Name: לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: למדו לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון ב-Nicotiana benthamiana באמצעות שיטת לוציפראז קומפלמנטציה. שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של אינטנסיביות האינטראקציה בתאי צמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20140919) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31470375), עדיפות אקדמי תוכנית הפיתוח של ג'יאנגסו מוסדות להשכלה גבוהה, צ'ינג Lan הפרוייקט.

1. הכנת הצמחים (8 שבועות)
<ol><li>הכניסו זרעי benthamiana טבק 50 1.5 mL microcentrifuge שפופרת אחת המכילה 1 מ"ל של 5% NaClO ו- 0.1% טריטון X-100 (וי/V) פתרון ולהשאיר למשך 5 דקות לחטא את הזרעים.</li>
	<li>לשטוף את הזרעים במים סטריליים 5 פעמים, להשעות את הזרעים ב 200 µL של מים סטריליים.</li>
	<li>בזהירות המקום בודדים זרעים על גבי המשטח של MS-אגר בינוני (1 l: 1 x מלחי Murashige & Skoog, 10 גרם סוכרוז, pH 5.8 (KOH), 1% אגר) עם טיפים בסדר, חנות צלחות בינוני ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לסנכרן את הנביטה. הערה: כדי למנוע זיהום חיידק, יש לבצע פעולה זו על ספסל נקי. אין צורך לנער את הצינור במהלך עיקור.</li>
	<li>מניחים צלחות בינוניות בתנאים הצמיחה רגילה (22 ° C, 80-90-2µmolm s-1 לבן עוצמת האור) למשך 10 ימים, ולאחר מכן להעביר את השתילים מונבטים לתוך הקרקע. הערה: הקפד להוסיף שורשים שתיל באדמה, לא לעשות נזק שורשי. מכסים את המגש עם שקוף פלסטיק מכסה למשך הלילה כדי לשמור על לחות.</li>
	<li>לגדל צמחים בחדר גדילה מבוקרת על 16 h/8 h/כהה מחזור ו- 70% לחות. בת שבוע 7 צמחים benthamiana ש מוכנים Agrobacteriumtumefaciens חדירה (איור 1א'). הערה: מים צמחים ושליטה מזיקים לפי הצורך כדי לשמור על הצמחים בריא.</li>
</ol>2. ארעי ביטוי עלים (ש ע) Benthamiana (7-10 ימים)
<ol><li>לספק 150 ng של פלסמידים (pEGAD-HA-לוק פקד פלסמיד וקטור ריק, פלסמיד נבנה עבור LCI assay, במקרה זה השתמשנו pCAMBIA1300-Nluc ו- pCAMBIA1300-Cluc לבנייה פלסמיד) לתא המוסמך tumefaciens א זן GV3101 עם שיטת אלקטרופורציה סטנדרטי.</li>
	<li>תרבות tumefaciens א -לוריא-Bertani (LB) אגר בינוני (1 l: 10 גרם NaCl, תמצית שמרים 5 גרם, 10 גרם טריפטון, 1.5% אגר) המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 50 של ריפאמפיצין ב 28 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים. הערה: הבחירה של אנטיביוטיקה תלוי וקטור ואת המתח tumefaciens א בשימוש.</li>
	<li>לחסן אחד יחיד tumefaciens א המושבה של כל צלחת לתוך 3 מ ל LB בינוני נוזלי המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- 50 µg/mL של ריפאמפיצין וללחוץ על סל ד 220-28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה להפיץ תרבית תאים.</li>
	<li>העברת µL 75 של התרבות חיידקי לתוך 15 מ"ל טריים LB נוזלי בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 50 של ריפאמפיצין, לדלל אותה לפי פקטור של 200. התרבות החיידק ב 220 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס במשך כ- 8 שעות, עד OD600 בין 0.5 ל 1.0.</li>
	<li>העברת התרבות נוזלי א tumefaciens 15 mL צנטריפוגה צינורות צנטריפוגה ב g 4,000 x ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להשליך תגובת שיקוע, להשעות את צניפה ב 15 מ"ל של טרנספורמציה פתרון לרחוץ גלולה.</li>
	<li>לסובב את הצינור ב 4,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה פעם נוספת.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 5 מ של טרנספורמציה פתרון ולשמור על 2 h בטמפרטורת החדר. התאם את הצפיפות של תאים tumefaciens א גלולה עם השינוי פתרון עד הריכוז הסופי של יתר600 הוא 0.5, או לערבב שני מדגמים עם נפח שווה עבור אינטראקציות חלבון לזווג הבדיקה.</li>
	<li>לחדור מושעה תאים לתוך 4th ל 7th עוזב עם מזרק needleless 1 מ"ל (איור 1בג). לאחר חדירה, לכסות את הצמחים מיד עם כיסוי פלסטיק שחור ומניחים את המגש באפלה במשך 12 שעות. לאחר מכן, לגדל צמחים כרגיל במשך 2-4 ימים לפני גילוי לוק פעילויות. הערה: בחר עלים בריאים גודל דומה. החדירה של ארבעה אזורים שונים בתוך עלה אחד בסדר גמור</li>
</ol>3. זיהוי פעילות לוציפראז (יום אחד)
הערה: יש שתי דרכים לעקוב אחר פעילות לוציפראז. אחד מבוסס על הדמיה, והשני הוא למדוד באופן כמותי לוציפראז פעילות.
<ol><li>
שיטת הדמיה
	<ol>
<li>ניתוק של עלה הסתנן ולשים את התשמ"ו באמצעי MS-אגר.</li>
		<li>תרסיס luciferin מאגר עובדים על גבי המשטח adaxial עלה עם בקבוק ספריי 50-mL. להשאיר את החומרים באפלה במשך 5 דקות כדי להרוות את כלורופיל האוטומטי-ידי קרינה פלואורסצנטית.</li>
		<li>השתמש תאורה CCD מקורר הדמיה המנגנון (מקורר עד למינוס 30 מעלות) כדי ללכוד תמונות (איור 2). חשיפה הגיש אור השעה 50 מילישניות, זמן הארה זיהוי 1 דקות. הערה: להתאים את הפרמטרים על פי המדריך המכונה. טמפרטורות נמוכות יותר יהיה לשפר את יחס אות לרעש לשיפור איכות התמונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלופין, למדוד לומינסנציה ישירות עם luminometer מסחרי.<ol>
<li>בזהירות לגזור קטעים עלה (כ 0.25 ס מ2) מהאזור הסתננות של העלים (ש ע) benthamiana , לטבול את הדיסק עלה לתוך µL 100 יונים מים בצלחת לבנה 96-ובכן (איור 3).</li>
		<li>להוסיף 10 µL luciferin עבודה מאגר ולהשאיר למשך 5 דקות. לאחר מכן לבצע טיפולים ספציפיים כדי ללמוד את הדינמיקה אינטראקציית חלבון. הערה: לזהות את הפריה חוץ גופית עם luminometer בנקודות זמן שונות כדי להשיג את הדינמיקה פעילות לוציפראז, אשר מייצגים את קינטיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון תחת טיפול מסוים. בשיטה זו יש יתרונות לבדיקת מספר רב של זוגות חלבון בו זמנית. אלה שאינם luminometer מסחרי לבחון את abundances חלבון לוציפראז על ידי תספיג, ולכן מתייחסים quantitively פעילות לוק. אם האור אינו נדרש בהכרח, רק לשמור את הצלחת luminometer ומדידת לומינסנציה בנקודות זמן שונות. אחרת, להעביר את הצלחת לתוך תא הצמיחה במהלך הפער זיהוי. כדי להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, השתמש משכפל ביולוגית לפחות שלושה. אף לוק פעילויות מאזורי חדירה שונים משתנים, דפוסי שינוי שלהם הם עקביים לאחר נורמליזציה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ללמוד ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון, הדירים מתאים במיוחד לגילוי חלבון dynamics אינטראקציה תחת טיפול אקסוגני. הצעד מפתח זה וזמינותו היא חדירה benthamiana ש . כדי להבטיח הצלחה הסתננות, הצמחים להיות בריא מאוד. גורם קריטי נוסף הוא מתי לבדוק פעילות לוציפראז לאחר חדירה. יש תשובה נכונה לשאלה זו. חוקרים מוזמנים לעקוב אחר פעילות לוציפראז ימים שונים לאחר חדירה לשפוט כאשר לוציפראז מתבטא ברמה הגבוהה ביותר, כי ראינו את רמות ביטוי חלבון יציב עם הזמן8.
<p class=...

על מנת לתאם צמיחה עם סביבתו, הצמחים התפתחו אלגנטי איתות המסלולים לחוש, מגלי, ולהגיב רמזים איתות. כמו הרצים במירוץ שליחים, חלבונים הם שחקנים הכרחי צמח מעבר אותות. זה הוכרה נרחב אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) ממלא תפקיד חשוב לקשר סוללרי. זירחון חלבונים, acetylation, והשפלה תלויים כל מגע פיזי בין חלבון המטרה ואנזימים שינוי שלה. לדוגמה, חלבונים משפחה של חלבון (ג'אז) יסמונט צים-תחום אינטראקציה עם גורם שעתוק MYC2, לדכא את פעילות גנים ברמת השעתוק1,2. לאור החשיבות של PPI, חלבון בקנה מידה גדול interactomes בצמחים כבר בחנו לאחרונה3,4,5. תוצאות interactome אלו עוד יותר לחשוף את הרשת רגולטוריות מורכבות מרכזת תאיים מגוונות.
יש כמה גישות הוקמה עבור ניטור PPI. שמרים שני וזמינותו היברידית (Y2H) היא השיטה הנפוצה ביותר לגילוי PPI. Y2H הוא קל לביצוע, מתאים בדיקה מהירה לבדוק אינטראקציות חלבון. Y2H הוא גם משמש לסינון שותפים אינטראקציה לא ידוע עבור ספציפיים החלבון-של-הריבית. עם זאת, מכיוון Y2H מתבצעת לחלוטין בשמרים, זה אינו יכול לשקף התרחיש האמיתי בצמח תאים, מביא תעריפים חיובי כוזב. האסטרטגיה דומה נוספת היא וזמינותו נפתחים. באופן כללי, שני חלבונים הם הביעו מטוהרים מתאי Escherichia coli ו מעורב ואז מתאושש לגילוי אינטראקציות חלבון. למרות ששיטה זו אינה אורכת זמן רב, באפשרותו לקבל ויוו תוצאות האינטראקציה גם. למטרות ויוו אינטראקציה, co-immunoprecipitation (co-IP) הוא וזמינותו הפופולרי ביותר, אשר דורש נוגדן באיכות גבוהה כדי immunoprecipitate החלבון-של-הריבית לא יכול לפסול את האפשרות של להדברה עקיף. יתר על כן, בשל ההליכים ניסויי הסבוכים ב- co-IP, התוצאות בדרך כלל משתנות עם מומחיות בודדים.
מבחני שיחזור כתב מבוסס במידה רבה מראש הזיהוי ויוו PPI. שיטות אלה כוללות פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)6, זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC)7ו את גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה assay (LCI)8. אמנם אלה שלוש גישות יותר co-IP כדי לשקף את ישירה ויוו PPI, סריג, BiFC צריך מיקרוסקופ ספציפי כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית אותות, בקלות לא יכול לכמת את עוצמת האינטראקציה. לעומת זאת, LCI מנצל גחלילית לוציפראז, אשר יווצר מצב לאחר מגיבים luciferin המצע שלה. חשוב יותר, עוצמת PPI יכול להיקבע מהערך של לוציפראז פעילות. לפיכך, LCI מציין לא רק אם שני חלבונים אינטראקציה או לא, אך מספק מידע על הדינמיקות אינטראקציה בעת הטיפול. אמנם יש כמה שיטות הוקמה עבור ניטור אינטראקציה דינמיקה (מבוסס על משטח פלזמון תהודה או תרמו-יציבות משמרות)9,10, גישות אלה דורשות כלים עדינים או תיוג ספציפית. לעומת זאת, LCI קל לבצע ולגלות.
העיקרון של LCI זה החצאים אמינו-מסוף, carboxyl-מסוף של לוציפראז (בשם N-לוק או C-לוק, בהתאמה) היו התמזגו עם חלבון A ו- B, אלה היתוך שני חלבונים היו בו זמנית לידי תאי צמחים. אם חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, להיות מחדש את שני החצאים של לוציפראז להיות אנזים לוציפראז פעיל. לוציפראז פעילות יכול להתגלות עם luminometer או מצלמת CCD. זה לא הכרחי כדי לקבל transformants יציב LCI; הביטוי ארעי מספיקה כדי להשיג תוצאה אינטראקציה באיכות גבוהה.
סוג הטבעת E3 אוביקוויטין ליגאז קונסטיטוטיביות photomorphogenic 1 (COP1) אינטראקציה עם מספר עצום של גורמי שעתוק ומקדם שפלותם דרך ה 26 פרוטאוזום11. כמה גורמי שעתוק, ממוקדות COP1 אלה הם חיוביים לשסתומי פוטומורפוגנזה. באפלה, COP1 מקיים אינטראקציה עם משתיק קול של פיטוכרום A-105 1 (SPA1), אשר מגביר פעילות COP1 E38. לאחר תפיסת האור, photoreceptors ביטל את האינטראקציה COP1-SPA1 לעכב פעילות COP1 ו אז תייצב COP1 סובסטרטים12,13,14. דוגמה זו ממחישה את משמעות ביולוגית לומד PPI וקביעת PPI dynamics.

<table><tbody><tr><td><תמיסת טרנספורמציה חזקה></חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ חומצה מורפולינאתן-סולפונית</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27.8 מ"מ גלוקוז</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ MgCl2&times; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; M אצטוסירינגון</td><td>אולדריץ'</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>לוציפרין מאגר עובד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 מ"מ מלח אשלגן לוציפרין</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0.025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O עד 10 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה assay העלים טבק benthamiana עבור transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

אינטראקציות חלבון-חלבון הם מנגנוני היסוד ממסר אותות ב תהליכים תאיים ביותר; לכן, זיהוי של זוגות אינטראקציית חלבון הרומן וניטור dynamics אינטראקציית חלבון הן עניין מיוחד לחשוף כיצד צמחים מגיבים גורמים סביבתיים ו/או אותות התפתחותית. שפע של גישות פותחו כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, או בתוך חוץ גופית או ויוו. ביניהם, קומפלמנטציה לוציפראז הוקמה לאחרונה הדמיה (LCI) וזמינותו היא השיטה הפשוטה והמהירה על הפגנת ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון. ב הזה assay, חלבון א' או חלבון B הוא התמזגו עם החצי אמינו-מסוף או carboxyl-מסוף של לוציפראז, בהתאמה. כאשר חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, מחדש את שני החצאים של לוציפראז כדי ליצור אנזים לוציפראז פונקציונלי ופעיל. ניתן לרשום לוציפראז פעילות luminometer או של מצלמות-מצלמה. לעומת גישות אחרות, וזמינותו LCI מראה אינטראקציות חלבון-חלבון איכותית והן באופן כמותי. Agrobacterium חדירה טבק benthamiana העלים היא מערכת בשימוש נרחב עבור ביטוי חלבון ארעית. עם השילוב של LCI וביטוי ארעי, גישות אלה מראים כי האינטראקציה הפיזי בין COP1 SPA1 צומצם בהדרגה לאחר הטיפול יסמונט.

שלושה שלבים עיקריים יכול עכישו ב פרוטוקול קומפלמנטציה זה לוציפראז ללמוד חלבון אינטראקציות בויוו, כולל צימוח, טבק חדירה ואת וזמינותו לוציפראז. הצעד המכריע ביותר פרוטוקול זה הוא חדירה נוזלי tumefaciens א לתוך עלים (ש ע) benthamiana (איור 1).
הנה דוגמה של התועלת של טכניקה זו המאשרת יסמונט הפחתת אינטראקציות COP1-SPA1. החצאים אמינו-מסוף, carboxyl-מסוף של לוציפראז היו התמזגו עם ...

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות כמותית אינטראקציות חלבון-חלבון במערכת ביטוי חולפת. מדד זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי עסקאות אותות קוואן, כגון כיצד לנטר כמותית את כיווני חלבון החלבון שלנו לאחר טיפול כימי או סביבתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בלומינומטר או במצלמת CCD כדי לזהות את הפעילות העסיסית, המייצגת את עוצמת כיוון החלבון כך שהתוצאות מדויקות יותר.כדי להתחיל בהליך זה, הוסף מיליליטר אחד של תמיסה המכילה חמישה אחוז נתרן היפוכלוריט ואפס נקודה אחוז טריטון x מאה לצינור מיקרוצנטריפוגה של נקודה וחמישה מיליליטר המכיל זרעים. תנו לתמיסה לנוח חמש דקות כדי לעקר את הזרעים. לאחר מכן, שטפו את הזרעים במים סטריליים חמש פעמים.השעו את הזרעים השטופים במאתיים מיקרוליטר מים סטריליים. בעזרת טיפים עדינים, הניחו בזהירות זרעים בודדים על פני מדיום אגר MS מצופה. אחסן את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים כדי לסנכרן את הנביטה.לאחר מכן, שמור על צלחות בינוניות בתנאי גידול רגילים למשך עשרה ימים. העבירו את השתילים הנובטים לאדמה, והקפידו לא לפגוע בשורשים. מכסים את המגש במכסה פלסטיק שקוף למשך הלילה כדי לשמור על לחות.לגדל צמחים בחדר גידול מבוקר במשך שבעה שבועות, כאשר הם יהיו מוכנים לחדירת agrobacterium tumefaciens. כדי להתחיל, העבירו מאה וחמישים ננוגרם של פלסמידים לזן התאים המוכשר של a-tumefaciens GV3101. מניחים את הצינורות המכילים את תרבית ה-a-tumefaciens בשייקר, ודוגרים במשך ארבע שעות.בעזרת מוט זכוכית, העבירו את התרבית מהצינורות למדיומים של LB. תרבית a-tumefaciens ו-LB agar בינוני ב-28 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים. לאחר מכן, התכוננו לחסן מושבת a-tumefaciens אחת מכל צלחת לתוך צינור משלה המכיל שלושה מיליליטר של מדיום נוזלי LB.יש לנער בטמפרטורה של 280 סל"ד בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להפיץ את התרבות. לאחר מכן, העבירו 75 מיקרוליטר מתרבית החיידקים ל-15 מיליליטר של מדיום נוזלי LB טרי המכיל 15 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין ו-50 מיקרוגרם למיליליטר ריפמפיצין. תרבית את החיידקים ב-220 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס למשך כ-8 שעות עד ש-OD600 הוא בין 0.5 ל-1.לאחר מכן, העבירו את התרבות לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר. צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 4000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את המזרן ב -15 מיליליטר של תמיסת טרנספורמציה.צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 4000 ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, חזור על שלב ההשעיה והצנטריפוגה פעם נוספת. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את המזרן ב -5 מיליליטר של תמיסת טרנספורמציה.הניחו למזרן התלוי לנוח שעתיים בטמפרטורת החדר בתנאים חשוכים. לאחר מכן, הוסף פתרון טרנספורמציה ל-OD600 הוא 0.5 או שלב שתי דגימות עם נפח שווה לבדיקת אינטראקציות חלבון מזווגות. בעזרת מחט של מיליליטר אחד של מזרק, הסתננו לתאים תלויים לעלים הרביעי עד השביעי.לאחר מכן, מכסים מיד את הצמחים בכיסוי פלסטיק שחור למשך 12 שעות. ראשית, צמחים צריכים להיות בריאים מאוד כדי להבטיח הצלחה. שנית, הקפד לא לפגוע בעלים כלשהם במהלך תהליך ההסתננות.שמור את המגש בחושך למשך 12 שעות. לאחר מכן גדל את הצמחים בתנאים רגילים במשך 2 עד 4 ימים לפני שתזהה את פעילות הלוציפראז. כדי להתחיל בשיטת ההדמיה, נתק עלה שהסתנן.מניחים את כל העלון על צלחת מדיום MS agar. בעזרת בקבוק ריסוס של 50 מיליליטר, רססו את חיץ העבודה של לוציפרון על הצד האדאקסיאלי של העלים. לאחר מכן, שמור בחושך למשך 5 דקות כדי להרוות את האוטופלואורסצנציה של הכלורופיל.השתמש במנגנון דמיון CCD מקורר באור נמוך יותר מקורר ל-30 מעלות צלזיוס כדי לצלם תמונות עם זמן חשיפה מלא אור של 50 אלפיות השנייה, וזמן זיהוי זוהר של דקה אחת. לאחר מכן, גזרו שברי עלים מאזור החדירה של עלי N-benthamiana. טבלו את השברים ב -100 מיקרוליטר מים נטולי יונים בבארות של צלחת לבנה בת 96 בארות.הוסף עשרה מיקרוליטר של חיץ עבודה לוציפרון. תנו לצלחת לנוח 5 דקות. לאחר מכן, בצע כל טיפול ספציפי רצוי כדי לחקור את דינמיקת האינטראקציה של חלבונים, ולמדוד את הזוהר ישירות עם לומינומטר מסחרי.מוצגת כאן הדגמה של פעילות עסיסית לייצוג אינטראקציות COP 1 SPA 1. הפעילות העסיסית, המתגלה על ידי זוהר, מצולמת על ידי מצלמת CCD. נראה כי אינטראקציות COP 1 SPA 1 גורמות למוטציית נחושת של לוציפראז פונקציונלי.לאחר מכן נקבעת פעילות הלוציפראז תחת טיפול ביסמין 8 לאורך זמן. נראה כי אינטראקציות COP 1 SPA 1 המיוצגות על ידי פעילות לוציפראז יורדות בהדרגה בחושך. טיפול ביסמין 8 מפחית עוד יותר את האינטראקציות הללו.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע, לאחר שהצמחים מוכנים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על צמחים בריאים. הסתננו לעלים בזהירות וכללו בקרות כראוי.לאחר פיתוחו, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום עסקאות האותות לחקור את הדינמיקה של אינטראקציה בין חלבונים בצורה מהירה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל צמחי טבק, לחדור אגרובקטריה לעלי טבק ולזהות פעילויות עסיסיות.

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג'ין להציג פלסמיד דנ"א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular...

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

סרטון זה מדגים את בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. בבדיקה זו, החלבונים המעניינים מתויגים למקטעים קטנים וגדולים של האנזים לוציפראז. כאשר החלבונים מתקשרים, המקטעים הגדולים והקטנים משתלבים ליצירת קומפלקס אנזימים פעיל, אשר בנוכחות מצע מסוים, משחרר זוהר בהיר שניתן למדוד.

בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בניקוטיאנה benthamiana. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לטיהור והדמיה חזותית של חלבונים רבים המשתמשים כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא הסתגלות למעבדת הוראה פנים אל פנים ווירטואלית במכללה, מתן מחקר מבוסס פרוייקט.

ייצור חלבוני פיוז'ן IgG המתבטאים באופן ארעי בניקוטיאנה

כאן אנו מציגים, שיטה לדמיין היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי BiFC מבוסס FRET-FLIM assay. שיטה זו היא בעלת ערך לחקר מתחמי אינטראקציה בין חלבון חלבון ב- vivo.

קביעת אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים של גורם שעתוק של קופסת MADS וחלבון חיישן סידן על ידי BiFC-FRET-FLIM Assay

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

פרוטוקול זה מתאר את הבחירה של סמנים פלסמודסמליים אופטימליים עבור ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיקוד חלבונים לפלסמודסמאטה במהלך אינטראקציות וירוס-פלסמודסמאטה או הובלה פלסמודסמלית.

ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה

למדו לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון ב-Nicotiana benthamiana באמצעות שיטת לוציפראז קומפלמנטציה. שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של אינטנסיביות האינטראקציה בתאי צמחים.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

גלה סרטונים נוספים