Name: מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: למדו לזהות ביציות עכבר שכשירות להתפתחות באמצעות שיטה לא פולשנית המבוססת על צילום time-lapse ואנליזת רשת עצבית. שיטה זו מאפשרת הערכת איכות הביצית בזמן אמת ומסייעת בשיפור טיפולי פוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נעשתה התאפשרה הודות לתמיכה על ידי: אוניברסיטת פאביה FRG 2016; האוניברסיטה של פארמה FIL 2014, 2016; Kinesis לאספקת plasticware את הצורך לבצע את המחקר הזה. אנו מודים ד"ר שיין וינדזור (הפקולטה להנדסה, אוניברסיטת בריסטול, אנגליה) למתן את התוכנה Cell_PIV.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש ו ועדות אתיות ב אוניברסיטת פאביה. בעלי חיים היו נשמרים בתנאים של 22 מעלות צלזיוס, לחות האוויר 60% מחזור/כהה 12:12 h.
1. השחלה בידוד
<ol><li>מזריקים intraperitoneally 2 4-ל-11 בת שבוע CD1 הנשי עכברים עם 10 U של זקיק מגרה הורמון עם מזרק אינסולין עקר 1 מ"ל.</li>
	<li>. אני לא. h 46-48</li>
	<li>שוקל את העכבר, עזים ומתנגד עם זריקה תוך שרירית של 50 מ"ג/ק"ג של Zoletil (cloridrate Tiletamina, Zolazepan). המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>לתפוס את העור המכסה לקיר הבטן בעזרת זוג מלקחיים לנתיחה. לחתוך את העור ופתח לגוף החומה עם זוג מספריים ומשוך את החתך עם מלקחיים.</li>
	<li>בעזרת זוג מספריים, להעביר האומץ הצידה, לאתר את הקרניים הרחם לשפה השחלות ב ממעמדם.</li>
	<li>בעדינות להחזיק את השחלה בעזרת מלקחיים שען, להשתמש במספריים לחתוך רצועה שלה אל הרחם. חזור עם השחלה אחרים.</li>
	<li>העברת השחלות שנאספו לתוך התא 35 מ מ תרבות פטרי המכילות 1 מ"ל של M2 בידוד בינוני להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באוויר.</li>
	<li>להסיר את השומן את oviduct באמצעות מספריים בסדר תחת stereomicroscope.</li>
</ol>2. בידוד של מתחמי Oocyte תלולית
<ol><li>לנקב פני השטח השחלות באמצעות פינצטה סטרילי, מחט סטרילית אינסולין 1G עד מתחמי oocyte antral cumulus (COCs) משתחררים פסיבי.</li>
	<li>לאסוף את COCs עם יותר משלוש שכבות של תאים cumulus באמצעות שבשליטת הפה משך ידו פסטר micropipette (200 מיקרומטר בקוטר) ולהעביר אותם לתוך טיפת 300 µL בינוני M2 טריים.</li>
	<li>להסיר את התאים cumulus המקיפים את oocytes באמצעות micropipette פסטר משך ידו (80 מיקרומטר בקוטר) על-ידי בעדינות pipetting שם במשך כמה שניות.</li>
	<li>שוב ושוב להעביר oocytes טיפה 20 µL של M2 בינוני עוד אחד, עד cumulus תאים בוטלו לחלוטין.</li>
</ol>3. סיווג המבוסס על הארגון Oocyte כרומטין
<ol><li>להכין פתרון מכתימים Hoechst 33342 ריכוז הסופי של µg/mL 0.05 ב- M2 בינונית החל מפתרון אמא של 5 מ"ג/מ"ל מדולל ב- 1 x PBS.</li>
	<li>במקום 3.5 µL מיקרו טיפות Hoechst מכתים פתרון בחלק התחתון של מכסה פטרי 35 מ מ.</li>
	<li>להעביר לכל oocyte יחיד לתוך Hoechst צביעת טיפה, למקם את המנה לצלחת חימום מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס), לכסות את זה עם מכסה כהה כדי להימנע תערוכות אור.</li>
	<li>לאחר 10 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, לבחון את oocytes עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה X 10 תחת אור UV (330-385 ננומטר), עבור לא יותר מ- 1-2 s.</li>
	<li>כשידור oocytes גרעינון מוקף (SN) (איור 1 א'), אם הם מציגים טבעת של כרומטין Hoechst-חיוביות המקיפים את גרעינון.</li>
	<li>לסווג את oocytes כמו גרעינון לא מוקף (NSN), אם שלהם גרעינון שאינו מוקף Hoechst-חיוביות כרומטין ומעוררים מראה כתמים heterochromatic בתוך הגרעין (איור 1B).</li>
</ol>4. סיווג Oocyte מבוססי-רשת עצבית
<ol><li>להכין ארבעה µL 2, טיפות מדיום α-מ בתוספת 5% לא פעיל חום העובר שור סרום, 2 מ מגלוטמין, טאורין 5 מ מ, 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 75, נתרן µg/µL 23.5 פירובט לתוך כוס 35 מ מ בתחתית צלחת פטרי ולכסות אותם עם ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), שמן מינרלי equilibrated מראש כדי למנוע אידוי בינוני. הערה: אם משתמשים במערכת התא-הקרנה בשידור חי, לשמור על הטיפות במרחק מסוים באמצעות רשת מצוירות של 7 מ"מ x 7 מ"מ כקו מנחה.</li>
	<li>העברת 3 - 4 oocytes על כל טיפה.</li>
	<li>מקום בתחתית הכוס פטרי לתוך מערכת ההקרנה-תא חי, המצוידים בתוכנת הקלטה בצילום מואץ (ראה טבלה של חומרים), מה שמאפשר התבוננות oocyte ההבשלה בסביבה עם טמפרטורה יציבה (37 ° C) ו CO2 הריכוז (5%).</li>
	<li>פתח את תוכנת הצריבה זמן לשגות. על המסך מופיעה חלון עם שוט בשידור חי את oocyte, בצד שמאל, כל הלחצנים הגדרה בצד ימין.</li>
	<li>בחר מרכז oocyte כדי להציבו במרכז המסך. כוונן פוקוס במידת הצורך.</li>
	<li>בחר בלחצן ה-Ph והגדר את המנורה DIA 192; זמן החשיפה 1/125 s; רווח כדי 1.99; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.</li>
	<li>בחר FL2 ולהגדיר את המנורה DIA 5; זמן החשיפה 3 s; רווח כדי 2.37; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.</li>
	<li>בחר בלחצן הצבע החדשה כדי להקליט את מיקום oocyte בתוך הטיפה תרבות. חזור על שגרה זהה עבור כל oocyte בתוך הטיפה תרבות.</li>
	<li>בחר זמן ולהגדיר את רכישת מחזור 8 דקות , הזמן הכולל 15 h.</li>
	<li>בחר להתחיל בצילום מואץ להתחיל מחזור הקלטה.</li>
	<li>פתח את תוכנת MATLAB ולכתוב >>cell_piv; ולאחר מכן בחר את הכלי PIV.</li>
	<li>לבחור את התיקייה המכילה את הסרט המוקלט, בחר את כל הקבצים קבצי jpeg כדי לטעון את רצף התמונה כולה. עבור כל oocyte, בחר את האזור בעל עניין (ROI) על ידי לחיצה על בחר אזור הכלי.</li>
	<li>בחר תהליך PIV בתפריט קובץ. בחר בלחצן ' הכלי מציג . הערה: התוכנית יחשב את הווקטורים מהירות בתוך רועי ומייצרת באופן אוטומטי קובץ נתונים, לשמור כקובץ .mat.</li>
	<li>בחר את הקובץ .mat. בחר בלחצן ' ' רועי בחר כלי וצייר מעגל סביב קווי המתאר של oocyte. לחץ על שמור בתפריט קובץ. הערה: הווקטורים באזור זה מוצגים כעת, לעדכן את הנתונים מגניטודה רשע בחלון גרף עבור רועי החדש הזה.</li>
	<li>פתח הנתונים שנאספו הגודל הממוצע של המסגרות כל זמן לשגות הקליט לתוך גיליון אלקטרוני, עם, על השורות, הרצף מסגרת ועל, העמודות, oocyte יחיד לכל מנותח.</li>
	<li>לארגן את הנתונים של oocytes NSN וגם SN תת-קבוצות 10.</li>
	<li>השתמש תת-קבוצות 9 כדי לאמן את רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה iteratively (FANN) ולקבוצת המשנה 1 בדיקה עיוורת.<ol>
<li>אני חוזר עוד 9 פעמים, שינוי המדגם בדיקה עיוורת (10-fold קרוס-אימות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>MATLAB, להריץ את הסקריפט מחוייט הראשי ופתוח, על פי בקשה, להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הדרכה (train.txt), מספר oocytes NSN וגם SN המשמש את מרווח זמן לשגות והדרכה כדי להיות מנותח (בדרך כלל, מתוך מסגרת מס ' 1-2 להפליל # 112-113).</li>
	<li>לחץ על הזן כדי לבצע את האימונים.</li>
	<li>להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הבדיקה (test.txt).</li>
	<li>פתח את וקטור test_outputs_cyt בסביבת MATLAB. הערה: חלון מופיעה על המסך מציג, בשורה הראשונה, ההסתברות להשיג אמת תוצאות חיוביות (TP או נכון NSN) חיוביות שגויות (FP או כוזב NSN) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה; במקום זאת, בשורה השניה, ההסתברות לקבל שווא שליליות (FN או SN שווא). ותשלילים אמיתי (TN או SN נכון) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה.</li>
	<li>להשתמש בנוסחה: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), כדי לחשב את רמת הדיוק של FANN, מבוטא באחוזים.</li>
</ol>

<ol><li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li>
<li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Human.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380(2013).</li>
<li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li>
<li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li>
<li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li>
<li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417(2011).</li>
<li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-%CE%B6-induced+Ca2%2B+oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li>
<li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed+forward+artificial+neural+network%3A+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li>
<li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Comput.+Intell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנם מספר שלבים קריטיים אחד אמור לטפל תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה עם העכבר oocytes, כמו גם עם אלה של מינים אחרים. ברגע מבודד זקיקים שלהם, oocytes מיד יועברו לתוך הטיפות הקלטה, כמו פרידה תלולית לוויה תאים המפעילים תחילת המעבר GV-כדי-MII. שינוי אפשרי בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות התוספת של 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX) למדיום M2 המשמש לבידוד COCs. IBMX מונעת את מפעילה מיידית של המעבר GV-כדי-MII ומאפשרת סנכרון של הקבוצה כל ניסיוני של oocytes.
מערכת ההקרנה-תא חי שימוש בניסויים שלנו (ראה ...

פוריות נשית היא מחלה המשפיעה על מספר גדל והולך של נשים. בסביבות על פי ארגון הבריאות העולמי, 20% של זוגות הם עקרים, עם 40% עקב בעיות פוריות נשית. בנוסף, שליש אחד של נשים שעברו טיפולים בסרטן (300,000 לשנה ו- 30,000 שנה בארצות הברית או איטליה, בהתאמה) לפתח שחלות מוקדמת.
אסטרטגיה כדי למנוע בעיות פוריות אצל חולי סרטן הוא בידוד הקפאה קריוגנית של זקיקי השחלה לפני הטיפול אונקולוגית, ואחריו במבחנה ההבשלה (IVM) של oocytes GV לבמה MII (GV-כדי-MII המעבר). הזמינות של סמנים לא פולשנית של מיומנות התפתחותית oocyte תשפר ההפריה, תהליכים התפתחותיים, הכוללת הריון הצלחה1,2.
בהתבסס על תצורת כרומטין שלהם נצפתה לאחר צביעת עם fluorochrome supravital Hoechst 33342, יונקים oocytes וחוה מסווגים מוקף גרעינון (SN) או לא מוקף גרעינון (NSN)3. מלבד ארגון כרומטין שונים שלהם, אלו שני סוגים של oocytes להציג הרבה הבדלים מורפולוגיים ופונקציונליים3,4,5,6,7,8 ,9, כולל את היכולות meiotic והפיתוחים שלהם. כאשר מבודד מן השחלה, התבגר במבחנה, הן סוג של oocytes להגיע לשלב MII, ולפתח הזרעה זרע, לשלב 2 תאים, אך רק אלו עם ארגון כרומטין SN עלולים לפתח המונח9. אמנם טוב כשיטה סיווג לבחירת המוסמכת נ' oocytes לא מוכשר, אולם החיסרון העיקרי הוא ההשפעה של ה מוטגני fluorochrome עצמה ו, ומעל לכל, את האור האולטרה סגול המשמש לצורך זיהוי שלו שאולי על התאים.
מכל הסיבות האלה, חיפשנו סמנים אחרים לא פולשנית המשויך קונפורמציה כרומטין SN או NSN יכול להחליף את השימוש Hoechst תוך שמירה על דיוק גבוהה סיווג אותו. התבוננות בצילום מואץ תנועה Cytoplasmic מהירויות (CMVs) מתגלה כמו תכונה ייחודית של מצב התא. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שהקשר בין CMVs להקליט בזמן ההפריה והיכולת של האדם מופרות של עכבר preimplantation מלאה, פיתוח מלא לטווח10,11.
בהתבסס על מחקרים אלה קודמות, נתאר כאן פלטפורמה עבור ההכרה של עכבר נכה כשיר או לא מוכשר oocytes לבגרות5,6,7,8. הפלטפורמה מבוססת על שלושה שלבים עיקריים: 1) Oocytes מבודד antral זקיקים מסווגים הראשון המבוסס על כרומטין בתצורה שלהם או של גרעינון מוקף (SN) או של גרעינון מוקף לא (NSN); 2) תמונות בצילום מואץ של CMVs המתרחשים במהלך המעבר GV-כדי-MII של כל יחיד oocyte נלקח וניתח עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV); ו- 3) נתונים שהושגו עם PIV מנותחים עם הזנה-קדימה מלאכותי עצבית רשת (FANN) עבור סיווג עיוור12,13. אנחנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך מיועד העכבר שיהיה מוכן זמין להיות נבדק, המשמש עבור יונקים אחרים (למשל, שור, קופים, בני אדם).

<table><tbody><tr><td>פוליגון</td><td>אינטרבט</td><td>A201A02</td><td>טיפול הורמונלי</td></tr><tr><td>הוכסט 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>לצביעת ביצית הטרוכרומטין</td></tr><tr><td>תרבית תאים Petri-dish 35 מ"מ x 10 מ"מ&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>430165</td><td>לבידוד COCs</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 בינוני (1X), נוזלי, עם פנול אדום</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>לבידוד COCs</td></tr><tr><td>MEM אלפא בינוני (1X) + גלוטמקס&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4526</td><td>להבשלת ביצית במבחנה</td></tr><tr><td>תרבית תאים פטרי צלחת 35 מ"מ תחתית זכוכית&nbsp;</td><td>וילקו&nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&nbsp;</td><td>מערכת סינון תאים חיים</td> <td>של Nikon</td><td>MFA91001</td>&nbsp;</tr><tr><td>פסטר פיפטה</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>למניפולציה של זקיקים</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>למניעת זיהום ואידוי בינוני</td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>למניעת זיהום בינוני&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>לאיפור ואלפא; MEM בינוני&nbsp;</td></tr><tr><td>ל-גלוטמין&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>לאיפור ואלפא; MEM בינוני&nbsp;</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T0625</td><td>לאיפור ואלפא; MEM בינוני&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>לאיפור ואלפא; מדיה MEM</td></tr><tr><td>נתרן פירובט &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; P4562</td><td>לאיפור ואלפא; MEM מדיה</td></tr><tr><td>Zoletil (Tiletamina ו- Zolazepan cloridrate)</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>לעכברים הרדמה</td></tr><tr><td>Cell_PIV sofware&nbsp;</td><td>נמסר באדיבות על ידי ד"ר שיין וינדזור, אוניברסיטת בריסטול, בריטניה</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td><td>לחישוב מספרי רב-פרדיגמות</td></tr></tbody></table>

מזהה מבוססי-רשת עצבית של oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

מרפאות פוריות ירוויחו היכולת לבחור כשיר מבחינת לעומת oocytes כשירים באמצעות הליכים פולשנית, ובכך לשפר את התוצאה הכוללת של ההריון. לאחרונה פיתחנו שיטת סיווג המבוסס על תצפיות חיים מיקרוסקופיים של העכבר oocytes במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal (GV) ועד השלב השני מפה של, ואחריו הניתוח של התנועות cytoplasmic המתרחשים במהלך תקופה זו זמן לשגות. כאן, אנו מציגים נתונים היסטוריים הפרוטוקולים של הליך זה. Oocytes מבודד זקיקים antral וחוה, תרבותי עבור h 15 בתוך מיקרוסקופ מצויד לניתוח זמן לשגות-CO 37 ° C ו-5%2. תמונות נלקחים במרווחים של 8 דקות. התמונות ניתוח בשיטת Velocimetry תמונת החלקיקים (PIV) מחשבת, עבור כל oocyte, הפרופיל של מהירויות התנועה Cytoplasmic (CMVs) המתרחשים לאורך כל תקופת תרבות. בסופו של דבר, CMVs של כל יחיד oocyte מוזנים דרך סיווג מתמטית כלי (רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה, FANN), אשר מנבאת את ההסתברות של תא רבייה להיות נכה או לא מוכשר עם דיוק של 91.03%. פרוטוקול זה, להגדיר עבור העכבר, עכשיו נבדק על oocytes של מינים אחרים, כולל בני אדם.

איור 2 מציג נציג התפתחותי מוסמך ולא יוצלח oocyte, בהתאמה בהתחלה (GV) ובסופו של דבר (MII) של ההליך IVM. IVM של העכבר לבגרות oocytes מתרחשת במהלך 15 h תרבות. התצפית זמן לשגות מתעדת את ההתקדמות של מיוזה ומזהה האירועים meiotic הגדולים, כולל GVBD את ההבלטה של הגוף הקוטב הראשון.
ניתוח והשוואה בין יותר מ 200 - נכה המוסמכת נ' oocytes כשירים הראו הבדלי הזמן ההתקדמות של מיוזה. באופן ספציפי, ב- NSN oo...

כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא זיהוי אוציטים בעלי יכולת התפתחות אחורית באמצעות כלי לא פולשני. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שפשוט על ידי התבוננות בתנועות הביציות המתרחשות במהלך התבגרות במבחנה, ניתן להעריך את פוטנציאל ההתפתחות של הגמטות הנקביות. טכניקה זו מבוססת על הדמיית זמן-lapse יחד עם מהירות תמונת חלקיקים, ניתוח מבוסס רשת עצבית.כאן, נתאר את הצעדים שננקטו כדי להוכיח כי ביציות עכבר במהלך המעבר משלב שלפוחית הנבט לשלב המטאפאזה השני, מציגות פרופיל שונה של תנועות הפלזמה האמורות בקורלציה משמעותית ליכולת ההתפתחותית או לחוסר היכולת ההתפתחותית שלהן. על פי ארגון הבריאות העולמי, אי פוריות היא פתולוגיה המשפיעה על כ-20 אחוז מהזוגות ובנוסף, שליש מהנשים העוברות טיפול בסרטן נמצאות בסיכון לאי ספיקת שחלות מוקדמת. זה מקביל לכ-300,000 או 30,000 נשים במדינות כמו ארה"ב או איטליה בהתאמה.תכנון הליכים לא פולשניים לזיהוי היכולת ההתפתחותית של הביציות יעזור לשפר את ההצלחה הכוללת של תוצאות ההריון. כאן, אנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך כפי שפותח עבור העכבר, על מנת להפוך אותו לזמין לבדיקה ולשימוש עבור מיני יונקים אחרים כגון בקר או בני אדם. השחלות מועברות בצלחת פטרי המכילה M2 בינוני מחומם מראש ומאוזן, ו-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2.אם צינור הביצית ומעט שומן עדיין קיימים סביב השחלה, יש להסירם. לאחר מכן, מחזיקים את השחלה בפינצטה, פני השטח שלה מנוקבים באמצעות מחט 1G סטרילית. השחלות המנוקבות מוסרות ממדיום M2 ובאמצעות מיקרופיפטה הנמשכת ביד, קוקס את המעבר הראשון שלנו למדיום M2 נקי חדש, ולאחר מכן מזרימים פנימה והחוצה למשך מספר שניות עד שתאי הקומולוס המקיפים את הביצית מוסרים לחלוטין.לאחר מכן, הביציות מועברות בטיפות של 20 מיקרוליטר של מדיום M2 ואם חלק מתאי הקומולוס מתמידים, הם מוסרים ביסודיות דרך מספר מעברים מטיפה לטיפה עד שתאי הקומולוס מסולקים לחלוטין. על מנת להכין את Hoechst 33342 בריכוז סופי של 0.05 מיקרוגרם למיל, אנו מתחילים בתמיסה עדינה של Hoechst בריכוז של 5 מיליגרם למיל, המוכנה ב-pbs חד פעמי וזה מדולל עוד יותר עד לקבלת הריכוז הנדרש. 3.5 מיקרו-טיפות מיקרוליטר של תמיסת הוכסט מונחות בתחתית מכסה צלחת פטרי וכל ביצית מדוללת בודדת מועברת לאחר מכן בטיפת הוכסט אחת, תוך הקפדה על הפחתת חשיפת האור במהלך תהליך הצביעה של הוכסט, על ידי כיסוי הכלי במכסה כהה.לאחר עשר דקות צביעה, ביציות נצפות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אור UV. בהתבסס על קונפורמציית הכרומטין, הם מסווגים כגרעין מוקף, SN, אם הם מציגים טבעת של כרומטין חיובי x סביב הגרעין או כגרעין לא מוקף, NSN, אם לגרעין חסרה טבעת של כרומטין חיובי x והכרומטין הכללי נראה מפוזר בגרעין. ארבע טיפות של שני מיקרוליטר של מדיום אלפא מם מונחות על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית תוך הקפדה לשמור על הטיפות במרחק מסוים, טיפות מכוסות בשמן מינרלי מחומם מראש ומאוזן ובסך הכל שלוש עד ארבע ביציות מועברות לכל טיפה.צלחת הפטרי מועברת לתא הדגירה של מיקרוסקופ שחלף זמן, המאפשר שמירה ממושכת על צילטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2 ותאורה עם נורת LED אדומה. לפני ניתוח זמן-lapse, באמצעות תוכנת BioStation, הקואורדינטות של כל טיפה נקבעות על מנת להפוך את המעבר מטיפה אחת לאחרת לאוטומטי במהלך שגרת הזמן-lapse. מסגרות זמן-lapse מצולמות במרווחים של שמונה דקות למשך 15 שעות בסך הכל.לאחר מכן מנותחים הסרטים המוקלטים באמצעות תוכנת CellPave, המאפשרת לזהות תנועות ציטופלזמיות המתבטאות במונחים של וקטורי מהירות. ראשית, בעזרת הכלי CellPave, ההיקף של כל ביצית מופרד ידנית. לאחר מכן, התוכנה מחשבת את מהירות התנועה הציטופלזמית המתרחשת בהשוואה בין שתי מסגרות זמן-lapse עוקבות ומבטאת אותה על ידי הצבת חץ צבעוני שעוצמת הצבע והאורך שלו מגדירים את מהירות וכיוון התנועות.ההיסטוגרמה מתחת לביצית הנראית כאן מתארת את מהירות התנועה הציטופלזמית הכוללת לאורך 15 שעות ההקלטה של ביצית SN. אותו סוג של ניתוח נעשה על ביצית NSN. שימו לב לגוף הקוטב המושהה שיא שחול אחד המוצג על ידי ביצית NSN בהשוואה לביצית SN.החלק התחתון של המסך מראה את הדפוס הזמני של מהירות התנועה הציטופלזמית של הביצית. המהירות מחושבת על ידי השוואה בין שתי מסגרות עוקבות. הנתונים הגולמיים של מהירות התנועה הציטופלזמית מיוצאים לאחר מכן לגיליון אקסל המדווח, על השורות, על רצף פרנס, ועל העמודות, הביצית הבודדת שנותחה.בצד שמאל, הנתונים של ביצית SN, ואילו בצד ימין, אלה של ביציות NSN. הנתונים של ביציות SN או NSN מחולקים לאחר מכן ל-10 תת-קבוצות. תשעה משמשים לאימונים, בצבע ירוק.ואחד לבדיקה עיוורת, צבע אדום. הליך זה חוזר על עצמו בסך הכל 10 פעמים. בכל פעם החלפת דגימת הבדיקה העיוורת.לאחר מכן הנתונים נבדקים באמצעות רשת עצבית מלאכותית הזנה קדימה, או FANN. ה-FANN בנוי לנתח את כל מסגרות הזמן-lapse, הנקראים כאן נוירוני קלט"האחרונים מחוברים לשלושה נוירונים נסתרים, המקושרים בעצמם לשני נוירוני פלט. פלט אחד נותן את ההסתברות שהקלט הוא ביצית מוכשרת.השני, להיפך, שהקלט הוא ביצית לא מוכשרת. ההשוואה בין שתי התפוקות מנבאת את היכולת המנטלית של דולה ביצית בדיוק של 91.03 אחוזים. הטכניקה הוגדרה עבור ביציות עכברים כפי שמוצג כאן.עם זאת, הריקול העתידי הוא לבדוק אותו על ביציות אנושיות. למעשה, הליכים לא פולשניים מניתוח איכות הביציות נדרשים במיוחד בתחום טכנולוגיות הרבייה המלאכותית.

a-neural-network-based-identification-developmentally-competent-or

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

כאן, אנו מתארים, להשוות, ולהשוות שתי טכניקות שונות לספירת זקיק מדויקת של רקמות השחלות עכבר קבוע.

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים באמצעות שמירה חיסונית בהרכבה מלאה, מיקרוסקופיית מולטי-פוטון והדמיה וניתוח תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה, החל על טוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

למדו לזהות ביציות עכבר שכשירות להתפתחות באמצעות שיטה לא פולשנית המבוססת על צילום time-lapse ואנליזת רשת עצבית. שיטה זו מאפשרת הערכת איכות הביצית בזמן אמת ומסייעת בשיפור טיפולי פוריות.

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

גלה סרטונים נוספים