפים שני מילי-פוקוז מילי-מולרי לתרבית החיידקים.
ואילו כמה כתמים נראים בהיעדר D-fucose חוץ-תאי. דוגמה נוספת ליישום פרוטוקול זה מסופקת על ידי הגן sodB, עם תמונות פלואורסצנטיות וניגודיות פאזה של smFiSH בסוג פראי או זן שנמחק JW1648 sodB. דגימות שהוכנו בפרוטוקול זה עשויות להיות מצולמות גם באמצעות STORM המאפשר דיוק מדויק של תמלילים בתא.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המערכתית לחקור את הסטטיסטיקה של אירועי שעתוק בתאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב היד מתאר שיטה לסימון תמלילי RNA שליח (mRNA) בודדים עם בדיקות DNA מסומנות בפלואורסצנטיות לשימוש בניסויי הכלאה in situ של פלואורסצנציה של מולקולה יחידה (smFISH) ב- E. coli. טכניקה זו מאפשרת איתור, לוקליזציה וכימות סימולטניים של מולקולות mRNA בודדות בתאים קבועים בודדים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של מערכות
- ביולוגיה תאית
רקע
- הכלאה in situ של פלואורסצנציה של מולקולה יחידה (smFISH) היא שיטת הדמיה חזקה.
- שיטה זו מאפשרת את המחקר של תהליכי תעתיק ברמת התא היחיד.
- הבנת הלוקליזציה והכימות של mRNA חיונית לביולוגיה של מערכות.
- E. coli משמש כאורגניזם מודל לניסויים אלו.
מטרת המחקר
- לסמן תמלילי mRNA בודדים ב- E. coli.
- להדמית את הלוקליזציה של mRNA באמצעות בדיקות DNA מסומנות בפלואורסצנטיות.
- להעמיק את ההבנה של השונות התעתיקית בין תאים.
שיטות ששימשו
- גידול E. coli MG1655 במדיום LB למשך לילה.
- דילול תרבית הלילה במדיום טרי.
- מדידת צפיפות אופטית כדי לוודא תנאי גידול נאותים.
- יישום בדיקות DNA מסומנות בפלואורסצנטיות לניתוח smFISH.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של תמלילי mRNA בודדים.
- הדמיה של לוקליזציה של mRNA בתאים קבועים.
- כימות של תהליכי תעתיק ברמת המולקולה היחידה.
- תובנות לגבי השונות בין תאים בביטוי תמלילים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חזקה לחקר דינמיקת ה-mRNA.
- היא תורמת מידע חשוב לתחום ביולוגיה של מערכות.
- הטכניקה יכולה לשמש לשאלות מחקר שונות בנוגע לביטוי גנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
