Name: יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: למדו מדידת זרמי פרוטונים באמצעות אלקטרודות מיקרו סלקטיביות ו-patch clamping בנוירוביולוגיה. השיטה מאפשרת חקר פעילות NHE ומנגנוני תחבורה יוניים בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות אריק Fishback (אוניברסיטת דה מוין, דה מוין, איווה, ארה ב) לסיוע שלו עם ירי ועריכת הוידאו. תאי פיברובלסט דמוי PS120 stably לבטא NHE3-wt או NHE3-YRK נמסרו באדיבות מאת ד ר מארק במושבים. שבהם (ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של אוניברסיטת, בולטימור, MD, ארצות הברית).

הערה: שני מגברים נדרשים עבור הקלטת הפעילות של מובילי electroneutral על ידי ISE הפניה עצמית בשיתוף עם תיקון מחבר חובק למעקה, מגבר מלחציים תיקון כדי לשמור על התא תצורה של כל תא, (מגבר של impendence גבוהה אלקטרומטר) כדי להקליט הפעילות טרנספורטר באמצעות ISE (ראה טבלה של חומרים). תיקון קלאמפ המגבר מחובר ישירות ללוח הרכישה מסוף. אלקטרומטר קשורה המגבר הדיפרנציאלי מנוצל כדי לסנן ומגבירים את האות. המגבר הדיפרנציאלי מחובר ללוח הרכישה מסוף. Capmeter, תוכנה מלחציים תיקון מפקח על קיבולת תא, שימש מחקרים קודמים20 (ראה טבלה של חומרים). הפתרונות קאמרית זלוף הקלטה נשמרים ב- 37 מעלות צלזיוס.
1. הכנה של מדי סוכר ISEs
<ol><li>משוך את פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט הקוטר החיצוני של 1.2 מ מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה פולר2 .</li>
	<li>פולנית על פיפטה באמצעות את microforge. הקוטר של קצה פיפטה צריכה להיות 2-3 מיקרומטר.</li>
	<li>מקם את פיפטות בעל צנצנת פיפטות עם קצה פיפטה פונה כלפי מעלה (ראה טבלה של חומרים). שים לב: בצע שלבים 1.4-1.6 בשכונה fume כימי מאוורר היטב.</li>
	<li>לערבב את התערובת siliconization המורכבת טיפה 1 (~ 150 µL) של bis (דלמטלמינו) דימתיל silane ו 10 טיפות של tetrachloride פחמן (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>שופכים את התערובת siliconization לתוך הצנצנת וסגור המכסה הדוק.</li>
	<li>דגירה את הצנצנת עם התערובת siliconization במשך 24-48 שעות בשכונה fume כימי בטמפרטורת החדר עד התערובת הוא התאדו לגמרי.</li>
	<li>מילוי רקע פיפטה עם שרף יון סלקטיבי המתאים כדי ליצור עמודה של 2-4 מ מ. הערה: מימן ionophore אני קוקטייל B יכול להיות פעילות NHE לבנייתם הקלטה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>הקש על קצה פיפטה להפיץ שרף סלקטיבית יון עד הקצה, ולמקם את פיפטה בצורה אנכית בתוך המחזיק צנצנת עם קצה פיפטה למטה.</li>
	<li>מתחת למיקרוסקופ ויבתר הקוקטייל שרף הגיע הסוף של הקצה. אם יש צורך, הפעילו לחץ חיובי כדי לדחוף את השרף עד הסוף.</li>
	<li>מילוי החצי-פיפטה עם הפתרון המתאים (~ 100 μL). . הנה, תשתמש 100 מ מ אשלגן ו- 10 מ מ HEPES ב- pH 7.0 אם משתמש ionophore אני קוקטייל B.</li>
	<li>להתחבר את ISE אלקטרומטר ולמקם את קצה ISE בתוך תמיסת אמבט משמש הקלטה. אפס את אלקטרומטר.</li>
	<li>בדיקת ה+-תגובה סלקטיבית ISE על-ידי שינוי ה-pH של התמיסה אמבט. ה ממוצע+-התגובה ISE סלקטיבית היא ~ 58 mV ליחידה של pH.</li>
	<li>מעת לעת להעריך את ההיענות ISE כיול.</li>
</ol>2. הכנת מלחציים תיקון סיליקון עבור הקלטת
הערה: השיטה המתוארת על ידי דונלד Hilgemann במאמרו על ערוץ אחד הקלטה21 מומלץ.
<ol><li>משוך את פיפטות ענק תיקון של נימים זכוכית בורוסיליקט (2.0 mmOD / 1.5 ממ ת. ז)22,232,פולר פיפטה.</li>
	<li>שימוש microforge רכוב על השלב של מיקרוסקופ הפוכה להגיע עם פיפטה רחב עצה (10-22 μm)23. להמיס חרוז (~ 0.5 מ ל) של זכוכית רכה על החוט פלטינה עבה של microforge. הערה: פלטינה חוט עבה יחסית נדרש (~0.5 מ"מ) כדי לבדות פיפטות ענק תיקון.</li>
	<li>מקם את פיפטה תיקון קרוב חרוז זכוכית רכה, ולהחיל חום מלא עד הקצה מתחילה לסגת. החוט פלטינה יעביר מעט לכיוון centerduring חימום.</li>
	<li>לכבות את האש, דחפו את הטיפ פיפטה חרוז זכוכית מרוככת. החוט קירור תמשוך ולשבור את הטיפ פיפטה.</li>
	<li>להחיל מחדש את החום כדי להחליק את הטיפ פיפטה וליצור טיפ פיפטה לקוטר הרצוי. הקוטר של הקצה תלויה בגודל של התא להיות שתוקנה (8-10 μm במחקר זה).</li>
</ol>3. הכנה של תאים
<ol><li>לחמם מלוחים מאגר פוספט (PBS) ללא Ca2 + , Mg2 +, טריפסין-EDTA פתרון מדיום הגידול ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>רחץ תאים פעמיים עם PBS. השתמש 1 מ"ל של המאגר לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ של טריפסין בתאי לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ. הערה: כאשר התאים מתחילים מצוד, נענעי את הצלחת לצרף מבטל את התאים.</li>
	<li>עצרי טריפסין על-ידי הוספת 5 מ ל (כמות לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ) של מדיום הגידול מלאה בתוספת 10% סרום שור בעובר. הערה: זמן התגובה של טריפסין הוא סוג התא התלויים.</li>
	<li>המקום התאים על מטרף עם נדנדה כדי למנוע היווצרות גושים.</li>
	<li>השתמש תאים עבור עד 2 שעות לאחר trypsinization. הערה: הזמן עשויים להשתנות בהתאם לקו תא.</li>
</ol>4. הכנת מערכת זלוף אינטרה-פיפטה
<ol><li>חתך בגודל המתאים של קוורץ אבובים (150 מיקרומטר OD / 75 מיקרומטר ID) כדי להכין את הקו זלוף אינטרה-פיפטה.</li>
	<li>הכנס צד אחד של הצנרת קוורץ טיפ פיפטה µL 200. הדבק את הצנרור קוורץ על הטיפ, לחתוך את הקצה של הקצה עם סכין גילוח חד.</li>
	<li>להתחבר לקו זלוף (קוורץ אבובים דבוק אל קצה) חתיכה קטנה של צינורות סיליקון שישמש מאגר עבור הפתרון זלוף אינטרה-פיפטה.</li>
	<li>להתחבר לאורך צינור סיליקון מזרק כדי ליצור לחץ חיובי.</li>
	<li>הוספה הסוף חינם של הצנרת קוורץ דרך הצינורית פוליאתילן של בעל פיפטה זלוף פורט (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להעריך את הקו זלוף עם הפתרון פיפטה.</li>
</ol>5. אופן ההכנה של פתרונות
<ol><li>להכין פתרון פיפטה בכבדות במאגר הקלטה NHE (115 מ מ אשלגן אספרטט (KAsp), 1 מ"מ EGTA, 0.5 מ מ MgCl2, 10 מ מ ג-ATP, 12.5 מ מ HEPES, צינורות 12.5 מ מ, המגבים 12.5 מ מ ו- 12.5 מ מ MES, pH 6.0 מותאם עם חומצה אספרטית). הערה: להכין את מניות פיפטה פתרון סינון. הוסף Mg-ATP לפני הקלטה.</li>
	<li>להכין פתרון אמבט טרי בכל פעם (140 מ"מ NaCl, מ מ 2 CaCl2, 2 מ מ MgCl2ו- pH טריס-HCl 0.1 מ מ 8.2).</li>
</ol>6. רישום של פעילות טרנספורטר
<ol><li>לשמור על חדר ההקלטה ואת כל הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס, כי פעילות טרנספורטר היא תלוית טמפרטורה.</li>
	<li>מקם את התאים אל החדר הקלטה. חכו עד שהם להוריד לחלק התחתון של החדר, אבל אל תתנו להם לצרף אל התא.</li>
	<li>בחר תא המתאים. למדוד את הקוטר של התא עם עינית מיקרומטר. בחר תאים עם קטרים דומה. הערה: בדרך כלל, תא גדול יהיה השטח התאים ואולי יותר מובילי הביע על קרום פלזמה שלה, וכך גם יש יותר פעילות המשלח. עם זאת, זה לא בהכרח נכון, כמו פעילות טרנספורטר תלוי ספציפית לגבי המעלית ואת סוג התא שנבחנה.</li>
	<li>הר על פיפטה microelectrode יון סלקטיבית כדי micromanipulator, מילוי פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה עם הפתרון תאיים, עליך לוודא כי הפתרון מגיע הטיפ של פיפטה2. הערה: זה עשוי לדרוש הברזים עדין מספר לחסל בועות על חוד פיפטה.</li>
	<li>הר של פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה ראש לשלב אלקטרופיזיולוגיה להגדיר22,2,23. הערה: חשוב לשמור על הבמה ראש על זווית 45 מעלות לציר האופקי, זה מבטיח זווית הכניסה עבור פיפטה מתאים היווצרות של גושפנקה עמיד מאוד.</li>
	<li>החל לחץ חיובי קטן (~ 5 ס"מ H2O) על פיפטה תיקון כדי להקטין את הסיכוי של חוסם את הטיפ, ומניחים אותו בתוך תמיסת אמבט.</li>
	<li>. תפסיק לזוז על פיפטה מלחציים תיקון פעם הטיפ הוא קרוב התא.</li>
	<li>לשחרר את הלחץ חיובי בעוד פיפטה נוגע התא והפעילו לחץ שלילי קלה (~ 5 ס"מ H2O) כדי להשיג &gt; 1000 MΩ (גיגה אוהם) חותם על קרום התא עם התיקון פיפטה23.</li>
	<li>למקם את פיפטה תיקון עם התא באותו מישור מוקד כמו ISE ולהזיז את פיפטה תיקון עם התא בסמיכות ISE (~ 5-10 מיקרומטר)2,5 אלא למנוע ומאפשר את התא כדי לפנות את ISE (איור 1 א').</li>
	<li>להבטיח כי החזקת פוטנציאלי הוא 0 mV.</li>
	<li>קרע את החותם עם סדרת ראספים קצר כדי להשיג את תצורת כל תא.</li>
	<li>להזיז את ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) לאט משמאל או מעלה-מטה כדי להקליט את הפעילות של המשגר (איור 1B).</li>
	<li>להקליט את פסגות לפחות 5-8 (איור 1C, מ- A ל- B).</li>
	<li>החל גל מרובע לפליטת במהלך ההקלטה לעקוב אחר האיכות של החותם, קיבוליות של קרום התא (איור 1).</li>
	<li>להעריך את שטף H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) מן ההבדל בריכוז H+ חינם בין פני השטח תא הפתרון בתפזורת (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> הערה: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> , <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> H+ , מאגר המקדמים של דיפוזיה בהתאמה, BT הוא ריכוז מאגר הכולל, KD הוא קבוע דיסוציאציה של המאגר, r הוא התא רדיוס, ו <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> קובע לשינוי מצב יציב הריכוז של ה מאוגד+ עבור שינוי קטן חינם H+. H+ מציין פרוטון חופשי בתמיסה. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, H+ פלקסים מומרים השטף אלקטרופיזיולוגיות יחידות על-ידי חישוב של מקבילות הנוכחי פלקסים (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday)3,הרשות הפלסטינית5].</li>
	<li>לנרמל את שטף פרוטון השטח תא זה ניתן לחשב את גודל התא או את קיבול הממברנה.</li>
</ol>

<ol><li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiating+SLC+transporter+activity%3A+Emerging+drug+discovery+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li>
<li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na%2FH+exchanger+%28NHE1%29+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na%2F2H+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium%2Fhydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li>
<li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na%28%2B%29%2FP%28i%29+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li>
<li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li>
<li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+extracellular%2C+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243(2009).</li>
<li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+PJS+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).</li>
<li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+mammalian+sodium%2Fproton+exchanger+SLC9+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li>
<li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium%2Fproton+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers%3A+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Nephrol+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li>
<li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9%2FNHE+gene+family%2C+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na%28%2B%29%2FH%28%2B%29+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li>
<li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+intestinal+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li>
<li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19(2001).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li>
<li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na%2B%2FH%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li>
<li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li>
<li>Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHilgemann%2C+DW+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+membrane+patches%3A+improvements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li>
<li>Matsuoka, S., Takeuchi, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatsuoka%2C+S+%22Patch+Clamp+Techniques%22">Patch Clamp Techniques</a>. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Ogden, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoipio%2C+J+%22Microelectrode+Techniques+-+The+Plymouth+Workshop+Handbook%22">Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook</a>. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

למרות הפונקציות מכריע של שנאים, השיטות הזמינות ללמוד את פעילותם הן יעילות ואף לא מתאימות. מגבלה אחת היא כי השיטות הזמינות למדוד תנועה יון מתווכת על-ידי טרנספורטר פעילות בלי להתחשב תנודות בהרכב יון תאיים במהלך ניסוי4. השיטה הציג מבטיחה שליטה מדויקת של יון חוץ-תאית, תאיים יצירות ומציע כלי רב עוצמה עבור שינוי יון תאיים, חלבון, שומנים בדם יצירות3,4,5.
הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול ז...

תחבורה בין יונים מומסים בגבול על פני קרום פלזמה היא חיונית להישרדותו של התאים ומכאן של אורגניזמים1. תחבורה סלקטיבית של יונים, מומסים בגבול מושגת על ידי מערך של חלבונים טרנספורטר וערוץ מיוחדת. מוטציות בחלבונים אלה לעיתים קרובות לגרום מגוון תנאים קליניים, עיבוד טרנספורטר וערוץ חלבונים מטרות אפשריות עבור טיפול תרופתי1. למרבה הצער, הבנת המנגנונים שבבסיס ערוץ וטרנספורטר ורגולציה לעיתים קרובות מוגבל על ידי הגישות לרשות המחקר שלהם פעילות2,3,4.
באופן ספציפי, מסועי בערך תת מתחלקים לשתי קבוצות גדולות בהתאם אם הם לשנות את הפוטנציאל transmembrane תא במהלך ההובלה של מומסים בגבול: מובילי שינוי יון electrogenic [למשל, נתרן-פוספט 2a טרנספורטר משותף (NaPi2a), נתרן סידן מחליף (NCX), וכו '.] או למעליות יון electroneutral ללא שינוי [כגון: מחליף נתרן-פרוטון (NHE), מוביל שיתוף סודיום-כלוריד, NaPi2c, ועוד.]. הפעילות של שני המעמדות של מובילי נחקרו בהרחבה באמצעות קליטת איזוטופים רדיואקטיביים, צבעי פלורסנט ממברנה-permeant2. שתי הגישות להעריך את הפעילות של מובילי על ידי מדידת שינויים בריכוז בצובר יונים ספציפיים cytoplasmic ולאחר שתי השיטות יש מגבלות, כגון רגישות בינונית ו ברזולוציה זמן לקוי השליטה תאיים חצרו. ואכן, הפעילות של מובילי רבים תלויה cytoplasmic ריכוז היונים נשאו (למשל, NHE3, NCX), צפויים שינויים בריכוזים אלה יון יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות המשלח2 , 3 , 5. מדידה מדויקת של מנגנונים אלה בחקיקה מוגבל בשיטות קלאסיות.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, שיטות מלחציים תיקון משמשים כדי לחקור את פעילות המשלח2,6. באופן ספציפי, הפניה עצמית אלקטרודות יון סלקטיבית (ISEs)7,8 בשילוב עם התיקון מחבר חובק למעקה המערכת אפשרה לאחרונה את המדידה של electroneutral טרנספורטר פעילות3,4 , 5. ISEs הם מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. איסה זזים למעלה כדי ורחוק קרום התא בחוזרות אופנה מתנדנדות רשומות שינוי מתח (µV). מתח ההבדלים יכולים להיות מומרים יון השטף ערכים באמצעות שיטה כיול כי חל החוק הראשון של Fick של דיפוזיה2,9. בעוד ISEs משמשים לזיהוי השטף של יונים זז מתוך תאים, שיטת מלחציים תיקון שני תאים שלמים או תצורות הפוכה משמשת לבקרה ההרכב יון פוטנציאליים, תאיים ממברנה. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם3,של שומנים, חלבונים-5.
לסיכום, צדדיות של השיטה מלחציים תיקון לעומת כי של שיטות אחרות כדי ללמוד פעילות המשלח עשה תיקון מחבר חובק למעקה מתאימים על מנת להתגבר על המגבלות נפוצות של השיטות האחרות. השילוב של הכוללות הפניה עצמית ISEs וטכניקות מלחציים תיקון מציעה את האפשרות ייחודי כדי למדוד את הפעילות של מובילי electroneutral בסביבה ניסיוני פיקוח הדוק, לגלות את הרומן biophysical ומולקולרית המאפיינים של קרום התא תחבורה3,4,5. גישה זו שימש בהצלחה ללמוד את הפעילות של NHE. משפחת יונקים חלבונים NHE מזרז ההחלפה נטו electroneutral חוץ-תאית נתרן (Na+) עבור פרוטון תאיים (H.+)10,11 ניצול של הדרגה Na+ פנימה. ביונקים, משפחת חלבונים NHE כולל חלבונים הקשורים 11 (NHE1-9 ו- NHA1-2) של הזרע ספציפי NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a משפחה) נמצאים ubiquitously רוב היצורים החיים של אאוקריוטים פשוטה כדי פרוקריוטים גבוה ומעורבים במגוון של התא חיוני פונקציות10,11, כולל שליטה את ההגנה מליחות תא אאוקריוטים, שמירה על הומאוסטזיס חומצה בסיס וכרך תא, מווסת את ספיגת מלח ומים שונים מיוחדים epithelia10,12,14,15. התפקיד הביולוגי מפתח של NHEs ואת המשמעות של הפונקציות שלהם שנקבע באמצעות מספר מחקרים; עם זאת, מחקרים מעטים חקרו את המאפיינים biophysical ומולקולרית של יונקים NHEs בגלל מגבלות מתודולוגי4. לאחרונה, היישום של הכוללות הפניה עצמית של ISEs במהלך תיקון שלם-תא מחבר חובק למעקה חשפה את הרומן המנגנונים המולקולריים של NHE איזופורמים מוסדר על ידי שינויים ריכוזי יונים, חלבונים, פוספוליפידים3, תאיים 4.
באופן ספציפי, פרוטוקול בתנאי כתב יד זה מתאר את הדרכים ואת הגישות ללמוד את פעילות וויסות של NHE isoform 3 (NHE3), שחקן מרכזי לספיגת נוזלים HCO3– , Cl–, Na+ מברשת קרום הגבול של כליות, מעיים epithelia14,16. תובנה חדשה הבדלים הרגישות של פעילות NHE3 כדי phosphoinositides תאיים (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4.5) P2], phosphatidylinositide 3,4,5-טריפוספט [PI(3,4,5]P3]) הוא דיווח. תא תחבורה חלבונים, כגון ערוצי מובילים, מוסדרים על ידי phosphoinositides17, NHE3 נקשר ישירות P2 PI (4.5) והן P3 PI (3,4,5)18. על סמך הספרות הנוכחי, גם phosphoinositide יכול להיות רלוונטי להסדרת פיזיולוגיים או pathophysiological NHE35,18,19. הממצאים שלנו תומך בתפקידים נפרד PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) בוויסות פעילות NHE3. הבחנה זו התאפשרה בשל היישום של טכניקות ISE בשילוב עם הקלטה מלחציים תיקון כל תא. טכניקה זו מאפשרת גם שליטה על התוכן הסלולר phosphoinositide ויה זלוף תאיים של phosphoinositides שונים במהלך המדידה של פעילות NHE3.

<table><tbody><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td> מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>אלקטרומטר דיפרנציאלי דו-ערוצי (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>מגבר דיפרנציאלי (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Patch Clamp המבוססת על MatLab</td><td>MatLab עם ארגז</td><td></td> כלים לרכישה <td>תוכנת המכסה מומלצת</td></tr><tr><td>מערכת בקרת טמפרטורה ThermoClamp-1</td><td>&nbsp; AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>מחמם בשורה</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה חד ערוץ (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>חבית אחת סטנדרטית בורוסיליקט צינורות זכוכית</td> World <td>Precision Instruments</td><td>1B120F-3&nbsp; &nbsp;</td><td>משמש לאלקטרודות סלקטיביות יונים</td></tr><tr><td>צנצנת אחסון מיקרופיפטה</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>ביס(דימתיל-אמינו)דימתילסילן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>14755-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פחמן טטרכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>319961-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מימן יונופור I - קוקטייל B</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בורוסיליקט קיר דק</td><td>&nbsp; מכשיר סאטר</td><td>B200-156-15</td><td>משמש לפיפטה מהדק תיקון&nbsp;</td></tr><tr><td>זכוכית רכה (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי סיליקה (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>משמש למערכת זלוף תוך-פיפטה</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אספרטט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום-ATP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>פוספטידילינוזיטול(4,5) ביספוספט diC8</td><td>דרג Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>פוספטידילינוזיטול 3,4,5-טריספופט diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום המדידה electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

הובלת יונים דרך קרום התא מבטיחה שליטה בסדר של יון תוכן בתוך ומחוץ לתא שעליו היא הכרחית להישרדות התא. מנגנונים אלה התחבורה הם מתווכת על-ידי הפעילות של חלבונים מוביל מתמחה. באופן ספציפי, pH dynamics דק נשלטים על ידי מערכות ההבלטה קרום פלזמה פרוטונים (H.+), כגון Na+/H+ מחליף (NHE) חלבון המשפחה. למרות המאמצים ללמוד המנגנונים NHE תקנה, ההבנה הנוכחית שלנו של המאפיינים biophysical ומולקולרית של משפחת NHE זה לא מספיק בשל המוגבל של שיטות למדוד ביעילות NHE פעילות . כתב יד זה, השתמשנו H+-אלקטרודות סלקטיבית במהלך כל-תא תיקון הקלטה clamping כדי למדוד את השטף הנוצרות על-ידי NHE H+ . אנחנו הציע גישה זו כדי להתגבר על כמה מגבלות של בדרך כלל השתמשו בשיטות למדידת פעילות NHE, כגון ספיגת רדיואקטיבי permeants ממברנה פלורסנט. מדידה של פעילות NHE באמצעות השיטה המתוארת מאפשר רגישות גבוהה, זמן רזולוציה ובקרה יעיל יותר של ריכוזים H+ תאיים. H+-אלקטרודות סלקטיבית הן מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. H+-סלקטיבית אלקטרודה מעבר, הרחק קרום התא בצורה שחוזרת על עצמה, מתנדנדות רשומות שינוי מתח התלויים השטף H+ . בעוד H+-אלקטרודות סלקטיבי משמשים לזיהוי שטף H+ עוזבת התא, השיטה מלחציים תיקון בתצורה שלם-תא משמשת לבקרה ההרכב יון תאיים. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם שומנים. הפעילות מוביל של NHE isoform 3 (NHE3) נמדדה באמצעות גישה טכנית זו ללמוד את הבסיס המולקולרי של תקנה NHE3 על ידי phosphoinositides.

ISE הפניה עצמית במהלך ההקלטה מלחציים תיקון שלם-תא הוחל ללמוד ויסות פעילות NHE3 על ידי phosphoinositides. PS120 תאי פיברובלסט כמו24, שחסרה את הביטוי של קרום פלזמה אנדוגני NHEs, שימשו. NHE3 פראי-סוג (NHE3-wt) או מוטציות NHE3 זה אין איגוד phosphoinositides [טירוזין 501, ארגינין 503, ליזין 505 היו שהוחלפו עם אלנין, R503A/Y501A/K505A (NHE3-YRK)] היו stably לידי תאי פיברובלסט דמוי PS12018.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

השיטה של טלאי ענק בשילוב עם מיקרואלקטרודות סלקטיביות יונים היא שיטה רב-תכליתית המשמשת לאיתור וכימות שטפי יונים. באופן ספציפי, הוא משמש למדידת שטפי הפרוטונים הנוצרים על ידי פעילותו של מוביל היונים האלקטרו-ניטרלי, מחליף הנתרן-מימן או NHE, המתבטא על קרום התא. מחליף הנתרן-מימן מייצר שיפוע של פרוטונים בסמיכות לקרום הפלזמה, המצוין כאן כטבעת כתומה.שיפוע זה של פרוטונים על פני קרום התא נמדד על ידי הקלטת מהדק טלאי תא שלם בשילוב עם טכניקה המשתמשת במיקרואלקטרודה סלקטיבית של פרוטון. המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של הפרוטונים מועברת קרוב לפני התא, שם היא רושמת את שטף הפרוטונים הנעים החוצה מהתאים, המוצג כאן במיקום A.והרחק משטח התא, שם היא רושמת את ריכוז הפרוטונים החופשי הקיים בתמיסה המצוינת על ידי מיקום B.ואז, בחזרה למצב A, קרוב לקרום התא, בתנועה חוזרת ותנודתית. הפרש המתח מ- A ל- B נרשם ותלוי בנציג פעילות ה- NHE.יוני טרנספורטר כגון פרוטונים על פני קרום התא משפיעים על תהליך חיוני לחיים. לכן, שינויים ב-pH מווסתים היטב על ידי מערך של מולקולות, כולל מחליף נתרן-פרוטון, מערכת אי הכללת פרוטונים של קרום פלזמה. מיקרו-אלקטרודת ה-pH המתנודדת בשילוב עם הידוק טלאי תא שלם היא גישה חדשה לחקר שטף הפרוטונים המתווך על ידי פעילות מחליף הנתרן-פרוטון.יישום שיטות אלה מתגבר על כמה מהמגבלות העיקריות של טכניקות המשמשות בדרך כלל למדידת פעילות מחליף נתרן-פרוטון, כגון רגישות מתונה, ורזולוציית זמן ושליטה טובה נוספת בסביבה התוך תאית. אתן הדגמה של השיטות יחד עם שותפי, ד"ר ויקטור באביץ'. ד"ר מתיו הנרי יהיה הקריין.אנו הולכים להדגים יישום של שיטה זו על ידי מדידת הפעילות של מחליף נתרן-פרוטון איזופורם שלוש שהוא מווסת עיקרי של ספיגת מלח במים על פני המעי והאפיתל הכלייתי. המיקרו-אלקטרודות הסלקטיביות של הפרוטונים למדידת ריכוז הפרוטונים מיוצרות מצינורות זכוכית בורוסיליקטיים סטנדרטיים. אלקטרודות זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.2 מילימטר וללא נימה נמשכות בעזרת מושך אנכי, באמצעות פרוטוקול משיכה כפול קונבנציונאלי.מתקבל קצה פיפטה בקוטר שניים עד שלושה מיקרומטרים. הפיפטות מונחות במחזיק צנצנת כשקצה הפיפטה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מכינים תערובת לסיליקון הפיפטות.הוא מוזג לצנצנת והמכסה נסגר היטב. פיפטות מודגרות בתערובת הסיליקון למשך 24 עד 48 שעות. היזהר בזהירות, הקפד להכין את התערובת ולסיליקון את הפיפטות בטמפרטורת החדר באדים כימיים מאווררים היטב.מלאו בחזרה את הפיפטה בשרף סלקטיבי היונים המתאים והניחו אותה בזהירות אנכית במחזיק צנצנת כשקצה הפיפטה פונה כלפי מטה. כדי להתכונן להידוק תיקון, התחל במשיכת פיפטות הידוק תיקון מזכוכית בורוסיליקט בעלת דופן דקה בקוטר חיצוני של שני מילימטרים וקוטר פנימי של 1.4 מילימטרים במושך אנכי באמצעות פרוטוקול משיכה כפולה קונבנציונאלי. השתמש במיקרו-זיוף המותקן על שלב של מיקרוסקופ הפוך כדי ליצור קצה פיפטה רחב.מקם את הפיפטה קרוב לחוט הפלטינה העבה של המיקרו-פורג'. הפעל את החימום באמצעות מתג רגל השולט בהפעלה וכיבוי של הזרם. מחממים את זכוכית נקודת ההיתוך הנמוכה המכסה את אמצע חוט הפלטינה העבה של המיקרו-פורג', ולאחר מכן מקרבים את קצה הפיפטה לזכוכית הרכה המומסת.החימום מזיז את חוט הפלטינה מעט לכיוון המרכז. חוט הפלטינה חוזר למצב ההתחלתי וקצה הפיפטה נשבר. חזור על ההליך עד לקבלת קוטר הקצה הרצוי ולבסוף, הפעל חום כדי להחליק את הקצה.קצות הפיפטה בקוטר 10 מיקרומטר לאחר ליטוש עם המיקרו-פורג'. השימוש בחוט הפלטינה העבה הוא יתרון בכך שיש התרחבות מועטה לאחר הפעלת החשמל ופחות אפשרות להתחמם יתר על המידה של החוט והפיפטה בזרם מוגזם. לאחר ניתוק התאים באמצעות טריפסין וחסימת הטריפסיניזציה, התאים נשמרים על שייקר עם נדנדה כדי למנוע היווצרות גושים.זה נעשה עד שעתיים לאחר הטריפסיניזציה. מערך האלקטרופיזיולוגיה מורכב מבקר טמפרטורה לוויסות טמפרטורת התמיסה במערכת הזילוף. כל הניסויים מבוצעים בכ-37 מעלות צלזיוס.ומחליף מסנן אופטי לשליטה בגלגל המסנן להדמיית פלואורסצנטיות. בקר שסתום מערכת זלוף לוויסות הפתיחה והסגירה של שסתומי מערכת הזלוף. ובקר הטמפרטורה לוויסות הטמפרטורה של תא ההקלטה.אוסצילוסקופ לצפייה בצורות גל ומגבר מהדק תיקון. מחשב שבו פועלת תוכנת Capmeter זו. ואלקטרומטר להקלטת אות מיקרו-אלקטרודה סלקטיבית של יונים.ומגבר דיפרנציאלי להגברת האות של האלקטרומטר. מערך האלקטרופיזיולוגיה מצויד גם במיקרוסקופ הפוך עם בקר במה, שני מיקרו-מניפולטורים עם בקרים הממוקמים באתרים השמאלי והימני של המיקרוסקופ, מערכת הזלוף עם מחמם תמיסה מוטבע. לאחר התקנת פיפטת המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של היונים על המיקרומניפולטור, מלא בחזרה את פיפטת הידוק התיקון בתמיסה התוך-תאית.וודאו שהתמיסה מגיעה לקצה הפיפטה. ייתכן שיידרשו מספר ברזים עדינים כדי לחסל בועות בקצה הפיפטה. לאחר מכן התקן את פיפטת ההידוק של התיקון לשלב הראש של מערך האלקטרופיזיולוגיה.העבירו בעדינות תאים בריאים שנראים לתא ההקלטה המלא בנפח מוגדר של תמיסת אמבטיה. חשוב לשמור על שלב הראש בזווית של 45 מעלות לציר האופקי. זה מבטיח זווית כניסה לפיפטה המתאימה ליצירת אטם עמיד במיוחד.בזמן שפיפטת מהדק התיקון מונמכת בתמיסת האמבטיה, הפעל כמות קטנה של לחץ חיובי על הפיפטה כדי להפחית את הסיכוי לחסימת הקצה. בחר תא והתגש אליו עם כמות קטנה של לחץ חיובי. הפסק להזיז את פיפטת מהדק התיקון ברגע שהקצה קרוב לתא.הורד את המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של היונים בתמיסת האמבטיה עד שהיא תהיה אותו מישור מוקד של קצה הפיפטה מהדק התיקון. כאשר הפיפטה ממוקמת במרכז התא, התחל את האיטום על ידי הפעלת כמות קטנה של לחץ שלילי. חותם מגה אוהם מתקבל תוך מספר שניות.ודא שפוטנציאל ההחזקה נשמר על ידי המגבר באפס מילי-וולט. לבסוף, קרעו את קרום התא בסדרה של פולסים קצרים של יניקה והתחילו בהקלטה. באמצעות שיטת הקלטת התיקון הענקית, ניתן להחדיר תמיסות במהירות בפיפטה הזכוכית באמצעות מערכת זלוף תוך-פיפטה כדי לשנות את התוכן התוך-תאי של יונים, שומנים וחלבונים.מקם את פיפטת המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של היונים קרוב לתא המוחזק על ידי פיפטת מהדק התיקון והתחל את התנודה של פיפטת המיקרואלקטרודה הסלקטיבית של היונים על ידי הזזתה אל התא וממנו. יישום טכניקה זו מאפשר לחקור את הוויסות המולקולרי של מחליף הנתרן-מימן. תוך ניצול שיטת מדבקות הענק, ההרכב התוך-תאי של ATP ושומנים שונה על ידי מערכת זלוף תוך-פיפטה.זלוף תוך-תאי של אפיראז, אשר מבצע הידרוליזה של ATP תוך תאי ומפחית את תכולת הפוספואינוזיטיד גרם לירידה של 50% בפעילות האיזופורם של NHE 3. השפעת האפירז על פעילות NHE3 לא התהפכה על ידי זלוף תוך תאי של הפוספואינוזיטיד, PIP2. עם זאת, זה התהפך על ידי הזלוף התוך תאי של הפופואינוזיטיד, PIP3.מדידת פעילות NHE מנצלת את השילוב של שיטות הידוק המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של הפרוטונים והטלאי. זה מאפשר לחקור את הבסיס המולקולרי מאחורי הוויסות הדיפרנציאלי של NHE על ידי פוספואינוזיטידים ומפלי אותות במורד הזרם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד למדוד את הפעילות של מחליף הנתרן-פרוטון באמצעות מיקרו-אלקטרודה pH מתנודדת בשילוב עם כל הידוק תיקון התאים.ודוגמה ליישום אפשרי של השיטות.

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ישנם מכשולים טכניים למדידת שטף זרם דרך תעלות יונים בו זמנית, ועל הבחנה מאוחר יותר מה החלק הנוכחי הטרנסממברני בשל כל סוג ערוץ. כדי לענות על צורך זה, שיטה זו מציגה את הדרך ליצור את עקומת IV של סוגי ערוצים בודדים באמצעות רכיבי תדר ספציפי.

סיכום של Curve ערוץ IV יון באמצעות רכיבי תדר

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

כאן אנו מציגים שיטת אלקטרו מבוססת על ממברנות נתמכות מוצקות עם דגש על היישומים שלה לאפיון של המובילים בממברנה electrogenic.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

פרוטוקולי לולאה סגורה הופכים נפוצים יותר ויותר באלקטרופיזיולוגיה המודרנית. אנו מציגים דרך פשוטה, רב-תכליתית וזולה לביצוע פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים מורכבים בנוירונים פירמידליים בקליפת המוח במבחנה, באמצעות מחשב שולחני ולוח רכישה דיגיטלי.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

החלק הראשון של מאמר זה מראה כיצד לבחור קווי תאים מוטנטיים המבטאים מחליפי Na+/H+ שלפוחיתיים בקרום הפלזמה שלהם. החלק השני מספק פרוטוקולים המבוססים על מדידות pH תוך-תאיות וקליטת יונים מהירה, המשמשים לקביעת סלקטיביות היונים והפרמטרים הקינטיים של מחליפים אלה.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

טרנספורטרים בקרומי התאים מאפשרים הפרדה דיפרנציאלית של יונים על פני קרומי התאים או שכבות התאים וממלאים תפקידים מכריעים במהלך פיזיולוגיה, תיקון ופתולוגיה של רקמות. אנו מתארים את המיקרו-אלקטרודה המתייחסת לעצמה סלקטיבית של יונים המאפשרת מדידה של שטפי יונים ספציפיים בתאים ורקמות בודדות in vivo.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

אנו מדגימים את הייצור, הכיול והתכונות של שני סוגים של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים (דו-חבית וקונצנטרית) למדידת ריכוזי יונים ברקמת המוח. אלה משמשים לאחר מכן בהכנת פרוסת ההיפוקמפוס של העכבר כדי להראות שפעילות מעוררת משנה הן את ריכוזי האשלגן החוץ-תאי והן את ריכוזי הנתרן.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

ב מדידות אלקטרופיזיולוגיות, הנוכחות של דיפוזיה פוטנציאליים מפריע את המידה המדויקת של הפוטנציאל הפוכה על ידי שינוי האלקטרודה פוטנציאליים. באמצעות גשר המלח מיקרו-אגר, ההשפעה של פעפוע פוטנציאליים ממוזער, מה שמאפשר מדידה מדויקת יותר של המצע מספרים תחלופה של חלבוני ממברנה רקומביננטי משוקם.

אלקטרודה מיקרו-אגר מלח גשר ניתוח שיעור תחלופה פרוטון של חלבוני ממברנה רקומביננטי

ננו-בודים הם כלים חשובים בביולוגיה מבנית ומהווים פוטנציאל גדול להתפתחות של מטיפולים. עם זאת, הבחירה של nanobodies עם תכונות מעכבות יכול להיות מאתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM) לסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרי ממברנות אלקטרוגניות.

מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש את היישום של טכניקת כתם מערבית כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2. הפרוטוקול מתאר את חקירת הזרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז Thr906/1007 באמצעות כתם מערבי. כמו כן, שיטות נוספות לאישור פעילות KCC2 מודגשות בקצרה בטקסט זה.

חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

למדו מדידת זרמי פרוטונים באמצעות אלקטרודות מיקרו סלקטיביות ו-patch clamping בנוירוביולוגיה. השיטה מאפשרת חקר פעילות NHE ומנגנוני תחבורה יוניים בתאים חיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

גלה סרטונים נוספים