מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

המטרה הכוללת של הליך זה היא זיהוי אוציטים בעלי יכולת התפתחות אחורית באמצעות כלי לא פולשני. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שפשוט על ידי התבוננות בתנועות הביציות המתרחשות במהלך התבגרות במבחנה, ניתן להעריך את פוטנציאל ההתפתחות של הגמטות הנקביות. טכניקה זו מבוססת על הדמיית זמן-lapse יחד עם מהירות תמונת חלקיקים, ניתוח מבוסס רשת עצבית.

כאן, נתאר את הצעדים שננקטו כדי להוכיח כי ביציות עכבר במהלך המעבר משלב שלפוחית הנבט לשלב המטאפאזה השני, מציגות פרופיל שונה של תנועות הפלזמה האמורות בקורלציה משמעותית ליכולת ההתפתחותית או לחוסר היכולת ההתפתחותית שלהן. על פי ארגון הבריאות העולמי, אי פוריות היא פתולוגיה המשפיעה על כ-20 אחוז מהזוגות ובנוסף, שליש מהנשים העוברות טיפול בסרטן נמצאות בסיכון לאי ספיקת שחלות מוקדמת. זה מקביל לכ-300,000 או 30,000 נשים במדינות כמו ארה"ב או איטליה בהתאמה.

תכנון הליכים לא פולשניים לזיהוי היכולת ההתפתחותית של הביציות יעזור לשפר את ההצלחה הכוללת של תוצאות ההריון. כאן, אנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך כפי שפותח עבור העכבר, על מנת להפוך אותו לזמין לבדיקה ולשימוש עבור מיני יונקים אחרים כגון בקר או בני אדם. השחלות מועברות בצלחת פטרי המכילה M2 בינוני מחומם מראש ומאוזן, ו-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2.

אם צינור הביצית ומעט שומן עדיין קיימים סביב השחלה, יש להסירם. לאחר מכן, מחזיקים את השחלה בפינצטה, פני השטח שלה מנוקבים באמצעות מחט 1G סטרילית. השחלות המנוקבות מוסרות ממדיום M2 ובאמצעות מיקרופיפטה הנמשכת ביד, קוקס את המעבר הראשון שלנו למדיום M2 נקי חדש, ולאחר מכן מזרימים פנימה והחוצה למשך מספר שניות עד שתאי הקומולוס המקיפים את הביצית מוסרים לחלוטין.

לאחר מכן, הביציות מועברות בטיפות של 20 מיקרוליטר של מדיום M2 ואם חלק מתאי הקומולוס מתמידים, הם מוסרים ביסודיות דרך מספר מעברים מטיפה לטיפה עד שתאי הקומולוס מסולקים לחלוטין. על מנת להכין את Hoechst 33342 בריכוז סופי של 0.05 מיקרוגרם למיל, אנו מתחילים בתמיסה עדינה של Hoechst בריכוז של 5 מיליגרם למיל, המוכנה ב-pbs חד פעמי וזה מדולל עוד יותר עד לקבלת הריכוז הנדרש. 3.5 מיקרו-טיפות מיקרוליטר של תמיסת הוכסט מונחות בתחתית מכסה צלחת פטרי וכל ביצית מדוללת בודדת מועברת לאחר מכן בטיפת הוכסט אחת, תוך הקפדה על הפחתת חשיפת האור במהלך תהליך הצביעה של הוכסט, על ידי כיסוי הכלי במכסה כהה.

לאחר עשר דקות צביעה, ביציות נצפות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אור UV. בהתבסס על קונפורמציית הכרומטין, הם מסווגים כגרעין מוקף, SN, אם הם מציגים טבעת של כרומטין חיובי x סביב הגרעין או כגרעין לא מוקף, NSN, אם לגרעין חסרה טבעת של כרומטין חיובי x והכרומטין הכללי נראה מפוזר בגרעין. ארבע טיפות של שני מיקרוליטר של מדיום אלפא מם מונחות על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית תוך הקפדה לשמור על הטיפות במרחק מסוים, טיפות מכוסות בשמן מינרלי מחומם מראש ומאוזן ובסך הכל שלוש עד ארבע ביציות מועברות לכל טיפה.

צלחת הפטרי מועברת לתא הדגירה של מיקרוסקופ שחלף זמן, המאפשר שמירה ממושכת על צילטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2 ותאורה עם נורת LED אדומה. לפני ניתוח זמן-lapse, באמצעות תוכנת BioStation, הקואורדינטות של כל טיפה נקבעות על מנת להפוך את המעבר מטיפה אחת לאחרת לאוטומטי במהלך שגרת הזמן-lapse. מסגרות זמן-lapse מצולמות במרווחים של שמונה דקות למשך 15 שעות בסך הכל

לאחר מכן מנותחים הסרטים המוקלטים באמצעות תוכנת CellPave, המאפשרת לזהות תנועות ציטופלזמיות המתבטאות במונחים של וקטורי מהירות. ראשית, בעזרת הכלי CellPave, ההיקף של כל ביצית מופרד ידנית. לאחר מכן, התוכנה מחשבת את מהירות התנועה הציטופלזמית המתרחשת בהשוואה בין שתי מסגרות זמן-lapse עוקבות ומבטאת אותה על ידי הצבת חץ צבעוני שעוצמת הצבע והאורך שלו מגדירים את מהירות וכיוון התנועות.

ההיסטוגרמה מתחת לביצית הנראית כאן מתארת את מהירות התנועה הציטופלזמית הכוללת לאורך 15 שעות ההקלטה של ביצית SN. אותו סוג של ניתוח נעשה על ביצית NSN. שימו לב לגוף הקוטב המושהה שיא שחול אחד המוצג על ידי ביצית NSN בהשוואה לביצית SN.

החלק התחתון של המסך מראה את הדפוס הזמני של מהירות התנועה הציטופלזמית של הביצית. המהירות מחושבת על ידי השוואה בין שתי מסגרות עוקבות. הנתונים הגולמיים של מהירות התנועה הציטופלזמית מיוצאים לאחר מכן לגיליון אקסל המדווח, על השורות, על רצף פרנס, ועל העמודות, הביצית הבודדת שנותחה.

בצד שמאל, הנתונים של ביצית SN, ואילו בצד ימין, אלה של ביציות NSN. הנתונים של ביציות SN או NSN מחולקים לאחר מכן ל-10 תת-קבוצות. תשעה משמשים לאימונים, בצבע ירוק.

ואחד לבדיקה עיוורת, צבע אדום. הליך זה חוזר על עצמו בסך הכל 10 פעמים. בכל פעם החלפת דגימת הבדיקה העיוורת.

לאחר מכן הנתונים נבדקים באמצעות רשת עצבית מלאכותית הזנה קדימה, או FANN. ה-FANN בנוי לנתח את כל מסגרות הזמן-lapse, הנקראים כאן נוירוני קלט"האחרונים מחוברים לשלושה נוירונים נסתרים, המקושרים בעצמם לשני נוירוני פלט. פלט אחד נותן את ההסתברות שהקלט הוא ביצית מוכשרת.

השני, להיפך, שהקלט הוא ביצית לא מוכשרת. ההשוואה בין שתי התפוקות מנבאת את היכולת המנטלית של דולה ביצית בדיוק של 91.03 אחוזים. הטכניקה הוגדרה עבור ביציות עכברים כפי שמוצג כאן.

עם זאת, הריקול העתידי הוא לבדוק אותו על ביציות אנושיות. למעשה, הליכים לא פולשניים מניתוח איכות הביציות נדרשים במיוחד בתחום טכנולוגיות הרבייה המלאכותית.