גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

המטרה הכוללת של מערכת זו היא לאפשר תצפית קלה על מדווחים ביולומינסצנטיים במגוון רחב של תנאים חוץ-תאיים, כולל תחת זלוף מדיה מתמיד. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לצפות בביולומינסנציה לאורך תאים ורקמות מתורבתות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הקלטה מתאים בתנאי מדיה חוץ-תאית וגזים משתנים, דבר שאינו אפשרי ברוב המערכות הקיימות.

למרות שכאן אנו מדגימים טכניקה זו בהקשר של ניסויי קצב צירקדי, ניתן ליישם אותה בקלות על מערכות אחרות הדורשות ביולומינסנציה או רישום פלואורסצנטי על פני טווחי זמן מימים עד שבועות. כדי להתחיל בהליך, זרעים תרבו תאים על צלחות או צלחות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהחד-שכבות הגיעו למפגש של 100%.

מיד לפני הניסוי, השתמשו באינקובטור רכיבה מבוקר מחשב כדי לסירוגין בין 32 ל-37 מעלות צלזיוס כל 12 שעות למשך 72 שעות לפחות כדי לסנכרן את המקצבים התאיים. סנכרון חזק של תנודות צירקדיות תאיות הן בתוך התרביות והן בין תרביות הוא חיוני לשחזור ניסיוני. אנו משיגים זאת על ידי יישום מחזורי טמפרטורה יומיים לפני כל הקלטה המסנכרנים תאים על ידי חיקוי מקצבי טמפרטורת הגוף.

לחלופין, סנכרון פרמקולוגי יכול להיות גם יעיל למדי. לאחר מכן, שלבו 8.3 גרם של אבקת DMEM עם גלוקוז גבוה עם 900 מיליליטר מים טהורים במיוחד. מערבבים את התמיסה למשך 30 דקות כדי להמיס את האבקה במלואה.

לאחר מכן, הוסיפו לתמיסה 50 מיליליטר של 100 גרם לליטר תמיסת גלוקוז, 20 מיליליטר של pH 7.6, תמיסת MOPS מולרית אחת ו -10 מיליליטר של פי 100 תמיסת סטרפטומיצין פניצילין. מערבבים את התערובת במשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 4.7 מיליליטר של תמיסת נתרן ביקרבונט 7.5% וערבבו את התערובת במשך חמש דקות נוספות.

השתמש בחומצה הידרוכלורית או בנתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה-pH ל-7.6 בטמפרטורת החדר. הוסף מים טהורים במיוחד לתמיסה כדי להשיג נפח סופי של ליטר אחד. מסננים את התמיסה דרך פילטר סטרילי של 0.22 מיקרומטר לבקבוק סטרילי.

אחסן את מצע המלאי המסונן בארבע מעלות צלזיוס. מיד לפני ביצוע הניסוי, יש להשלים את הכמות הרצויה של מדיום מלאי עם 10% סרום, 2 מילי-מולרי GlutaMAX, 2% NS21 ומילי-מולרית אחת של לוציפרין. העבירו את מדיום העבודה שנוצר דרך פילטר סטרילי של 0.22 מיקרומטר.

השתמש בתמיסה של חמש טוחנות של נתרן כלורי כדי להתאים את האוסמולליות של מדיום העבודה ל -350 מיליאוסמול. לאחר מכן, מחממים את המדיום עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאחר מכן, כדי להתחיל למקד את מצלמת החממה הביולוגית, פתח את מסנן הצפיפות הנייטרלית המחוממת האטום למים.

בתוכנת המכשיר, הגדר את זמן החשיפה ל-0.2 שניות ואת זמן המחזור הקינטי ל-0.3 שניות. ודא שרווח הכפלת האלקטרונים כבוי, ולאחר מכן סגור את חלון ההתקנה והתחל להקליט וידאו. השתמש בגליל המיקוד כדי לסובב את עדשת המצלמה עד שפריטי הבדיקה על מדף הדגימה המתאים יהיו ממוקדים בבירור.

לאחר מכן, הפסק את הקלטת הווידאו. החלף את מסנן הצפיפות הנייטרלית והסר את פריטי הבדיקה. לאחר מכן, השתמש בלוח הבקרה בחזית החממה הביולוגית כדי להגדיר את רמות החמצן, הפחמן הדו חמצני והטמפרטורה הרצויות לניסוי.

לניסוי לח, מלאו את מגש המים בבסיס החממה. הסר את התאים מאינקובטור תרבית הרקמות והחלף את מדיום התרבות במדיום העבודה שחומם מראש. לניסויים לחים באמצעות נפחים קטנים, אטמו את הלוחות בסרט או סרט חדיר גז.

מניחים את הצלחות בחממה הביולוגית. סגור את החממה והדק את מכסה הדלת כדי לא לכלול אור מהמערכת. לאחר מכן, בתוכנת המכשיר, הגדר את מצב הרכישה לקינטי.

הגדר את זמן החשיפה הרצוי. הגדר הצטברות לסדרה קינטית אחת, אורך למספר הרצוי של מחזורי רכישה וזמן מחזור קינטי למרווח ההדמיה הרצוי. הגדר מהירות הזזה של 4.33 מיקרו-שניות, רווח של אחד ורווח EM של הרמה הרצויה.

לאחר מכן, הגדר את סוג הקובץ לשמירה אוטומטית ל- sif או tiff. תן שם לקובץ השמירה האוטומטית והגדר את נתיב הקובץ שלו. הגדר את סוג קובץ ההדפסה ברקע ל- sif או tiff.

תן שם לאוסף הקבצים והגדר את נתיב הקובץ שלו. סגור את חלון ההתקנה והתחל להקליט נתונים. לאחר סיום איסוף הנתונים, ייבא את ערימת התמונות שנרכשה לתוכנת עיבוד תמונה.

כוונן את הבהירות והניגודיות לצפייה אופטימלית בביולומינסנציה. לאחר מכן, בחר אזורי עניין וייצא את האות הממוצע עבור האזורים שנבחרו. העתק את הנתונים לתוכנת ניתוח להמשך עיבוד.

כדי להתחיל את הניסוי, תאי זרע על שקופיות חד-ערוציות עם מחברי Luer ועומק תעלה של 0.6 או 0.8 מילימטרים. תרבית והכנסת התאים. הכן ומחמם מדיום זילוף DMEM דל גלוקוז מימן פחמתי.

לאחר מכן, חותכים חמישה קטעים של שני סנטימטרים של צינורות סיליקון בקוטר פנימי של מילימטר אחד. חותכים צינורות אתילן טטרפלואורואתילן בקוטר פנימי של 1.2 מטר, 10 ס"מ ו-30 ס"מ. עקר את הצינור עם אתנול 70% ושטוף את הצינור עם PBS סטרילי.

השתמש בצינורות הסיליקון המעוקרים כדי לחבר את צינור ה-ETFE באורך 1.2 מטר למחבר Luer נקבה סטרילי ולמחבר Luer מרפק סטרילי. השתמש במכלול זה כדי לחבר את מזרק מדיום הזלוף לשקופית ריקה. לאחר מכן, החלף את מדיום תרבית התאים במדיום זלוף מחומם מראש.

מלאו מזרק סטרילי של 20 מיליליטר במדיום זלוף שחומם מראש. התקן את צינורות ה-ETFE בגודל 10 ס"מ עם מחברי Luer באמצעות צינורות הסיליקון וחבר את הצינור למגלשה. שטפו שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום זלוף דרך הצינור ומגלשת התעלה.

לאחר מכן, התקן את צינור ה-ETFE בגודל 30 סנטימטר לשקופית הערוץ המכילה את התא. חבר את הקצה החופשי של צינור ה-ETFE בגודל 10 סנטימטר לקצה השני של שקופית תעלת התא כדי ליצור את מערכת הזילוף השלמה. שטפו מיליליטר אחד של מדיום זלוף דרך הצינורות והמגלשות כדי לא לכלול בועות אוויר.

העבר את מערכת הזלוף לחממת הביולומינסנציה. אבטח את המזרק המלא בבינוני הזלוף במשאבת מזרק והיזהר לא לנתק את הצינור. השתמש במשאבת המזרק כדי לשטוף מיליליטר אחד של מדיום זלוף דרך מערכת הזילוף.

הזן את קוטר המזרק במשאבה, והגדר את קצב הזרימה ל -50 מיקרוליטר לשעה. זה חיוני שלא יהיו בועות במערכת הזלוף בתחילת הניסוי מכיוון שהן עלולות לשבש את אות הביו-לומינסנציה. הפעל את המשאבה וסגור מיד את דלת החממה הביולוגית.

הדק את מכסה הדלת כדי לא לכלול אור מהמערכת. לרכוש ולנתח את הנתונים כמתואר עבור תרביות רקמה סטטיות. שש צלחות של פיברובלסטים PER2 LUC הותאמו באמצעות מחזורי טמפרטורה יומיים וצולמו באמצעות אינקובטור ביולומינסנציה.

תמונות מבארות נבחרות נותחו ותפוקת הביו-לומינסנציה כומתה. תאי PER2 LUC צולמו גם בתנאי זלוף כדי להעריך את ההשפעות של מעכב קזאין קינאז על ביטוי PER2 LUC. התוצאות הושוו לתאים שטופלו באותו ריכוז של המעכב בתנאים סטטיים שגילו התארכות מחזור גדולה משמעותית בתנאים סטטיים.

עוצמת התארכות התקופה בתנאי זלוף נמצאה קרובה לזו שנצפתה in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויים ביולומינסנציה סטטיים ומזויפים באמצעות תנין.