PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון

פרוטוקול זה מציג במבחנה הדמיה לחיות phagocytosis assay כדי למדוד את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. עכברוש מטוהרים האסטרוציטים מיקרוגלייה משמשים יחד עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. שיטה זו ניתן לזהות בזמן אמת קינטיקה היבלעות והשפלה ומספקת פלטפורמה הקרנה מתאימים כדי לזהות גורמים להתכוונן אסטרוציט phagocytosis.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות את קינטיקה של בליעה ופירוק בזמן אמת של תאי גליה, כגון אסטרוציטים ומיקרוגליה, באמצעות הדמיה חיה במבחנה של פגוציטוזיס של סינפטוזומים מצומדים של אינדיקטור pH. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד פגוציטוזיס של תאי גליה מווסתת במוח בריא וחולה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לנטר ולנתח ביעילות את הקינטיקה הפגוציטית בזמן אמת של תאי גליה באמצעות הדמיה חיה של תאים מתורבתים במבחנה.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לסנן גורמים ותרכובות המווסתים את יכולת הבליעה והפירוק של תאי גליה. התחל בצנטריפוגה של דגימות הסינפטוזום המופשרות למשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורה של 21, 092 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר שאיבת הסופרנטנטים, השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של 0.1 נתרן פחמתי מולארי לכל צינור, והוסיפו שני מיקרוליטרים של אינדיקטור pH לכל דגימה לאחר ערבוב יסודי.

לאחר מערבולת עדינה, הגן על התמיסות מפני אור בעזרת כיסויי נייר אלומיניום, והניח את הדגימות בשייקר טוויסט עם תסיסה עדינה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של PBS, או DPBS של Dulbecco, ואסוף את הסינפטוזומים על ידי צנטריפוגה, והשעיה מחדש של הגלולה במיליליטר אחד של DPBS טרי לכל שטיפה. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, השעו מחדש את גלולת הסינפטוזום הלא מתפקדת ב-200 מיקרוליטר של DPBS בתוספת 5% DMSO.

להדמיה חיה של בליעת הסינפטוזום, הסר תחילה את הסופרנטנט מכל באר של תרבית אסטרוציטים משולבת, ושטוף במהירות את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום בסיסי אסטרוציטים חיסוני וחמישה מיקרוליטרים של סינפטוזומים מצומדים של מחוון ה-pH, כמו גם כל גורם נוסף שיכול לווסת פגוציטוזיס של תאי גליה. אפשרו לסינפטוזומים להתיישב בתחתית הבארות ולהיצמד לקולטני פוספטידיל סרין על האסטרוציטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר 40 דקות, השליכו את הסופרנטנטים ושטפו במהירות אך בעדינות את הבארות שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום טרי בתוספת הגורמים המעניינים לבארות המתאימות והעביר את הצלחת למכשיר הדמיה חי. בחר את מיקומי ההדמיה, התאם את המיקוד, זמן החשיפה, הבהירות והספק ה-LED, והגדר את פורמט התמונה, מרווח הזמן ומספר המחזורים הכולל להדמיה חיה כמתאים מבחינה ניסיונית.

לאחר מכן, התחל בהדמיה חיה של ניסויי הפגוציטוזיס. בנקודת הסיום הניסיונית המתאימה, פתח תוכנית ניתוח דמיון וייבא את רצף התמונות של זמן-lapse. המירו את התמונות לגווני אפור של 8 סיביות והפעילו חיסור רקע ברדיוס פס גלגול של 50 פיקסלים.

לאחר מכן, פתח את התוסף Time Series Analyzer V3 וגרור את אזור העניין לתוך התוסף. במנהל אזור העניין, לחץ על הוסף. בתוסף Time Series V3, לחץ על קבל עוצמה כוללת.

לאחר מכן, שמור את התוצאות ושלב את הנתונים. לאחר הכנתם, הסינפטוזומים מבטאים פוספטידיל סרין על הממברנות החיצוניות שלהם, מה שמרמז על אובדן תפקוד, וניתן לזהות זאת על ידי קולטני פוספטידיל סרין על אסטרוציטים ומיקרוגליה. כאשר הסינפטוזומים המצומדים של מחוון ה-pH עוברים פגוציטוזה, הם פולטים פלואורסצנטים אדומים בוהקים.

כדי לכמת פגוציטוזיס של תאי גליה, ניתן למדוד את השטח של אות הקרינה האדום, או האינדקס הפגוציטי. למרות שאסטרוציטים יעילים בפגוציטוזציה של מספר גדול של סינפטוזומים מצומדים עם אינדיקטור pH, מיקרוגליה מהירה יותר בבליעה ובפירוק של הסינפטוזומים. מעניין שגורמים המופרשים באסטרוציטים, הכלולים בתווך מותנה של אסטרוציטים, חיוניים להגברת פגוציטוזיס בתיווך אסטרוציטים ומיקרוגליה.

יתר על כן, אסטרוציטים נוקאאוט MEGF10 של עכברים הראו פגיעה משמעותית ביכולת הפגוציטית בהשוואה לתאים מסוג בר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח וביולוגיה של תאי גליה לחקור את המנגנונים המעורבים באפנון של פגוציטוזיס של תאי גליה כשיטה פוטנציאלית לטיפול בהפרעות נוירולוגיות שונות.