האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה

המטרה הכוללת של מחקר זה, היא ייצור חזק וניתן לשחזור של פיגום אוסטאוגני על ידי צימוד מכוון אתר וקוולנטי של וריאנט BMP2 שתוכנן לאחרונה על ידי כימיה בקליק. שיטה זו יכולה לעזור להתגבר על בעיות הקשורות לטכניקות נפוצות לטיפול באי ריפוי של פגמים בעצמות ארוכות. שיטות ספיגה או אנקפסולציה דורשות כמויות סופר פיזיולוגיות של BMP2 המעוררות מספר תופעות לוואי חמורות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שימוש בכמויות נמוכות יותר של גרסת ה-BMP2 המעוצבת החדשה המקושרת קוולנטית לפיגומים בצורה מכוונת לצד. להפיץ מושבה בודדת בן לילה ב-50 מיליליטר מדיום LB עם 50 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין ב-37 מעלות צלזיוס. יש לדלל את תרביות הלילה מ-1 עד 20 ל-800 מיליליטר של מדיום מרק נהדר בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

גדל את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס עד להגעה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.7. לאחר מכן הוסף פרופופול L-ליצין לריכוז סופי של 10 מילימולר. לגרום לביטוי גנים על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של מילימולר אחד.

גדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות בשייקר מסלולי ב-180 סל"ד. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את כל התרבות ב 9, 000 פעמים גרם למשך 30 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור החיידקים ב-30 מיליליטר של מאגר TBSE.

שקלו צנטריפוגה ריקה והעבירו את הכדור התלוי מחדש לכוס הריקה. לאחר מכן צנטריפוגה את הגלולה המושעה מחדש ב 6, 360 פעמים גרם למשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושקלו את הכוס עם הגלולה.

הפחיתו את משקל הכוס הריקה כדי לחשב את משקל הגלולה. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במאגר STE. השתמש ב-200 מיליליטר של מאגר STE לכל 10 גרם גלולה.

סוניקציה של המתלה על קרח לפני הצנטריפוגה ב-6, 360 פעמים גרם למשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושקלו את הגלולה. לאחר חזרה על שלבי הסוניקציה והצנטריפוגה ארבע פעמים, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיליליטר של מאגר TBS.

צנטריפוגה ב 6, 360 פעמים גרם למשך 20 דקות. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט ושקלו את הגלולה. השעו מחדש את הגלולה במאגר נוקלאז עם נוקלאז טרי שנוסף באמצעות 10 מיליליטר לגרם גלולה.

דגרו את המתלה למשך הלילה בטמפרטורת החדר על צלחת ערבוב ב -30 סל"ד. למחרת הוסיפו את Triton Buffer למתלים. הנפח של Triton Buffer להוספה תואם לחלק נפח של 0.5 של המתלה.

לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לצנטריפוגה את המתלה בחום של 6, 360 פעמים גרם למשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושקלו את הגלולה. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-TE Buffer באמצעות שמונה מיליליטר לגרם גלולה.

לאחר צנטריפוגה כמו קודם, השליכו את הסופרנטנט ושקלו את הגלולה. כעת השעו מחדש את הגלולה על ידי הוספת ארבעה מיליליטר לגרם של 25 מילי-מולרי נתרן אציטט, PH5, וחמישה מיליליטר לגרם של שישה גואנידיניום כלוריד מולרי עם DTT מילי-מולרי אחד. דגרו את המתלה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על צלחת ערבוב.

לאחר צנטריפוגה ב-75, 500 פעמים גרם למשך 20 דקות, הסופרנטנט מכיל את חלבון ה-BMP2 המונומרי הפרוש. אסוף את הסופרנטנט ורכז תמצית זו לצפיפות אופטית למיליליטר של 20 באמצעות ממברנה חתוכה במשקל מולקולרי של שלושה קילודלטון בתא מרוכז. הוסיפו את המונומרים המרוכזים בטיפות בודדות ל-Renaturation Buffer תוך כדי ערבוב.

ואז דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 120 שעות בחושך. התאם את ה-pH של התמיסה ל-3.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית מרוכזת לפני דיאליזה של התמיסה כנגד חומצה הידרוכלורית מילי-מולרית אחת. רכז את התמיסה הדיאליזה באמצעות קרום חיתוך במשקל מולקולרי של 10 קילודלטון בתא ריכוז.

לאחר מכן, טען את תמיסת החלבון על העמודה המאוזנת, דלל שברים באמצעות שיפוע ליניארי של מאגר B, ואסף שני שברים של מיליליטר. נתח 20 מיקרוליטר מכל שבר על ידי אלקטרופורזה של ג'ל SDS Polyacrylamide ואחריו צביעת Coomassie Brilliant Blue כדי לקבוע את השברים המכילים מונומרים ואת השברים המכילים דימרים. לאחר מכן משוך את הדימר המכיל שברים.

דיאליזה של מאגר הדימר המכיל שברים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כנגד חמישה ליטרים של חומצה הידרוכלורית מילי-מולרית אחת. רכז את המוצר באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי מרוכזת של 10 קילו-דלטון לפני ניתוח המוצר הסופי על ידי צביעה SDS-PAGE ו-Coomassie Brilliant Blue. שלב 20 מיקרומולר מסוג BMP2-K3Plk או BMP2-while המשמש כבקרה שלילית עם 20 מיקרוליטר של חרוזי אגרוז המופעלים על ידי אזיד במאגר תגובה בנפח כולל של 500 מיקרוליטר.

דוגרים שעתיים בטמפרטורת החדר על תערובת מסתובבת ב -20 סל"ד. עצור את התגובה על ידי הוספת ריכוז סופי של חמישה מילימולרי EDTA. דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על מערבל מסתובב ב -20 סל"ד.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב-20,000 פעמים גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ואספו את הסופרנטנטים. לאחר מכן שטפו את הגלולה המכילה את החרוזים עם 1,000 מיקרוליטר של HBS 500 Buffer. צנטריפוגה את הדגימה ב-20,000 פעמים גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ואוספים את הסופרנטנט.

חזור על הליך כביסה זה פעמיים נוספות עם HBS 500 Buffer, שלוש פעמים עם ארבעה מגנזיום כלוריד מולארי, ופעמיים עם PBS, ואיסוף הסופרנטנט בכל פעם. אחסן את החרוזים המשולבים ב-1,000 מיקרוליטר PBS בארבע מעלות צלזיוס. בצע את בדיקת ALP כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי לבצע צביעת ALP, תרבית תאי C2C12 פרומיובלסטיים ב-DMEM עם 10% סרום עגל עוברי וכן 100 יחידות למיליליטר של פניצילין G וסטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה ב-5% פחמן דו חמצני. הזינו תאי C2C12 בצפיפות של 30,000 תאים לבאר במיקרופלטה של 96 בארות. לאחר שנתנו לתאים להיצמד למשך הלילה, הסר את המדיום והוסף 20 מיקרוליטר לבאר של חרוזים מצומדים PMB2-K3PLK.

לאחר מכן מוסיפים 20 מיקרוליטר של 0.4% נקודת התכה נמוכה בכל באר. צנטריפוגה את המיקרו-צלחת 96 באר ב -2, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מוסיפים 80 מיקרוליטר מאותו מדיום.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני למשך 72 שעות. לאחר הדגירה, הסר את המדיום והיזהר לא לנתק את ה-0.4% אגרוז המוצק. הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של פתרון תת-ישר MBT-BCIP שלב אחד.

נתח צביעת פוספטידט אלקליין באמצעות מיקרוסקופ אור מיד לאחר שהצביעה הסגולה מתגלה. השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר וצלם תמונות. הפעילות הביולוגית של גרסת BMP2-K3Plk החדשה מאומתת על ידי אינדוקציה של ביטוי גן פוספטאז אלקליין בתאי C2C12.

הבדיקה במבחנה מראה רמות ביטוי דומות של גן פוספטאז אלקליין הנגרמות על ידי סוג BMP2 או BMP2-K3Plk. חרוזים המצופים ב-BMP2-K3Plk באמצעות תוספת אזיד אלקין ציקלו, מזורז כיסוי, הניבו פלואורסצנטים כאשר הודגרו עם התחום האקולוגי של קולטן BMP 1A. הקישור של קולטן BMP 1A ל-BMP2-K3Plk מאשר את שימור הפעילות הביולוגית לאחר הצימוד.

הפעילות הביולוגית של החרוזים הפונקציונליים BMP2-K3Plk הוכחה על ידי צביעה בתיווך ALP. הצביעה התרחשה רק באותם תאים שהיו במגע ישיר עם החרוזים הפונקציונליים BMP2-K3Plk, מה שמאשר שהחלבון אכן קשור קוולנטית לחרוזים ולא רק נספג. אם החלבון היה משתחרר במצב הספיגה, היה נצפה צביעה מפוזרת יותר במרחקים גדולים יותר, כפי שניתן לראות כאן עבור צביעת פוספטאז אלקליין בטיפול ב-BMP2-K2Plk מסיס.

לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לבטא ולייצר חלבונים פעילים ביולוגית על ידי התרחבות גנטית וכיצד לחבר קוולנטית חלבון בדיוני למיקרוספירות על ידי תגובת כימיה בקליק. יצירת שונות חלבון על ידי התרחבות גנטית מאפשרת, באופן עקרוני, הכנסת חומצת אמינו מלאכותית בכל מיקום של רצף החלבון הראשוני. הכנסת מוטציה לרצף BMP2 יכולה להשפיע על יעילות הקיפול מחדש ויכולה גם לשנות את פרמטרי החלבון.

ייצור BMP2-K3Plk דרש שינוי של השיטה שנקבעה לביטוי של סוג BMP2. ה-BMP2-K3Plk המיוצר הראה פעילות ביולוגית דומה לזו של החלבון הטיפוסי. הגישה שלנו לזיווג קוולנטי של וריאנט BMP2 לחרוזי אגרוז בדיוני על ידי כימיה של קליק יכולה להתממש ביעילות גבוהה, וכתוצאה מכך חרוזים בדיוניים, המבינים התמיינות גנטית במבחנה.

יש להבטיח הגנה סטנדרטית על פי נוהלי מעבדה נאותים.