יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

השיטה של טלאי ענק בשילוב עם מיקרואלקטרודות סלקטיביות יונים היא שיטה רב-תכליתית המשמשת לאיתור וכימות שטפי יונים. באופן ספציפי, הוא משמש למדידת שטפי הפרוטונים הנוצרים על ידי פעילותו של מוביל היונים האלקטרו-ניטרלי, מחליף הנתרן-מימן או NHE, המתבטא על קרום התא. מחליף הנתרן-מימן מייצר שיפוע של פרוטונים בסמיכות לקרום הפלזמה, המצוין כאן כטבעת כתומה.

שיפוע זה של פרוטונים על פני קרום התא נמדד על ידי הקלטת מהדק טלאי תא שלם בשילוב עם טכניקה המשתמשת במיקרואלקטרודה סלקטיבית של פרוטון. המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של הפרוטונים מועברת קרוב לפני התא, שם היא רושמת את שטף הפרוטונים הנעים החוצה מהתאים, המוצג כאן במיקום A.והרחק משטח התא, שם היא רושמת את ריכוז הפרוטונים החופשי הקיים בתמיסה המצוינת על ידי מיקום B.ואז, בחזרה למצב A, קרוב לקרום התא, בתנועה חוזרת ותנודתית. הפרש המתח מ- A ל- B נרשם ותלוי בנציג פעילות ה- NHE.

יוני טרנספורטר כגון פרוטונים על פני קרום התא משפיעים על תהליך חיוני לחיים. לכן, שינויים ב-pH מווסתים היטב על ידי מערך של מולקולות, כולל מחליף נתרן-פרוטון, מערכת אי הכללת פרוטונים של קרום פלזמה. מיקרו-אלקטרודת ה-pH המתנודדת בשילוב עם הידוק טלאי תא שלם היא גישה חדשה לחקר שטף הפרוטונים המתווך על ידי פעילות מחליף הנתרן-פרוטון.

יישום שיטות אלה מתגבר על כמה מהמגבלות העיקריות של טכניקות המשמשות בדרך כלל למדידת פעילות מחליף נתרן-פרוטון, כגון רגישות מתונה, ורזולוציית זמן ושליטה טובה נוספת בסביבה התוך תאית. אתן הדגמה של השיטות יחד עם שותפי, ד"ר ויקטור באביץ'. ד"ר מתיו הנרי יהיה הקריין.

אנו הולכים להדגים יישום של שיטה זו על ידי מדידת הפעילות של מחליף נתרן-פרוטון איזופורם שלוש שהוא מווסת עיקרי של ספיגת מלח במים על פני המעי והאפיתל הכלייתי. המיקרו-אלקטרודות הסלקטיביות של הפרוטונים למדידת ריכוז הפרוטונים מיוצרות מצינורות זכוכית בורוסיליקטיים סטנדרטיים. אלקטרודות זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.2 מילימטר וללא נימה נמשכות בעזרת מושך אנכי, באמצעות פרוטוקול משיכה כפול קונבנציונאלי.

מתקבל קצה פיפטה בקוטר שניים עד שלושה מיקרומטרים. הפיפטות מונחות במחזיק צנצנת כשקצה הפיפטה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מכינים תערובת לסיליקון הפיפטות.

הוא מוזג לצנצנת והמכסה נסגר היטב. פיפטות מודגרות בתערובת הסיליקון למשך 24 עד 48 שעות. היזהר בזהירות, הקפד להכין את התערובת ולסיליקון את הפיפטות בטמפרטורת החדר באדים כימיים מאווררים היטב.

מלאו בחזרה את הפיפטה בשרף סלקטיבי היונים המתאים והניחו אותה בזהירות אנכית במחזיק צנצנת כשקצה הפיפטה פונה כלפי מטה. כדי להתכונן להידוק תיקון, התחל במשיכת פיפטות הידוק תיקון מזכוכית בורוסיליקט בעלת דופן דקה בקוטר חיצוני של שני מילימטרים וקוטר פנימי של 1.4 מילימטרים במושך אנכי באמצעות פרוטוקול משיכה כפולה קונבנציונאלי. השתמש במיקרו-זיוף המותקן על שלב של מיקרוסקופ הפוך כדי ליצור קצה פיפטה רחב.

מקם את הפיפטה קרוב לחוט הפלטינה העבה של המיקרו-פורג'. הפעל את החימום באמצעות מתג רגל השולט בהפעלה וכיבוי של הזרם. מחממים את זכוכית נקודת ההיתוך הנמוכה המכסה את אמצע חוט הפלטינה העבה של המיקרו-פורג', ולאחר מכן מקרבים את קצה הפיפטה לזכוכית הרכה המומסת.

החימום מזיז את חוט הפלטינה מעט לכיוון המרכז. חוט הפלטינה חוזר למצב ההתחלתי וקצה הפיפטה נשבר. חזור על ההליך עד לקבלת קוטר הקצה הרצוי ולבסוף, הפעל חום כדי להחליק את הקצה.

קצות הפיפטה בקוטר 10 מיקרומטר לאחר ליטוש עם המיקרו-פורג'. השימוש בחוט הפלטינה העבה הוא יתרון בכך שיש התרחבות מועטה לאחר הפעלת החשמל ופחות אפשרות להתחמם יתר על המידה של החוט והפיפטה בזרם מוגזם. לאחר ניתוק התאים באמצעות טריפסין וחסימת הטריפסיניזציה, התאים נשמרים על שייקר עם נדנדה כדי למנוע היווצרות גושים.

זה נעשה עד שעתיים לאחר הטריפסיניזציה. מערך האלקטרופיזיולוגיה מורכב מבקר טמפרטורה לוויסות טמפרטורת התמיסה במערכת הזילוף. כל הניסויים מבוצעים בכ-37 מעלות צלזיוס.

ומחליף מסנן אופטי לשליטה בגלגל המסנן להדמיית פלואורסצנטיות. בקר שסתום מערכת זלוף לוויסות הפתיחה והסגירה של שסתומי מערכת הזלוף. ובקר הטמפרטורה לוויסות הטמפרטורה של תא ההקלטה.

אוסצילוסקופ לצפייה בצורות גל ומגבר מהדק תיקון. מחשב שבו פועלת תוכנת Capmeter זו. ואלקטרומטר להקלטת אות מיקרו-אלקטרודה סלקטיבית של יונים.

ומגבר דיפרנציאלי להגברת האות של האלקטרומטר. מערך האלקטרופיזיולוגיה מצויד גם במיקרוסקופ הפוך עם בקר במה, שני מיקרו-מניפולטורים עם בקרים הממוקמים באתרים השמאלי והימני של המיקרוסקופ, מערכת הזלוף עם מחמם תמיסה מוטבע. לאחר התקנת פיפטת המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של היונים על המיקרומניפולטור, מלא בחזרה את פיפטת הידוק התיקון בתמיסה התוך-תאית.

וודאו שהתמיסה מגיעה לקצה הפיפטה. ייתכן שיידרשו מספר ברזים עדינים כדי לחסל בועות בקצה הפיפטה. לאחר מכן התקן את פיפטת ההידוק של התיקון לשלב הראש של מערך האלקטרופיזיולוגיה.

העבירו בעדינות תאים בריאים שנראים לתא ההקלטה המלא בנפח מוגדר של תמיסת אמבטיה. חשוב לשמור על שלב הראש בזווית של 45 מעלות לציר האופקי. זה מבטיח זווית כניסה לפיפטה המתאימה ליצירת אטם עמיד במיוחד.

בזמן שפיפטת מהדק התיקון מונמכת בתמיסת האמבטיה, הפעל כמות קטנה של לחץ חיובי על הפיפטה כדי להפחית את הסיכוי לחסימת הקצה. בחר תא והתגש אליו עם כמות קטנה של לחץ חיובי. הפסק להזיז את פיפטת מהדק התיקון ברגע שהקצה קרוב לתא.

הורד את המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של היונים בתמיסת האמבטיה עד שהיא תהיה אותו מישור מוקד של קצה הפיפטה מהדק התיקון. כאשר הפיפטה ממוקמת במרכז התא, התחל את האיטום על ידי הפעלת כמות קטנה של לחץ שלילי. חותם מגה אוהם מתקבל תוך מספר שניות.

ודא שפוטנציאל ההחזקה נשמר על ידי המגבר באפס מילי-וולט. לבסוף, קרעו את קרום התא בסדרה של פולסים קצרים של יניקה והתחילו בהקלטה. באמצעות שיטת הקלטת התיקון הענקית, ניתן להחדיר תמיסות במהירות בפיפטה הזכוכית באמצעות מערכת זלוף תוך-פיפטה כדי לשנות את התוכן התוך-תאי של יונים, שומנים וחלבונים.

מקם את פיפטת המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של היונים קרוב לתא המוחזק על ידי פיפטת מהדק התיקון והתחל את התנודה של פיפטת המיקרואלקטרודה הסלקטיבית של היונים על ידי הזזתה אל התא וממנו. יישום טכניקה זו מאפשר לחקור את הוויסות המולקולרי של מחליף הנתרן-מימן. תוך ניצול שיטת מדבקות הענק, ההרכב התוך-תאי של ATP ושומנים שונה על ידי מערכת זלוף תוך-פיפטה.

זלוף תוך-תאי של אפיראז, אשר מבצע הידרוליזה של ATP תוך תאי ומפחית את תכולת הפוספואינוזיטיד גרם לירידה של 50% בפעילות האיזופורם של NHE 3. השפעת האפירז על פעילות NHE3 לא התהפכה על ידי זלוף תוך תאי של הפוספואינוזיטיד, PIP2. עם זאת, זה התהפך על ידי הזלוף התוך תאי של הפופואינוזיטיד, PIP3.

מדידת פעילות NHE מנצלת את השילוב של שיטות הידוק המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית של הפרוטונים והטלאי. זה מאפשר לחקור את הבסיס המולקולרי מאחורי הוויסות הדיפרנציאלי של NHE על ידי פוספואינוזיטידים ומפלי אותות במורד הזרם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד למדוד את הפעילות של מחליף הנתרן-פרוטון באמצעות מיקרו-אלקטרודה pH מתנודדת בשילוב עם כל הידוק תיקון התאים.

ודוגמה ליישום אפשרי של השיטות.