זרימת עבודה מקיפה עבור הביטוי מטא אנליזה ATL E3 אוביקוויטין ליגאז ג'ין משפחת גפן וזיהוי הגנום כולו

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג אפיון ממצה של משפחת גנים בצמחים לגישה גלובלית הכוללת הגדרת מבנה הגנים, מוטיבים חלבונים מודאגים, מיקום כרומוזומלי, שכפול גנים ודפוסי ביטוי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בסיווג צמחים במשפחות כגון זיהוי גנומי עולמי של בני משפחה והטרנסקריפטומיה שלהם מספקת זאת באמצעות ניתוח ביטוי גנים. היתרון העיקרי של ההליך כולו הוא לספק רשימה ממצה של שלבי ניסוי להשגת אפיון מלא של משפחת הגנים.

ניתן ליישם הליך זה עבור כל משפחת גנים של כל מין צמחים שלגביו זמינים נתונים גנטיים. יתר על כן, גישה זו מספקת מידע רב ערך לזיהוי מועמדים מעניינים למחקרים פונקציונליים. הדגים את ההליך כולו יהיה פייטרו אריאני מהמעבדה שלי.

פתח את דף האינטרנט של Blast ולחץ על קטע פיצוץ החלבון. בשדה רצף השאילתה, הזן את רצף חומצות האמינו של החלבון שישמש כבדיקה לזיהוי בני המשפחה האחרים. השתמש בחלבון שיש לו את כל התכונות החשובות המאפיינות את המשפחה.

לאחר מכן, בשדה בחר קבוצת חיפוש, בחר את בסיס הנתונים של חלבון הייחוס ואת האורגניזם המעניין. כעת, בבחירת תוכנית השדה, בחר באלגוריתם PSI-BLAST. אם תרצה, לחץ על פרמטרי האלגוריתם כדי להתאים פרמטרים מתקדמים כגון רצף יעד מקסימלי ומטריצת ניקוד.

הערך E הוא הסף, אשר עבור חיפוש זה יורד מ- 005 ל- 001. לחץ על כפתור BLAST כדי להפעיל את הניתוח. מכל הרצפים המציגים התאמות יחסיות לשאילתה, בטל את הבחירה בערכים שברור שאינם שייכים למשפחה.

עשה זאת על ידי לחיצה על הסימון בעמודה בחר עבור PSI-BLAST. לאחר מכן, הפעל איטרציה שנייה של PSI-BLAST על ידי לחיצה על כפתור go. כל הרצפים החדשים שזוהו יודגשו בצהוב.

שוב, בטל את הבחירה של הלהיטים שאינם שייכים למשפחה. המשך בתהליך זה עד שהאלגוריתם לא ימצא שום ערך רלוונטי או שהוא יגיע להתכנסות. לאחר סילוק כל התוצאות החיוביות השגויות, אסוף את רצפי חומצות האמינו בקובץ בפורמט FASTA והעלה את הקובץ לחבילת התוכנה הביו-אינפורמטית.

לאחר מכן, בחר את כל הרצפים המיובאים ברשימה ולחץ על כפתור היישור/הרכבה בסרגל הכלים. לאחר מכן לחץ על יישור מרובה חכם בזוג ובחר יישור שרירים ואישור. היישור יבוצע כעת באמצעות ברירות המחדל. כעת דמיין את לוגו הרצף של היישור ובדוק את הגנים באופן חזותי כדי לחפש תוצאות חיוביות כוזבות.

ניתוח נוסף של פרמטרים ותחומים פיזיקליים של חלבון, התפלגות כרומוזומלית, כפילויות וארגון אינטרונים אקסונים מתוארים בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן נתח את הקשרים בין בני משפחת ATL באמצעות בניית עץ פילוגנטי באיכות גבוהה והגדרת מינוח משפחתי. ראשית, אחזר את רצפי ה-ATL הערביים לאמץ systeliana, הנדרשים כהפניות למינוח גן גפן ענבים, ממסד הנתונים של UmoProt לעיון.

לאחר מכן הכינו קובץ FASTA הכולל את כל רצפי הנוקלאוטידים של גפן הענבים ובני משפחת הגנים Arabidopsis לצורך הניתוח הפילוגנטי. כעת עיין בדף הבית של פילוגניה צרפת ובחר את צינור ניתוח הפילוגניה. לחיצה אחת מתאימה ברוב המקרים, אך במידת הצורך ניתן לבחור הגדרות מתקדמות ספציפיות באמצעות האפשרויות המתקדמות או אפילו ניתוח מותאם אישית לחלוטין באמצעות אפשרויות הא-לה-קארט.

לאחר מכן, הזן שם לניתוח והעלה את קובץ PASTA. לאחר מכן לחץ על שלח כדי להפעיל את הניתוח. אם הליך זה גורם להודעת שגיאה, השלם כל שלב בקו הצינור של חבילת הפילוגניה בנפרד.

ראשית, עבור לדף הבית של תוכנת MUSCLE והעלה את קובץ PASTA. בחר Pearson FASTA כפורמט פלט ושלח. לאחר מכן, הורד את הקובץ בפורמט FASTA והסר את כל המיקומים המיושרים בצורה גרועה.

פתח את כלי שרת G-block, העלה את קובץ ה-FASTA של היישור, בחר DNA כסוג רצף ובחר את המחמירה המתאימה ביותר לניתוח. ליישור משפחת גנים ATL של גפן ענבים, בחר את כל שלוש האפשרויות המוצעות לבחירה פחות מחמירה בגלל סטייה גבוהה ברצף. לאחר מכן לחץ על קבל בלוקים כדי להריץ את הניתוח.

כדי לשמור את התוצאות, לחץ על היישור המתקבל בתחתית דף הפלט וצור קובץ FASTA חדש. בלוקי G מבטלים מיקום מיושר בצורה גרועה באזורים שונים של DNA או יישור דחיפה כך שהוא הופך מתאים יותר לניתוח פילוגנטי. עבור שלב זה, בחירת פרמטרים לא חוקיים עבור קפדנות העמודות היא חיונית כדי להבטיח שהם מהווים אחריות של השלושה.

כדי להשלים את העץ, אנו פונים לדף הבית של Phylogeny France. שם, בחר את צינור הא-לה-קארט ובטל את הבחירה באפשרויות הבאות:יישור מרובה ואוצרות יישור. לאחר מכן, לחץ על צור זרימת עבודה, העלה את קובץ ה-FASTA שנאסף על ידי G-blocks, בחר נוהל אתחול והשתמש בפרמטרים והגדרות ברירת מחדל.

לבסוף, לחץ על שלח כדי להפעיל את הניתוח. זה משלים את התהליך שלב אחר שלב. כעת, לאחר שהעץ הפילוגני נוצר, כווץ את הענפים הנתמכים בצורה גרועה עם ערכי אתחול של פחות מ-70%ואז הורד את התוצאות הסופיות בפורמט Newick להמשך ניתוח.

פרוטוקול הטקסט מספק הוראות להקצאת שם גן על סמך הפילוגניה. עבור פרוטוקול זה, צור קובץ בפורמט טקסט מוקש, קווי, של ערכי ביטוי מנורמלים שנלקחו מספריית ביטוי גנים. ארגן את הערכים עבור כל גן משפחתי תחת אותן שורות תבנית.

לאחר מכן, בצע את הניתוח ההיררכי הדו-אשכולי באמצעות תוכנת מציג מרובת ניסויים. ראשית, העלה את מטריצת נתוני העבודה ובחר את קובץ הטקסט. בחר מערך בצבע יחיד והסר את הסימון מהערת הטעינה כאשר לא מסופק הערה אוטומטית.

בחר בערך הביטוי השמאלי העליון ביותר של התצוגה המקדימה של טבלת הביטויים ולחץ על לחצן הטעינה. לאחר מכן, התאם את הנתונים, החל טרנספורמציה של Log2 ונורמליזציה של גנים/שורות. לאחר מכן הגדר את מגבלת קנה המידה המתאימה.

כעת חשב את האשכולות ההיררכיים. בשדה מיטוב סידור, בחר מטב את סדר עלי הגנים ומטב את סדר העלים לדוגמה. לאחר מכן, בשדה בחירת שיטת ההצמדה, בחר אשכול הצמדה ממוצע ובשדה בחירת מטריצת מרחק בחר מתאם פירסון.

לאחר מכן לחץ על אישור כדי להפעיל את הניתוח. הצג את התוצאות בחלונית השמאלית של החלון וייצא את מפת החום על ידי לחיצה על שמור תמונה בתפריט הקובץ. הגן הדומה ביותר ל-arabidopsis thaliana ATL2, על פי חיפוש BLAST-P, שימש לסקר את בני משפחת ATL בגנום של גפן הענבים.

ניתוח PSI BLAST התכנס לאחר מספר מחזורים וסיפק רשימה של גנים משוערים במשפחת הגנים. הנוכחות של תחום הטבעת הקנונית H2 עבור כל מועמד הוערכה על ידי בדיקה ויזואלית של יישור ה-MUSCLE. זה צמצם את החיפוש ל-96 גנים של גפן ענבים.

ניתוח פילוגנטי של הגנים שזוהו המשווה אותם למשפחת הגנים Arabidopsis ATL שימש למינוח. 13 מתוך 96 ATLs של גפן ענבים קיבלו מזהה ספציפי כאורתולוג גן Arabidopsis ATL. מיפוי הגנים שזוהו לאטלס ביטוי הגנים הגלובלי של גפן הענבים באמצעות ניתוח היררכי דו-אשכולי הראה כי כל 96 מתבטאים ברקמה אחת לפחות וניתן לזהות חמישה אשכולות ביטוי.

גישה דומה יושמה כדי לחקור את ביטוי הגנים הללו בתגובה ללחצים ביוטיים. הייתה מעורבות ישירה של משפחת הגנים ATL בתגובה לזיהום פתוגן עם 62 גנים שהראו אפנון משמעותי בשני מצבים לפחות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתמודד עם התוכנות המשמשות לאפיון משפחת גנים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להגדיר בקפידה את המאפיינים של משפחת גנים נתונה ואת הבדיקה המתאימה המשמשת לזיהוי כל בני משפחת הגנום. בעקבות הליך זה, ניתן לחקור את האבולוציה של משפחת הגנים ואת תפקוד P30 על ידי יצירת עצים פילוגנטיים נוספים המבוססים על מינים מסוימים שאינם המינים הנדרשים לייחוס מינוח משפחות גנים.