לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

המטרה הכוללת של פרוטוקול דיסקציה זה עבור כלי הדם ברשתית של דג הזברה הבוגר היא לספק קריאה מהירה בהגדרות של פתולוגיות כלי דם ארוכות טווח הקשורות לניאואנגיוגנזה ושינויים מבניים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית או סריקת לייזר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסיבוכים המיקרו-וסקולריים כגון התפתחות רטינופתיה סוכרתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להציג ולנתח את כל הרטינובסקולטורה בתהליכים פיזיולוגיים ומחלות ללא כל יישום של פלואורסצנציה בין-וסקולרית בצורה מהירה וסטנדרטית יחסית.

כדי להתחיל, העבירו שישה מיליליטר של תמיסת PFA PBS שהוכנה טרייה של ארבעה אחוזים לדגימה לבארות של שש צלחות באר. לאחר המתת חסד של דגי זברה בוגרים לפי פרוטוקול הטקסט, הניחו אותם על מגבות נייר טריות וייבשו אותם. השתמש באזמל וחתוך את הראשים מאחורי האופרקולום.

ואז העבירו את הראשים ישירות לבארות של קיבוע טרי שהוכן לאחרונה. אחסן את הצלחות המכילות את ראשי הדגים בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות כדי להבטיח שהקיבוע חודר לשכבות הרשתית העמוקות יותר. עם אגרוז מחומם של שני אחוזים, ממלאים צלחת פטרי עד שליש ומחכים עד שהאגר יציב.

כסו את צלחת האגר ב-X PBS אחד כדי ליצור סביבת עבודה לניתוח העיניים. מעבירים את הדגימה הקבועה לצלחת הפטרי. ועל ידי החזקת הראש במשטח החתוך עם פינצטה אחת, הכנס פינצטה נוספת, מוצמדת יחד מתחת לגלגל העין בחלל המסלול.

פתחו לאט את הפינצטה מתחת לעין ואחזו בעצב הראייה. ואז לקרוע בזהירות ולנתק את העין. כדי להסיר כל אחד מארבעת פי הטבעת ושני השרירים החוץ-עיניים האלכסוניים המחוברים לעין, כמו גם שאריות של רקמה חוץ עינית המחברת את העין לחלל המסלול, החזיקו את העין באמצעות פינצטה סגורה למחצה ואחזו במבנה בפינצטה השנייה השתמשו בתנועה קוטרית כדי לקרוע אותה ברכות.

לאחר מכן, השתמש במחט חד פעמית בגודל 27 כדי לנקב את הקרנית בטווח החיצוני. דרך פתח זה השתמשו בשתי הפינצטות כדי להחזיק את הקרנית ולקרוע אותה מעט. לאחר מכן עבדו בזהירות כדי ליצור קרע ממורכז בערך בגודל האישון המתאים.

הפעל לחץ על צד הקרנית של גלובוס העין בקצה הקרנית החיצוני מעל הקשתית. זה ייצור שקע קטן וידחוף את העדשה לגובה הקרע בקרנית. לאחר מכן הפעל את הפינצטה מתחת לעדשה והסר אותה.

לאחר מכן, הפוך את העין כשעצב הראייה פונה כלפי מעלה. שימו לב שהסקלרה והקרנית מחוברות ויוצרות את הטוניקה הסיבית של הנורה כדי להגן על הרשתית בצורת. מעטפת זו, המכונה קורנסקלרה חוסכת את האזור סביב עצב הראייה.

הכנס מחט בהפסקה זו כדי ליצור פתח בין הסקלרה לרשתית. לאחר מכן, באמצעות גישה זו עם שתי הפינצטה, קרע בזהירות את הסקלרה באופן צירי לרצועות כדי להגדיל את הפתח סביב עצב הראייה. הקפד לשמור על הקורנסקלרה שלמה במעבר להיקף הצד של הקרנית.

לפני הסרת הקורנסקלרה מהרקמה התוך-עינית שנותרה, נסה להחמיר קשרים כלשהם מכיוון שהיצמדות למבנים אחרים תהיה נקודה קריטית. לאחר מכן החזק את הסקלרה בפינצטה אחת ועל ידי תפיסת עצב הראייה בשנייה ומשיכה, הסר את הקורנסקלרה לחלוטין מהעין והשליך אותה. שלב זה יספק מבנה בצורת המורכב מהענביה והרשתית המכילה את כלי הדם ברשתית.

לאחר מכן, צור קרע בשכבת הכורואיד וה-RPE על ידי החזקת מחט בגודל 27 לצדדים לכוס הנותרת תוך גרידת המשטח החיצוני עם שפת קצה המחט. השתמש בקרע כנקודת גישה כדי להשיג אחיזה בשכבת הכורואיד וה-RPE והשתמש בשתי הפינצטות כדי לקרוע אותה לפסים תוך שמירה על החיבור לקשתית שלם. לאחר מכן, העבירו פינצטה אחת מתחת לקשתית והזיזו אותה במעגל מבחוץ תוך יצירת מתח על ידי משיכת שכבת הכורואיד וה-RPE שהופסקה וניתקו את המבנה המשולב.

אם לא ניתן להסיר חלקים מהקשתית ולהישאר מחוברים לרשתית בצורת לאחר הסרת שכבת הכורואיד וה-RPE השתמש בנקודת שבירה טבעית נוספת שעין דג הזברה הבוגרת מציגה בתוך שכבת קולטני האור. באופן דומה רק מודגם להסרת הקשתית. מגרדים מעל הרשתית הנותרת בצורת כדי לגרום להפסקות בשכבת קולטני האור.

לאחר מכן השתמש בגישה שנוצרה כדי להסיר את השכבה תוך שמירה על החיבור האפשרי לקשתית שלם. לאחר מכן, העבירו את הפינצטה מתחת לקשתית והמשיכו במעגל כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה כדי לנתק את המבנה המשולב. חיוני לנתק את הקשתית מהרקמה הבסיסית שלה בצורה הגיונית מכיוון שהיא תחסום את הקרינה ישירות מעל המעגל האופטי הפנימי במהלך הדמיה של כלי הדם.

גישה ישירה מדי עלולה להוביל לשבירת כלי שיט. לאחר מכן השתמש במספריים קפיציים מיקרו-דיסקציה עם קצה חיתוך ישר של שני נקודות חמישה מילימטר כדי לחתוך את עצב הראייה קרוב ככל האפשר לרשתית. זה יאפשר הרכבה שטוחה טובה יותר של הרקמה.

כדי להרכיב ולדמיין את כלי הדם ברשתית, השתמש ב-X PBS אחד כדי לשטוף את הרשתית המנותחת פעמיים במשך חמש דקות כל אחת. הניחו טיפה של PBS על מגלשת זכוכית. לאחר מכן בעזרת מרית מעבדה עם קצה כף, העבירו את הרשתית לטיפה.

בעזרת פינצטה שמרו על הרקמה במקומה תוך שימוש באזמל כדי לחתוך את המבנה בצורת ליצירת צורה שטוחה של ארבעה עלי כותרת או חמישה עלי כותרת, בהתאם לגודל הרשתית. בעזרת פיסת נייר דקה מוצצים את השמאל מעל PBS, נזהרים לא לגעת ברשתית. לאחר מכן מצפים את הרשתית המותקנת השטוחה במדיום הרכבה ומכסים אותה בכיסוי.

היזהר לא ליצור קצף מכיוון שבועות אוויר עלולות לעוות את ההדמיה של כלי הרשתית. השתמש בלק כדי לאטום את הכיסוי. לבסוף, בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי או סריקת לייזר כדי לדמיין את כלי הדם ברשתית.

מוצגת כאן דוגמה מורפולוגית של כלי הדם ברשתית בדג זברה EGFP זבוב טרנסגני בוגר המוצג במיקרוסקופ פלואורסצנטי ודוגמה שנייה שצולמה במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המפחית את הקרינה ברקע. מבנה הרשתית שנחשף מראה דפוס מאורגן מאוד. עורק הראייה חודר לרשתית בראש עצב הראייה וברוב הדגימות מתפשט לחמישה עד שבעה כלי דם עיקריים.

לאחר מכן הכלים העיקריים מסתעפים לרצף של ארקדות ומתחברים למעגל האופטי הפנימי או IOC, הנקרא גם הווריד ההיקפי, המקיף את הדיסק האופטי בפריפריה של הרשתית המותקנת השטוחה. רשתית דג הזברה הבוגרת מורכבת מהשכבות הבאות מבפנים החוצה. שכבת תאי הגנגליון, שכבת הפרספקס הפנימית, השכבה הגרעינית הפנימית, שכבת הפרספקס החיצונית, השכבה הגרעינית החיצונית, שכבת קולטני האור והאפיתל הפיגמנטי של הרשתית.

הערכת פרמטרי כלי הדם מהדמיית כלי הדם ברשתית מוצגת כאן. כלי הדם הפנימיים של הרשתית ממוקמים על שכבת תאי הגנגליון ואילו הנימים הלבביים יהיו קשורים לאפיתל הפיגמנטי של הרשתית. לאחר האימון, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-20 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור להתאמן באופן קבוע מכיוון שהיעדרות ממושכת מההכנה מפחיתה את התוצאה של שלמות כלי הדם. בעקבות הליך זה ניתן לנתח סוכרת ופתולוגיות נוירו-וסקולריות בדג זברה בוגר.