הבליעה של פלורסנט, חלקיקים מגנטיים לקביעת יכולת ספיגת הנוזלים חרקים
20 בדצמבר 2017
האכלה נוזל חרקים יש את היכולת לרכוש כמויות הנוזלים משטחים נקבוביים דקה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת ישירות את היכולת של חרקים לבלוע הנוזלים משטחים נקבוביים באמצעות פתרונות הזנה עם חלקיקים פלורסנט, מגנטי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך פרמטרים פיזיולוגיים של האכלה בחרקים הניזונים מנוזלים באמצעות תמיסת סוכרוז מעורבבת עם ננו-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנטומולוגיה כגון מבנה, תפקוד, קשרים בין חלקי פה של חרקים ומנגנוני האכלת חרקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו לקבוע אם חרקים מסוגלים לבלוע נוזלים הנמצאים כבריכות או כסרטים נוזליים.
הדגמה זו משתמשת בזבובי בקבוק כחולים מכיוון שיכולות ספיגת הנוזלים שלהם ומורפולוגיה של חלקי הפה מתועדות היטב. ניתן להשתמש בזבובי בית, פרפרי כרוב וחרקים אחרים הניזונים מנוזלים. השיגו גלמי זבובים והניחו אותם בתא סביבתי עם 18 שעות אור ביום ובטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס.
לאחר שהבוגרים יוצאים מהגלמים שלהם אין להאכיל אותם לפני הניסוי. למזון הניסיוני הכינו תמיסת סוכרוז של 20 אחוז עם 0.5 מיליגרם ננו-חלקיקים למיליליטר. לאחר מכן, הכינו תחנת האכלה המורכבת ממניפולטור, מהדק ושלב האכלה.
בשלב ההאכלה, החזיקו את האוכל במגלשה קעורה. כמו כן, הכינו מסנני רשת ניילון שונים ומסנני ממברנה בגדלים שונים של נקבוביות כדי לכסות את המגלשה הקעורה. התחל בעטיפת גופו, רגליו וכנפיו של החרק לנייר טישו מקופל.
השאר רק את חלקי הראש והפה חשופים. תוך כדי כך, שמור על החרק מאובטח על ידי צביטת כנפיו זו לזו. כעת, אבטח את הכנפיים עטופות בנייר טישו בין שתי שקופיות מיקרוסקופ.
ואז מהדק את שתי השקופיות ואבטח את המהדק למניפולטור. לאחר מכן, אבטח את החרק מעל שלב ההאכלה באמצעות המניפולטור. לאחר מכן, הפקידו 30 מיקרוליטר של תמיסת הזנה באמצע המגלשה הקעורה וכסו את התמיסה בפיסת נייר פילטר נקבובית.
הטיפה תתפשט לאורך נייר הסינון ותמלא את הנקבוביות. לאחר מכן, מקם את החרק כך שהאזורים הדיסטליים של חלקי הפה יוכלו ליצור מגע עם נייר הסינון הרטוב כך שניתן להגיע רק לחלק השטוח של המגלשה והחרק לא יוכל להאכיל מהאזור הקעור. כעת, השתמש בסיכת חרקים כדי להאריך את חלקי הפה על נייר הסינון ולאפשר לחרק להאכיל למשך 45 שניות.
אם החרק אינו מביע עניין בהאכלה, החזק את חלקי הפה לנייר הסינון למשך 45 שניות באמצעות הסיכה. זה משלים את פרוטוקול האכלה. לצורך הניתוח, טען שעון של 50 מיליליטר עם מספיק PBS כדי לכסות את גוף החרק.
הגדר זאת יחד עם כל כלי הניתוח במיקרוסקופ. כעת, הסר את החרק מנייר הטישו תוך שמירה על כנפיו סגורות. לאחר מכן, הסר את הראש, הרגליים והכנפיים באמצעות מספריים קפיציים לניתוח מיקרו והנח את בית החזה והבטן לתוך PBS.
כדי לנתח את המעיים, אחזו תחילה בציפורן הבטן הדיסטלית וחתכו את הציפורן בכיוון הקדמי לאורך הצד הצדדי מהקצה האחורי לבית החזה. הקפד במיוחד לוודא שרק הציפורן נחתכת ושתעלת העיכול לא תיפגע. לאחר מכן, הסר את ציפורן הבטן, גוף השומן ומבנים אחרים בעזרת סיכות חרקים עד שרק בית החזה ותעלת העיכול נשארים בזכוכית השעון.
כעת, זהה את היבול. זהו מבנה דמוי שק, הממוקם בסמוך לצומת בית החזה והבטן. במידת הצורך, בצע חתכים נוספים בבית החזה כדי לחשוף את היבול.
לאחר מכן, חתכו את בית החזה שנותר והשאירו רק את תעלת העיכול ואת היבול. כדי לבדוק את נוכחותם של ננו-חלקיקים שנבלעו, התחל בשימוש במלקחיים מנתחים עדינים כדי להעביר את היבול להחלקת כיסוי להדמיה. היזהר כדי למנוע קרע של היבול.
צלם מיד את החיתוך במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך בהגדלה פי 20 באמצעות ערוץ CY3 או ניגודיות פאזה. כדי לזהות ננו-חלקיקים שנבלעו, הניפו מוט ערבוב מגנטי במרחק של כ-10 מילימטרים מהיבול. גרום לכל תנועה קדימה ואחורה להימשך כשנייה אחת.
תוך כדי נפנוף המגנט, הזיזו לאט את שלב ההפעלה כדי לסרוק תנועת ננו-חלקיקים בתוך היבול השקוף כמעט. אם הננו-חלקיקים נמצאים ביבול הם ינופפו ביחד עם מוט הערבוב המגנטי. חרק הניזון מתמיסה ממשטח נקבובי חייב ליצור גשר נוזלי יציב באמצעות חוסר יציבות במישור כדי להתגבר על הלחץ הנימי השומר על הנוזל בנקבוביות.
צפוי שגודל צינור ההזנה של חרק יקבע את גודל הנקבוביות הקטן ביותר שממנו הוא יכול להאכיל. לאחר שחרקים נותחו כדי להעריך אם ננו-חלקיקים נבלעו, חלקי הפה שלהם צולמו כדי למדוד את גודל צינור תעלת המזון. עבור זבובים נמדד קוטר הפסאודו-קנה הנשימה ופתח הפה.
ניתוח של הננו-חלקיקים שנבלעו מצביע על קשר הדוק בין גודל צינור החלק הדיסטלי של הפה, לבין גודל הנקבוביות הקטן ביותר שממנו חרק יכול לאכול. קשר זה אינו נראה עם חלקי הפה הפרוקסימליים. כתוצאה מכך, ספיגת נוזלים עבור דיפטרנים תתרחש תחילה בפסאודו-טרכיאה ולא בפתח הפה ולפעולה הנימים חייב להיות תפקיד חשוב בהאכלה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להאכיל חרקים בתמיסת ננו-חלקיקים, לנתח אותם כדי לבודד את היבול שלהם, ולאחר מכן לבדוק את היבול עבור הננו-חלקיקים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיזהר במהלך הנתיחות. אם היבול נקרע, הוא יכול לשפוך את תכולת הנוזל והננו-חלקיקים ובכך להרוס את הדגימה שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה להערכת יכולות ההזנה בנוזלים של חרקים, תוך התמקדות ספציפית ביכולתם לספוג נוזלים ממשטחים נקבוביים. באמצעות שימוש בתמיסת סוכרוז המעורבבת עם ננו-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים, חוקרים יכולים להפיק תובנות לגבי מנגנוני ההזנה של חרקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אנטומולוגיה
- פיזיולוגיה של חרקים
- מנגנוני הזנה
רקע
- חרקים הניזונים מנוזלים מסוגלים לחלץ נוזלים ממשטחים שונים.
- המבנה והתפקוד של חלקי הפה של חרקים הם קריטיים להבנת התהליך של ההזנה.
- ניתן להחיל שיטה זו על מינים מרובים של חרקים הניזונים מנוזלים.
- זבובים כחולים משמשים בניסוי בשל יכולות ההזנה המתועדות היטב שלהם.
מטרת המחקר
- להערכת הפרמטרים הפיזיולוגיים של בליעת נוזלים בחרקים.
- לבחינת הקשר בין מבנה חלקי הפה לבין יעילות ההזנה.
- לקביעת יכולתם של חרקים לבלוע נוזלים מתוך שלוליות ושכבות דקות (films).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת סוכרוז עם ננו-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים.
- שימוש בזבובים כחולים להדגמה בשל יכולות ספיגת הנוזלים הידועות שלהם.
- הקמת תא סביבתי עם תנאי תאורה וטמפרטורה מבוקרים.
- תצפית ישירה על התנהגות האכלה על משטחים נקבוביים.
תוצאות עיקריות
- הוכח כי חרקים מסוגלים להשקות נוזלים ממשטחים שונים.
- סופקו תובנות לגבי המכניקה של הזנה בחרקים.
- הוכשרה השימוש בננו-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים במחקרי הזנה.
- הודגם פוטנציאל ליישום במיני חרקים אחרים הניזונים מנוזלים.
מסקנות
- שיטה זו יעילה לחקר בליעת נוזלים בחרקים.
- הבנת מנגנוני ההזנה של חרקים יכולה לספק מידע למחקרים אקולוגיים רחבים יותר.
- מחקר עתידי יכול להרחיב את הממצאים באמצעות מיני חרקים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של מנגנוני ספיגת נוזלים בחרקים, ומספקת גישה כמותית להערכת התנהגות האכלה ממשטחים נקבוביים. על ידי קישור המורפולוגיה של חלקי הפה ליכולת ההאכלה התפקודית, היא תומכת בתיקוף מטרות בבקרה על וקטורים ובתכנון ביו-מימטי. הטכניקה מציעה מערכת ניתנת להרחבה ולשחזור לבדיקת הובלת נוזלים ביולוגיים בצינוריות מיקרו הרלוונטיות למחקרי העברת מחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן קשרי מבנה-תפקוד במערכת ההזנה של חרקים כדי לתקף היפותזות ביולוגיות לגבי מנגנוני הובלת נוזלים.
- ערך תפעולי: משתמש בננו-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים כסמן ניתן לגילוי כדי לאשר בליעה מבלי להסתמך על הסקות מבניות עקיפות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של בדיקות הזנה סטנדרטיות באמצעות מסננים בעלי גודל נקבים מוגדר, לצורך כימות ספי העיקר של נוזלים בקרב מיני חרקים שונים.
- ערך תפעולי: מאפשר דימות ברזולוציה גבוהה של התפלגות ננו-חלקיקים בתוך ה-crop באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לקבלת תוצאות מדידה עקביות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במחקרים על וקטורים של מחלות על ידי אימות יכולת ההזנה על מצעים רלוונטיים ביולוגית, ובכך מסייע לקביעת אסטרטגיות התערבות.
- ערך תפעולי: ניתן להתאמה למגוון חרקים הניזונים מנוזלים (למשל, זבובים, פרפרים) כדי לבסס רציפות של פלטפורמת הזנה חוצה-מינים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן תיקוף תפקודי של מנגנוני הזנה לפני ביצוע סריקה ממוקדת מטרה או תכנון התערבות.
- ביולוגיה של הגילוי: בודק ספיגה של נוזלים פיזיולוגיים כדי להבהיר קשרי מבנה-תפקוד בחלקי הפה, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בבחירת המטרה.
- סריקה: מספק פלט כמותי מבוסס דימות (נוכחות ננו-חלקיקים בזקיק המזון) המאפשר בדיקות האכלה השוואתיות בין תנאים או גנוטיפים שונים.
- אנליטיקה: יוצר קריאות האכלה בינאריות חיוביות/שליליות המתואמות לגודל הנקבים, מה שתומך בהחלטות go/no-go מבוססות נתונים בתיקוף המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין בדיקות האכלה במעבדה לבין התנהגות האכלה של וקטורים בעולם האמיתי, ובכך משפר את הערך הניבוי למודלים של העברת מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פרוטוקול דימות להאכלה בננו-חלקיקים הניתן לשימוש חוזר ומיושם על פני מודלים של חרקים ומחקרי תעלות נוזלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ראיות ישירות לבליעת נוזלים, ובכך מגביר את הביטחון במודלים מכניסטיים של תזונת חרקים ורלוונטיות המטרה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הערכת התזונה באמצעות תמיסות מבוקרות של סוכרוז וננו-חלקיקים וגדלי נקבי פילטר מוגדרים, מה שמשפר את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מפחית את ההסתמכות על הסקה תצפיתית, ומאפשר הפחתת סיכונים מהירה ומדויקת יותר של מטרות בתוכניות לבקרת וקטורים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על קיבולת תזונה מאומתת ממצעים רלוונטיים מבחינה סביבתית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בחרקים, בניתוח ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי למנוע קרע בזקיק או איבוד של ננו-חלקיקים.
- תלוי בגישה לננו-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים, למקלות ערבוב מגנטיים ולמיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה עם ערוצי פלואורסצנציה מתאימים.
- מחייב הכנה סטנדרטית של ניירות סינון בעלי גדלי נקבים מדויקים כדי להבטיח עקביות של משטח ההאכלה בין הניסויים.
- נדרשת בקרה סביבתית (23°C, 18 שעות אור) כדי לשמור על פיזיולוגיה והתנהגות האכלה עקבויות של החרקים.
- מוגבל לזקיקים חצי-שקופים לצורך ויזואליזציה יעילה של ננו-חלקיקים; רקמות אטומות עשויות לדרוש שיטות זיהוי חלופיות.
