Name: הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: חקור מנגנוני התמalignancy של גידולים בסביבה חומצית באמצעות שיטת תרבית תאית פשוטה. שיטה זו מאפשרת יציבות pH השתייה והשוואה בין מדיומים חומציים שונים לחקר התקדמות סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים חברי החטיבה למדע הגנום של מעבדה ביולוגיה מערכתית, רפואה, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו. אנו מודים במיוחד ד ר ה Aburatani ד ר טי קודאמה, (LSBM, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו), ד ר ק. Tomizuka, ד ר טי יושידה, ד ר א Kunisato (Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ) דיונים מועילים ותמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדען (א) (26710005, טי. או), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (26116711 ו-16 H 01567, טי. או), מענק הסיוע עבור אתגר מחקר גישוש (16K 14605, טי. או) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן, קרן המדע טקדה (טי. או), קרן קוביאשי לחקר הסרטן (טי. או) הפרויקט לחקר הסרטן, האבולוציה טיפולית (P-צור), המחקר המעשי לבקרת סרטן חדשניות של הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED (טי. או).

1. הכנת חומצי תרבות בינוני
<ol><li>
הכנה של שליטה (pH 7.4) ו pH נמוך (pH 6.8) תרבות בינוני
	<ol>
<li>להמיס 4.75 גר' אבקת DMEM בלי-גלוטמין 500 מ ל מים.</li>
		<li>להכין פתרון3 NaHCO 0.33 M בבקבוק לחץ חזק. שים לב: חשוב להשתמש בקבוק לחץ חזק מאז NaHCO3 פולט גז2 CO, כאשר הם מחוממים, תרמית מפורקת.</li>
		<li>אוטוקלב המדיום, פתרון. לאפשר מאגרים אלה להצטנן עד 25 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל-200 מ מגלוטמין, 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין, ו- 50 מ של העובר סרום שור עד 500 מ"ל של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>שליטה (pH 7.4) בינונית, להוסיף 2.4 מ של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט. בינוני נמוך-pH (pH 6.8), הוסיפו 0.6 מ"ל של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות NaHCO3 פתרון צריכה תיקון בהתאם רמת החומציות בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO של החממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, בפעם הראשונה, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט כדי לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO פתרון3 כדי להוסיף DMEM.<ol>
<li>לאסוף את תרבות בינוני מיד לאחר הסרת המנה תרבות החממה2 CO ומדידת רמת ה-pH באמצעות מד pH. לשמור על הטמפרטורה בינוני 37 ° C שימוש באמבט מים במידת הצורך. למדוד את רמת החומציות בינוני שלוש פעמים באופן עצמאי. הערה: NaHCO3 פתרון צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, צריך להיות מוכן טרי כל מדיה. המוצרים הנמכרים בו ניתן להשתמש במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לקטאט-induced או HCl-induced בינונית תרבות חומצי
	<ol>
<li>להוסיף µL 74 של לקטט פתרון או µL 125 של 1 M HCl 100 מ של שליטה בינונית (להכין בשלב 1.1.5).</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות חומצת החלב או HCl פתרון גם צריך להיות מותאם על פי ה-pH בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO חממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם לקטט טורי או HCl ריכוזים כדי לקבוע את הכמות המתאימה עבור התאמת רמת ה-pH הרצוי של המדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קצירת וטיפול בתאי
<ol><li>להתחיל לטפח תאים ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 לפחות שבוע אחד לפני ביצוע ניסויים. הערה: הקווים תא השתמשו במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
	<li>מעבר תאים כאשר הם מגיעים confluency 70-90%. אל תאפשר את התאים להפוך confluent. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים בזמן התרגול היומי.</li>
	<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת 5 מ"ל PBS. האחות של PBS ומוסיפים אנזים התולש כגון 1 מ"ל טריפסין.</li>
	<li>דגירה ב 37 ° C עד התאים מעוגלים, נתחיל לנתק.</li>
	<li>הוסף 5 מ של תרבות בינוני על התאים מנותקת, לנטרל אנזים. העברת התליה תא צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 300 ג' לשאוב תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים תרבות בינונית.</li>
	<li>לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer Trypan-כחול.</li>
	<li>זרע 5.0 x 105 תאים/טוב של מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
	<li>האחות המדיום תרבות, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות חומצי מוכן בסעיף 1. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
</ol>3. RNA בידוד
<ol><li>האחות תרבות בינוני ולשטוף תאים עם 5 מ"ל PBS. לשבש את התאים על-ידי הוספת ריאגנט החילוץ RNA (ראה טבלאות של חומרים).</li>
	<li>לגרד את המאכל לזמן קצר, ואז להסיר הכימית החילוץ RNA עם פיפטה, להפקיד את ה-RNA החילוץ ריאגנט תא lysate לתוך צינור 1.5 מ. יוצאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 250 µL כלורופורם, לנער את הצינור נמרצות תעזוב ס' 15 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואני צנטריפוגה-≥8, 000 g x עבור 5 דקות.</li>
	<li>הסר בזהירות את פאזה מימית באמצעות פיפטה. להשאיר חלק השלב מימית. מקום אחר צינור 1.5 מ.</li>
	<li>מוסיפים אלכוהול איזופרופיל µL 550 לשלב מימית ומערבבים בעדינות. להשאיר בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה במהירות מירבית (≥ 20, 000 x g) במשך 20 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>יוצקים את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף מים מטופלים 1 מ"ל אתנול 75% ב- DEPC. מערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב 8000 g x במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה הנחה אתנול ולתת שכדורי מילה נהדרת.</li>
	<li>להוסיף שמים מטופלים כ- 15-25 µL (בהתאם התשואה) של DEPC כדי בגדר RNA. מערבבים ביסודיות.</li>
	<li>למדוד את הריכוז של RNA מבודדים על ידי מדידת OD-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
</ol>4. cDNA סינתזה
<ol><li>שילוב הרכיבים הבאים בשפופרת תגובת ה-PCR: עד 5 µg הכולל RNA, 1 µL Oligo dT (50 מיקרומטר) או ערבוב אקראי פריימר (60 מיקרומטר), 1 dNTP 10 מ מ µL, ומים ללא נוקלאז כדי הנפח הכולל של 14 µL.</li>
	<li>לערבב, בקצרה centrifuge הרכיבים באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). Denature המדגם RNA/פריימר למשך 5 דקות ב 65 º C. ספין בקצרה (~ 5 s) באמצעות benchtop קטן צנטריפוגה, שים המדגם מיד על קרח לפחות 1 דקות.</li>
	<li>הוסף את המרכיבים הבאים: 4 µL 5 x מאגר שעתוק לאחור, 1 µL רוורס טרנסקריפטאז (200 U/µL), 1 µL RNase מעכב (40 U µL). הערה: דוגמאות ערכות זמינים מסחרית מוצגות בטבלה של חומרים
</li>
	<li>קאפ הצינור, לערבב ולאחר מכן centrifuge בקצרה את תוכן באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). דגירה תערובת התגובה משולב ב 50-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>בטל את התגובה על ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
</ol>5. מדידה של ביטוי גנים חומצה מגיב באמצעות PCR בזמן אמת
<ol><li>לשלב את המרכיבים הבאים בצלחת תגובה 384-ובכן: 1 µL תבנית cDNA, 0.75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X, 0.3 µL 50 מיקרומטר קדימה פריימר, 0.3 µL 50 מיקרומטר הפוך תחל, אנזימים µL 1, µL 2.5 10 x Taq פולימראז מאגר, 2.5 µL dNTP 20 מ מ, 16.65 µL מים. הערה: דוגמה של ערכות זמינים מסחרית מוצגים בטבלה של חומרים. רשימת צבעי יסוד מוצג בטבלה 1. צלחת 96-ובכן התגובה יכול לשמש גם בשלב זה. ניתן להשתמש גם הגששים אחרים (למשל, Taqman בדיקה).</li>
	<li>הגדרת הניסוי ואת התוכנית הבאה של ה-PCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת: 50 º C למשך 2 דקות, מחזור 1; 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1; 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות, 40 מחזורי; 95 ° C 15 s, מחזור 1; 60 ° C 15 s, מחזור 1; 95 ° C 15 s, מחזור 1.</li>
	<li>מקם את הצלחת המכשיר qPCR. הפעלת התוכנית. הערה: קולטנים Upregulation של גנים מגיב pH MSMO1, INSIG1ו- IDI1 נמדד על ידי רמות החלבון.</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue%3A+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li>
<li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Why do cancers have high aerobic glycolysis?</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li>
<li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li>
<li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752(2015).</li>
<li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li>
</ol>

המחבר קונדו הוא עובד של Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ

כאן, אנחנו תיאר מערכת תרבות פשוטה pH חומצי, תהליך ההערכה שלו. השילוב בין שלוש שיטות של acidification בינוני, כלומר, ריכוז ביקרבונט מופחתת, לקטט תוספת תוספת HCl, אפשרו לנו לחקור באופן יסודי את מנגנון ה-pH-תגובה וכדי להשוות את התגובה התאית גידול אחרים תנאים microenvironmental כגון הרעבה היפוקסיה או חומר מזין.
המפתח של שיטה זו הוא לקבוע את המתאים ריכוזי ביקרבונט, לקטט, HCl במדיום תרבות. מדידת רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט בעת ביצוע פעולת שירות זו בפעם הראשונה חשובה לקבוע א...

Microenvironment הגידול משחק תפקידים חיוניים ב התקדמות הגידול, סרטן התא חילוף החומרים1,2,3. תאים סרטניים נחשפים לעיתים קרובות תנאים כמו היפוקסיה, מניעת מזון ו pH חומצי חוץ-תאית (pHe). עם זאת, תפקידו של pHe בהתקדמות הגידול יש לא הובהרו בהרחבה כמו הרעבה היפוקסיה או חומר מזין. PHe ברקמת הגידול יכול להיות חומצי, להגיע בערך pH 6.84,5. ה-pH חומצי נובע הפרשה glycolytic ואנאירוביים של פרוטונים (H.+), חומצת החלב על ידי סרטן מתרבים תאים5,6.
מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי היסטון חומצי pHe-induced deacetylation חמצון חומצות שומן, אקסוציטוזה של lysosomes חומצי עבור התאקלמות9,108,7,חמור החומצית. עם זאת, המנגנונים דרך איזה acidification חוץ-תאית משפיעה על התנהגות סרטן והזהות של מפתח הרגולטורים ב microenvironment הגידול pH חומצי לא מלא נקבעו. יתר על כן, מספר דיווחים מתוארת מדיה pH חומצי שונים באמצעות ריכוזים לא ברור של ביקרבונט, מאגר טריס, צינורות, HEPES או לקטאט HCl, אבל ישנם כמה דיווחים להפגין את היציבות של מנוכי עונתיות בינונית ולא מקיף השוואה של מספר ברורים media תרבות חומצי7,8,9,10
התירי את הרגולטורים מפתח ושינויים מטבוליים בתאי סרטן בהקשר של acidification חוץ-תאית, אנחנו הקימה פשוטה in vitro לקשרי תרבות מודל לשמירה על pHe חומצי ובחן את התפקיד של pHe סרטן תאים11. באמצעות שיטה זו, אנו נשמר אמצעי התרבות חומצי עם pHe של 6.8 ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, באמצעות ריכוז ביקרבונט מופחתת בהמדיום תרבות. pH 7.4 שימש כרגיל ושליטה בינוני. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h במהלך התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. כי גליקוליזה משופרת מאיצה הפרשת לא רק פרוטונים, אלא גם לקטט7,8,9, הקמנו גם שיטה תרבות מחקה חמצת לקטאט-induced על-ידי הוספת חומצת החלב במקום לצמצם ריכוז ביקרבונט. בנוסף, HCl-induced pHe חומצי במדיום מאפשר לנו לשלול את האפשרות כי הסלולר התגובות pH חומצי תרבות בינוני אינם עקב ריכוז מופחתת של ביקרבונט. יתר על כן, באמצעות מדיה שונים עם pH של 6.4-7.4 ריכוז ביקרבונט שונים, שנוכל להעריך את מידת pHe השפעות על תגובות הסלולר.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של דולבקו" ניסוי" 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מעורבת פניצילין-סטרפטומיצין (מיוצבת)</td> <td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5 גרם/l-טריפסין/0.53mmol/l-EDTA תמיסה, עם פנול אדום</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan תמיסת כתמים כחולים</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה לקטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV מערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&nbsp;</td><td>אפלייד ביוסיסטמס</td><td>4368702&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments/strong<></td></tr><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB בנק תאים</td><td></td><td></td>JCRB0432</tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</ ספקטרופוטומטר UV-Vis חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop אחד עם Wi-Fi</td><td>תרמו פישר</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>תרמו פישר</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמת מערכת התרבות ph חומצי חוץ-תאית

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

תנאי microenvironment הגידול, כמו היפוקסיה או מזין רעב, משחק תפקידים חיוניים התקדמות סרטן, גידול ממאיר. עם זאת, התפקיד של pH חומצי חוץ-תאי הגידול תוקפנות, המנגנון הבסיסי שלה לא בהרחבה נחקרה בהשוואה לתנאי רעב ובשפתיים או מזין. בנוסף, שיטה תרבות מוגדרים היטב כדי לחקות את microenvironment חומצי חוץ-תאי הגידול לא מלאה דווחה.
כאן אנו מציגים שיטה תרבות פשוטה במבחנה כדי לשמור על pH חומצי חוץ-תאית באמצעות צמצום ביקרבונט ו לקטט מוגבר או HCl ריכוזים במדיום תרבות. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h בעקבות התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. שלושה תנאים ברורים מדיה חומצי במחקר זה מאוד גנים pH מגיב upregulated כגון MSMO1, INSIG1ו- IDI1 לעומת היפוקסיה או מזין רעב. קולטנים upregulation של גנים אלה יכול לשמש כסמן של pH חומצי. טכניקות פשוטות אלו מועילים התירי מנגנונים הבסיסית של גידול ממאיר תחת microenvironment הגידול חומצי. לכן, מערכת התרבות שלנו pH חומצי חוץ-תאית מאפשרת גילוי של pH חומצי הסלולר תגובות לא רק בתאים סרטניים אלא גם תאים ראשוני, כגון תאים אבובית הכליה, ביחס חומצי הפרעות אחרות כולל, חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת לקטית, חמצת אבובית הכליה ו חמצת נשימתית.

כדי לקבוע ריכוז ביקרבונט המתאים, אנו מוכן DMEM בטווח של 0 - 8 מ"מ NaHCO3 (סופי ריכוז במדיום תרבות), הצליח בהכנת תרבות המדיה עם pH החל 6.4-7.4 (איור 1). הכנו DMEM עם 8 מ"מ NaHCO3 (pH 7.4) שליטה בינוני, ו 2 מ מ NaHCO3 (pH 6.8) כמדיום עם pH חומצי לפי הדוח הקודם וקבע כי ה-pH חוץ-תאית מגיע ל- pH 6.8 עבור גידולים מוצקים4,5. ה-pH של המדיום חומצי. הנמשכת במשך 24 שעות ביממה, וה...

Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

המטרה הכוללת של שיטת תרבית חוץ גופית פשוטה זו היא להבהיר את המנגנונים הבסיסיים של ממאירות הגידול תחת מיקרו-סביבת גידול חומצית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הגידול, כגון המנגנון הבסיסי של התקדמות הסרטן וממאירות בתגובה למיקרו-סביבת הגידול. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם יציבות ה-pH הבינוני והיכולת להשוות בין מספר מדיות pH חומציות.ההשלכה של טכניקה זו התרחבה לטיפול לא רק בסרטן אלא גם כהפרעות חומציות מכיוון שחמצת יכולה להיות קשורה לסוגים שונים של מחלות. כדי להתחיל, ממיסים 4.75 גרם של כוח DMEM עם L-גלוטמין ב-500 מיליליטר מים. הכינו גם תמיסת נתרן ביקרבונט 0.33 מולרית בבקבוק אטום ללחץ.חיטוי המדיום והפתרון. לאחר שאפשרתם למאגרים אלה להתקרר ל-25 מעלות צלזיוס, הוסיפו חמישה מיליליטר של 200 מילי-מולרי L-גלוטמין, חמישה מיליליטר פניצילין-סטרפטומיצין ו-50 מיליליטר סרום בקר עוברי ל-500 מיליליטר DMEM ללא ביקרבונט. למדיום בקרה, הוסף 2.4 מיליליטר של תמיסת נתרן ביקרבונט 0.33 מולרית לכל 100 מיליליטר DMEM ללא ביקרבונט.עבור המדיום בעל ה-pH הנמוך, הוסף 0.6 מיליליטר של תמיסת נתרן ביקרבונט 0.33 מולרית לכל 100 מיליליטר DMEM ללא ביקרבונט. לאחר מכן, הוסף 74 מיקרוליטר של תמיסת לקטט ל-100 מיליליטר של מדיום בקרה כדי להכין את המדיום החומצי המושרה על ידי לקטט. כדי להכין את מדיום התרבי

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אאוקריוטים חיידקים הם גם מקור של פחמן photosynthetically הנגזרות ואת הדף מינים טורפים ב לצמיתות מכוסי קרח אגמים אנטארקטיקה. דו"ח זה מתאר תרבות והעשרה הגישה לבודד מטבולית אאוקריוטים חיידקים צדדי מן האגם אנטארקטיקה, אגם בוני, ומעריך את הפוטנציאל אורגניים קיבוע פחמן באמצעות assay radioisotope עבור Ribulose-1 ,5-bisphophate פעילות oxygenase (RuBisCO) carboxylase.

הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול להקים מערכת מודל תרבית תאים במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן פקולטטיבי תוך תאי אנושי פטריית קנדידה glabrata עם מקרופאגים אדם אשר יהיה כלי שימושי כדי לקדם את הידע של מנגנוני ארסיות פטרייתי שלנו.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.

ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

החלק הראשון של מאמר זה מראה כיצד לבחור קווי תאים מוטנטיים המבטאים מחליפי Na+/H+ שלפוחיתיים בקרום הפלזמה שלהם. החלק השני מספק פרוטוקולים המבוססים על מדידות pH תוך-תאיות וקליטת יונים מהירה, המשמשים לקביעת סלקטיביות היונים והפרמטרים הקינטיים של מחליפים אלה.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

גליקוליזה היא סמן מטבולי מגדיר במערכות ביולוגיות מרובות. ניטור גליקוליזה על ידי מדידת השטף החוץ-תאי של H+ הוא נפוץ, אך דורש תיקון כמותי וחד משמעי. כאן, אנו מדגימים כיצד לאסוף ולתקן נתוני שטף חוץ-תאי כדי להבחין בין מקורות נשימתיים וגליקוליטיים של החמצה חוץ-תאית.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

אינטראקציות מארח-חיידק מעיים היו העריכו באמצעות גישה מוזרה שילוב קהילה אוראלי סינתטי במבחנה במערכת העיכול עיכול, דגם של האפיתל המעי הדק. אנו מציגים שיטה שבה ניתן להתאים כדי להעריך את התא הפלישה של גורמי מחלה, biofilms מינים רב, או אפילו כדי לבדוק את השרידות של פרוביוטיקה ניסוחים.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

כאן נתאר פרוטוקול להכין ולשמור על תרביות תאים יותרת המוח הראשי של medaka (Oryzias latipes). תנאי ממוטבת פרוטוקול זה להתחשב פרמטרים חשובים כגון טמפרטורה, osmolality ו- pH מאת לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של הדג, ובעקבותיו פיזיולוגית משמעותי יותר תוצאות.

הכנה של תרבות התא העיקרי באיכות גבוהה של דגים Pituitaries

אנו מדגימים שיטה לבודד חברים קשים לגידול של פילום חיידקי הרומן, Saccharibacteria, על ידי סינון פלאק שיניים שיתוף culturing עם חיידקים מארחים.

הקמת תרבויות בינאריות יציבות של סקרייבקטריה סימביוטית מחלל הפה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אבולוציה ניסיוני להסתגלות בתרמופילים המשתמשים בתרמומיקסרים זולים וחסכוניים באנרגיה כאינקובטורים. הטכניקה מודגמת באמצעות אפיון של התאמת טמפרטורה ב Sulfolobus acidocaldarius, ארכיאון עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 75 ° C.

הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון העברת אלקטרונים חוץ-תאית מתווכת (EET) בחיידקי חומצה לקטית באמצעות מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית בעלת שני תאים. אנו מדגימים שיטה זו עם Lactiplantibacillus plantarum ומתווך חמצון-חיזור 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid ומספקים תיאור יסודי של הטכניקות האלקטרוכימיות המשמשות להערכת EET מתווך.

אפיון מעבר אלקטרונים חוץ-תאי מתווך בחיידקי חומצה לקטית עם מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית דו-תאית

חקור מנגנוני התמalignancy של גידולים בסביבה חומצית באמצעות שיטת תרבית תאית פשוטה. שיטה זו מאפשרת יציבות pH השתייה והשוואה בין מדיומים חומציים שונים לחקר התקדמות סרטן.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

גלה סרטונים נוספים