Name: לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למד פרוטוקול ניתוח רשתית של דג זברה בוגר לניתוח מערכת כלי הדם ברטינה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של פתולוגיות וסקולריות וניאו-אנגיוגנזה במחלות כמו רטינופתיה סוכרתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות Katrin בנביץ, מרלן האוזנר עבור גידול דג זברה וסיוע טכני. המחברים להכיר את התמיכה של הליבה מתקן לחיות תא הדמיה מנהיים במרכז וההתערבות, טכנולוגיה רפואית מנהיים (DFG מוסד 91027/9-1). מחקר זה נתמך על ידי פתוח (הבינלאומי למחקר הדרכה קבוצתית 1874/1 "DIAMICOM", פרויקט SP5 ו- SP9; SFB1118 מרכז מחקר שיתופי, פרויקט B1 ופרויקט מחקר מרכז שיתופי SFB/TR23 Z5).

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+report+on+diabetes%22">Global report on diabetes</a>. , 88(2016).</li>
<li>Lim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+nephropathy+-+complications+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nephrol+Renovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Diabetic nephropathy - complications and treatment.</a> Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).</li>
<li>Yau, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+and+major+risk+factors+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy.</a> Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).</li>
<li>Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20580421">Diabetic retinopathy.</a> The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).</li>
<li>Raymond, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+prevalence+of+retinopathy+in+diabetic+patients+of+South+Asian+ethnicity+compared+with+white+Europeans+in+the+community%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study.</a> Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).</li>
<li>Heng, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+pathogenesis%2C+clinical+grading%2C+management+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments.</a> Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).</li>
<li>Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).</li>
<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Sharma, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELMO1+protects+renal+structure+and+ultrafiltration+in+kidney+development+and+under+diabetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions.</a> Sci Rep. 6, 37172(2016).</li>
<li>Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezetimibe+and+simvastatin+reduce+cholesterol+levels+in+zebrafish+larvae+fed+a+high-cholesterol+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Cholesterol%22%5BJournal%5D)">Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet.</a> Cholesterol. , 564705(2012).</li>
<li>Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+zebrafish+as+a+model+for+glucose+metabolism%3A+expression+of+phosphoenolpyruvate+carboxykinase+as+a+marker+for+exposure+to+anti-diabetic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds.</a> J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).</li>
<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+Fish%2C+Big+Data%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).</li>
<li>Kasprick, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+of+adult+zebrafish+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles.</a> PLoS One. 6 (11), e27095(2011).</li>
<li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visual+system+of+zebrafish+and+its+use+to+model+human+ocular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Bell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vasculature+of+adult+zebrafish%3A+in+vivo+imaging+using+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21111217">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+function+of+midkine+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The expression and function of midkine in the vertebrate retina.</a> Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).</li>
<li>Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+retinal+angiogenesis+in+zebrafish+as+a+model+to+study+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy.</a> PLoS One. 3 (7), e2748(2008).</li>
<li>Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+for+understanding+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model for understanding diabetic complications.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).</li>
<li>Alvarez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+cone+photoreceptor+dysfunction+in+a+hyperglycaemic+model+of+non-proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy.</a> Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).</li>
<li>Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+hyperglycaemia+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+leads+to+morphological+changes+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina.</a> Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).</li>
<li>Jorgens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+tissue+glucose+alters+intersomitic+blood+vessels+in+zebrafish+via+methylglyoxal+targeting+the+VEGF+receptor+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade.</a> Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).</li>
<li>Lai, A. K., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+diabetic+retinopathy%3A+summary+and+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison.</a> J Diabetes Res. 2013, 106594(2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מודלים של היפוקסיה-induced neoangiogenesis ברשתית הצג מספר רב יותר של נקודות הסתעפות, האנגיוגנזה נבטים, השטח הכולל כלי דם וירידה מרחק intercapillary דג זברה20. ממצאים אלה תומכים לרעיון כי דג זברה היא חשופה סיבוכים microvascular סוכרתית21, הממצאים העיקריים של רטינופתיה סוכרתית מאוחר יותר לכלול בתיווך היפוקסיה neoangiogenesis, חריפה המקושר לביטוי VEGF. היפרגליקמיה-induced שינויים ברשתית דג זברה להוביל עובי מוגברת של כלי אבל לשמור על הכולל תכנים22. לסירוגין טבילה גלוקוז פתרונות עבור 30 ימים גם מקטין את העובי של IPL ו להיכנס23. השפעת ישירה של מטבוליטים גלוקוז בדג זברה כמו מטבולית חסידי vasculopathy גם כבר הוצגה. Hyperbranching כלי דם נוספות נצפתה ב להערכת תא המטען של דג זברה העוברים לאחר דגירה עם methylglyoxal24. כרגע, יש אין במודל חיה אשר מספקת את כל הקריטריונים המרכזיים של רטינופתיה סוכרתית. שינויים מוקדם נמצאים לעתים קרובות, אך סדר רטינופתיה סוכרתית proliferative חסרה25. דג זברה נופל גם הגדרה זו, כאמור רק בתיווך היפוקסיה neoangiogenesis או היפרגליקמיה-induced שינויים עד עכשיו. הממצאים הנוכחיים תתמכו כי דג זברה רגישים לשינויים בכלי הדם בתיווך היפרגליקמיה, כמו במודל חיה פוטנציאלי עלול להציג התקדמות כדי proliferative רטינופתיה סוכרתית. בהתאם כוח חשיפה האפקט בתיווך היפרגליקמיה, שהמודל הניסויי נכון יכול להוביל איסכמיה באזורים מסוימים של הרשתית דג זברה ולקדם neoangiogenesis כמו הקריטריונים המרכזיים של רטינופתיה סוכרתית המקדימות. עם זאת, כמו דג זברה הוא שחקן חדש וזהובה בתחום מידול פתולוגיות microvascular לטווח ארוך, סוכרת הקרובה במודלים דג זברה לספק מידע נוסף, להבהיר את החשיבות שלו בכל הנוגע דגמים אחרים, שלהם פתולוגיות. לדוגמה, בצלב של דג זברה tg(gata1a:DsRed) עם אריתרוציטים מתויג אדום לתוך הקו tg(fli:EGFP) יכול לשמש בו זמנית להמחיש לפרקים תוך-עיני פוטנציאלי בעתיד מודלים דג זברה מציג microaneurysms כמו מנבא של סדר PDR.
מאז להערכת ברשתית מתקדמת לתוך רצף של אולמות, הערכת המרחק intervascular, מספר נקודות הסתעפות ואת שטח כלי הדם קשורים המרחק מ העורק המרכזי. כדי למנוע הטיה בפרמטרים של כלי הדם המוערך, נדרשת נקודת אוריינטציה. הוועד האולימפי הוא מבנה כזה והוא רלוונטי מאז תחומי פעילות כלי דם משקרת בסמיכות המרחבית ישירה. להערכת עקבית, הסריקה הרשתית צריך להיות מחולק מספר מקטעים תמונה מלבנית עם מרחק עקבי כדי הוועד האולימפי. הרשתית כולו צריך להיות מנותח ומופץ תמונות מספרית באופן סימטרי. הרשתית דג זברה מציגה אזורים עם צפיפות נימי גבוה ונמוך, שוויונית של התמונה מקטעים יכול להוביל הטיה נוספים.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
איור 12: מצגת דוגמה של פרמטרים וסקולרית readout להדמיות להערכת ברשתית. מדידה של המרחק intervascular (חץ כפול אדום) ליד הראייה הפנימית להקיף בעיגול (IOC) (א). שלוש נקודות הסתעפות (עיגולים אדומים) ליד של הוועד האולימפי הבינלאומי (B). ויזואליזציה של דג זברה להערכת ברשתית עם שטח מוגדלת (התיבה האדומה) מציג כלי נבטי (C). קוטר הכלי מודדים מרחק מסויים (חץ כפול הלבן) של עורק מרכזי (צלב לבן) (D). צפיפות כלי הוא האחוז של אזור ברשתית שנכבשו על ידי בשכבת-על כלי (קווים אדומים אלכסוני) (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי למדוד את המרחק intervascular, אחד צריך מוגדר מרחק מסויים הוועד האולימפי כסטנדרט (איור 12A, חץ כפול הלבן), צייר קו אופקי דמיוני (איור 12A, קו לבן אופקי) מקביל הוועד האולימפי. המרחק בין כלי בקו זה הוסיף את, arithmetically בממוצע שווה למרחק intervascular. נקודות הסתעפות נספרים בתוך כל תמונה בכל פעם קיבול מפצלת ולהמשיך לומן כלי דם אחד או יותר מתוך נקודת המוצא. זה כולל גם חיבורים אופקי בין נימים. חשוב להישאר עקבי עם ניתוח ולהחליט אילו נקודות הסתעפות לספור ולשמור על כללים אלה לאורך כל הניסוי כולו כדי להפחית וריאציה מיותרת. לבלוב וסקולרית, כפי שמתואר ב- 12C איור, הינו פרמטר נוסף שאפשר לסמוך על כל תמונה כדי להעריך את ההשפעה על להערכת ברשתית. נבטים אנגיוגנזה לא בצע כמו ארקייד הירושה בין עורק מרכזי, הוועד האולימפי הבינלאומי ונוחות ליד החלקים החיצוניים של הרשתית. כדי להעריך קטרים כלי מסוים, נקודת כיוון שתמיד צריך ממנו מרחק קבוע מסמן את המדידה ספוט. המקור של העורק המרכזי בתוך הרשתית מספק כזה הדרכה עבור כלי גזע הראשי (איור 12D, לבן צלב). האזור שנכבש על ידי כלי (איור 12E, קווים אדומים אלכסוני) כאחוז של האזור ברשתית כל צפיפות כלי הדם, בעקיפין המתייחס לאזור avascular.
צריך להיות מורכבת קונאפוקלית סריקה מלאה של דוגמא אחת מהתמונות גבוהה לפרטים מרובים כדי לאפשר ויזואליזציה של hypersprouting נימי קטן. כדי למטב את זמן ומשאבים על שלב זה, יש להשתמש בהליך tilling אוטומטי עם עומק הסריקה כללי עבור כל אריח. הרכבה לא אחידה של הרשתית ניתן להגדיל באופן משמעותי את הזמן כדי לסרוק את להערכת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בגישה אופטימלי אחד רוצה לסרוק רק את שכבת כלי הדם (איור 13 ב', לבנה), אבל חלקית הכללת שזכתה יש לעיתים קרובות צורך.עוזבים את אורך עודף של עצב הראייה אחרי חיתוך, כמו גם את הקיצוצים כדי להשיג את שטוח-הר נמוך מדי, יכול להוביל הרכבה לא אחידה.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
איור 13: השוואה של הוא מכתים autofluorescence ברשתית דג זברה בוגרת. להערכת ברשתית בפוקוס מעל שזכתה (א). להערכת ברשתית (לבנה) מראה ירוק אות EGFP, רשתית שכבות המציגות ביריד חזקה autofluorescence (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
הכנת להערכת רשתית דג זברה תקין צריך הכשרה מוקדמת, גודל מדגם קטן עם dissectors מיומנת ותוצאות הכנה חריפה משתנות הם מגבלה הראשי של הטכניקה. בזמן הכנת tg(fli:EGFP) דג זברה העיניים מעניק תובנה מדינת להערכת מהר, הטכניקה עדיין משתמשת בסביבות 20 דקות של זמן עבודה לכל הרשתית עבור חוקר מנוסה. כל השלבים האלה הכנה עבור להערכת ברשתית חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ ויבתר, dissectors הצורך להישאר מרוכז כל הזמן כמו צעד זהיר פוטנציאלי יכול לגרום לכלי שבירה. בניתוח צריך להתאמן באופן קבוע כמו העדרות ממושכת מן הכנה מפחיתה את הסבירות של בניתוח שמירה על תקינות כלי השיט.
יתר על כן, הבדיקה נוספים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא עדיין מוגבלת, שכן רק מספר קטן של נוגדנים על רקמת מכרסמים ואנושי עובדים עם דג זברה. ניסויים מעוניין IHC מומלץ לחפש נוגדנים ספציפיים דג זברה, במיוחד כאשר עובדים עם מטרות חדשות. לחילופין, מומלץ להשתמש קווי כתב דג זברה נוספים אשר שימושיים ללמוד תאי מעבר להערכת בעיניים. אסטרטגיה זו, אולם, הוא זמן רב, כמו זה לוקח כמה חודשים כדי ליצור קווים דג זברה בוגרת הנושאות כתבים הטרנסגניים מרובים.
בכל זאת, דג זברה מהווה מערך ייחודי של יתרונות. הם קטנים יחסית, לשחזר בקלות. הם יכולים לגדול בשלבים למבוגרים במהירות, העוברים שלהם אופטימלי והתרופות הקרנה. השדה ברצון גדל והופך להיות ספרות יותר נגיש. עם היכולת ליצור הסתרה ג'ין-מהירות מהירה, שפע של transgene קרינה פלואורסצנטית כתב שורות, הבחירה עבור דג זברה רק מרוסנת על ידי שאלת המחקר שבחרת.

סוכרת היא מחלה מטבולית שהוגדרו על-ידי היפרגליקמיה הנובע הפרשת האינסולין לקוי או לקוי רקמת תגובה לאינסולין המופרש. העולמי מעריך כי מבוגרים 422 מיליון היו לחיות עם סוכרת 20141 , השכיחות של סוכרת ברחבי העולם צפוי לגדול ל 8-10% מהאוכלוסייה עד מלאך2, הפיכת סוכרת אחד של השדות המחקר מפתח במשך עשרות שנים. לחיות עם סוכר דם גבוה כרוני מוביל microvascular סיבוכים ארוכי טווח, כולל רטינופתיה סוכרתית, כלייתית פולינוירופתיה. הניהול ואת מניעת סיבוכים אלה קשים; אכן, סוכרת הופך להיות הגורם השכיח ביותר של קצה הבמה מחלת כליות (ESRD), מה שמוביל דיאליזה2, וסוכרת היא הגורם המוביל לעיוורון בקרב מבוגרים בגיל העמידה3.
הסיבות הראשונית של נזק microvascular בעין סוכרתית הן היפרגליקמיה כרונית, שינויים מטבוליים, כמו גם גורמי סיכון מסוימים (למשל, יתר לחץ דם, dyslipidemia), המוביל אל תפקוד אנדותל כלי הדם, pericyte הנשירה, ו רגרסיה נימי שתוצאתו שרוולים כלי הדם acellular. איסכמיה ברשתית וכתוצאה מכך הוא הגורם כורוידאלית, חדירות כלי דם מוגברת קידום התפתחות proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR)4. רטינופתיה סוכרתית זוהה בדרך כלל 37% של חולי סוכרת, בעוד סכנת הראייה רטינופתיה סוכרתית היה לקביעה 12% ממוסך עוקבה אירופאי לבן המחקר UKADS5. הטיפול הנוכחי יכולים רק למנוע סיבוכים, והוא לא מסוגל לשחזר במלואה את הנזק כבר המושרה. Photocoagulation Panretinal, בנוסף הבקרה הגליקמית, הוא הטיפול הסטנדרטי עבור proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR) אבל משפיע גם הרקמה הבריאה סמוכים. אנטי-VEGF התערבויות מראים תוצאות מבטיחות כחלופות לייזר טיפול6,7, אבל בסופו של דבר, טיפול מיוחדים, ממוקד, תרופות חדשות יש צורך לנהל את המספר הגדל והולך של חולים בסיכון של אובדן ראייה.
הדגמים מבוססת מחקר בבעלי חיים של רטינופתיה סוכרתית אופטימיים כל היבט של פתופסיולוגיה אנושי. ניצול של המין הנכון כדי לטפל הדרישות הספציפיות של שאלת המחקר המדעי הוא אחד החלקים הכי משמעותי של ההתקנה ניסיוני. העובר דג זברה (רזבורה rerio) כבר נעשה שימוש נרחב מחקר התפתחותי ומספק את הרקע המעשי אופטימלית של תמונות ציפורים או נוקאאוט גנים ספציפיים באמצעות morpholinos או טכניקה CRISPR/Cas98. ניתן להשתמש בשיטות אלה בקלות דג זברה לחקור גנים, אשר זוהו על ידי מחקרים האגודה ברמת הגנום בקנה מידה גדול (GWAS), יצירת תובנות מנגנון מסוים של התקדמות המחלה, הרגישות9. בזמן קצר דורי כמויות גדולות של הצאצאים, קל ו טיפול בעלות נמוכה, גוברת התמיכה assay הגדילו את הרלוונטיות של המודל דג זברה, במיוחד לאור הפוטנציאל הגדול עבור מידול המחלה המטבולית. שימור מנגנונים ביולוגיים דג זברה הוכח כבסיס לפיתוח טיפול תרופתי. לדוגמה, antidiabetic התרופה מטפורמין ו סימבסטטין להורדת כולסטרול הוכחו "לטפל" תנאים במודלים של מחנה/דקסמתזון-induced גבוהה PEPCK כולסטרול וביטוי היפרכולסטרולמיה דיאטה-induced10 , 11 , 12. זו תובנה לקידום מקיף שנשמרת מנגנונים מטבוליים נוספים נתמך על ידי המספר הגדל והולך של מודלים סוכרת דג זברה, באמצעות ניסויים כגון: לסירוגין הדגירה בפתרונות גלוקוז, Streptozotocin-induced אבלציה של תאי הבטא, בתיווך nitroreductase תאי בטא אבלציה באמצעות של מטרונידזול prodrug, סוכרת monogenic מתווכת באמצעות נוקאאוט גנטי pdx1 או נוקאאוט, כמו גם מודלים של עמידות לאינסולין מוגבר בשרירי השלד 12. אלה כבר הקים פרוטוקולים, הפרטים שהוזכרו לעיל של המין, ומדגימים היכולת לטפל ביעילות את הגנום במספר רב של דוגמאות כל היתרונות דג זברה לימוד המנגנון נהיגה מחלות מורכבות, כמו גם היכולת עבור התערבויות תרופתי מסך.
הבנה כללית של האנטומיה עין דג זברה בסיסי (איור 1) יש צורך בניתוח על מנת לנצל את דג זברה כמודל עבור angiopathy ברשתית. העין דג זברה יש שישה extraocular השרירים rectus ארבע, שני השרירים המלוכסן להוסיף בצד החיצוני של כדור הארץ-sclera13. הקרנית רקמה שקופה מכסה העדשה, ממשיך ישירות לתוך בסקלרה, המהווה את המעטפת החיצונית של העין. Sclera שאינם שקופים, יש משטח המשקף האור באופן חלקי, הוא פיגמנט חזק. העדשה עצמה היא יותר בצורת כדור מאשר המקבילה האנושית. הרשתית מורכב משלוש שכבות הגרעין של תאים עצביים בזמן מתן חמצן להערכת ברשתית קשורה קשר הדוק השכבה תא גנגליון הפנימית אבל לא בצורת רשת subretinal. כלי חיבור, לעומת זאת, לשקר sclera ועד רשתית, משויכים ברשתית פיגמנט האפיתל (RPE). רשת הנימים זו מספקת חמצן החלקים החיצוניים של הרשתית14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
איור 1: תיאור סכמטי של העין דג זברה בוגרת. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
פשוט ויזואליזציה של להערכת ברשתית יכולה להיות מושגת על ידי ניצול של קו דג זברה מהונדס tg(fli:EGFP)15. חלבון פלואורסצנטי ירוק, הביע תחת השליטה promotor כאשר שגיא בתאי האנדותל של להערכת הוא הבסיס עבור הפריט החזותי באמצעות מיקרוסקופ בשלבים מאוחר יותר סורק לייזר. זו מושגת באמצעות ניתוח של הרשתית דג זברה שלם-הרכבה של הרקמה. מודל הטרנסגניים זה מספק readout וסקולרית מהר ללא כל יישום של תיוג קרישה תוך-כלית או אימונוהיסטוכימיה כולה-הר. כדי לנתח רטינופתיה סוכרתית, דג זברה, תרגיל הכנה צעד אחר צעד, מתוקננת אמור להיות בשימוש בכל בניתוח.פרוטוקול הכנה הבאים מספק קבוצות מחקר אחרים את האפשרות בקלות להעריך שינויים בכלי הדם בכלי חשוף של העין דג זברה בוגרת ולספק הדרכה להקים ברוטינת לנתיחה ממוטב עבור הרשתית דג זברה.

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*6H20</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H20</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט</td><td>רוט</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (MS-222, טריקאין)</td> <td>סיגמא</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>רוט</td><td>9143.1</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>רוט</td><td>2267.3</td><td></td></tr><tr><td>פלואורומאונט-ג'י</td><td>תרמו-פישר</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>גריינר ביו אחד</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>צלחת שש בארות</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>מחט</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו פינצטה</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו דיסקציה מספריים</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים 501778</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופית</td><td>קארל רוט</td><td>H872.1</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי 22 מ"מ x 22 מ"מ</td><td>neoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>103512222 אזמל</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>Epi-Illumination</td><td>Leica</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי MZ10 F</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי SP5 DS</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ M80</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>קו דג זברה: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ראה הפניה 15</td></tr><tr><td>Mayer' s המטוקסילין</td><td>ד"ר ק. הולבורן & S&ouml; hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0.5% אאוזין</td><td>ד"ר ק. הולבורן & S&ouml; hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99,9% אתנול</td><td>רוט</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Merck</td><td>1,071,501,000</td><td></td></tr><tr><td>קסילול</td><td>רוט</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM 2165</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:egfp) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

רטינופתיה סוכרתית הוא הגורם המוביל לעיוורון בקרב מבוגרים בגיל העמידה. השכיחות העולה של סוכרת ברחבי העולם יגרום למניעת סיבוכים microvascular סוכרתית אחד משדות המחקר מפתח של העשורים הבאים. טיפול מיוחדים, ממוקד, תרופות טיפוליות חדישות נדרשים לנהל את מספר גדל והולך של חולים בסיכון של אובדן ראייה. דג זברה היא מודל חיה הוקמה לשאלות מחקר התפתחותי עם הגדלת רלוונטיות עבור מידול תהליכי מחלה מטבולית multifactorial. היתרונות של המין מאפשרים ויזואליזציה אופטימלית וסמים תפוקה גבוהה הקרנת גישות, בשילוב עם יכולת חזקה לדפוק את הגנים של עניין. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה לנזק neoangiogenesis או כלי קיבול. זו מושגת באמצעות ניתוח של הרשתית דג זברה שלם-הרכבה של הרקמה. ויזואליזציה של כלי חשוף ואז מבוצעת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הכתב EGFP ירוק לידי ביטוי להערכת ברשתית למבוגרים. הטיפול הנכון של הרקמה יוביל לתוצאות טובות יותר ופחות שבירה כלי פנימי כדי להבטיח את הפריט החזותי של מבנה כלי הדם שההודעה. יכול להיות מנוצל השיטה במודלים דג זברה של הרשתית vasculopathy קשורה לשינויים כלי האדריכלות, כמו גם neoangiogenesis.

כאן נדגים שתי דוגמאות להערכת רשתית בדג זברה tg(fli:EGFP) למבוגרים מורפולוגי טיפוסי: פעם דמיינו עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 9 א) ופעם אחת עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (איור 9B). מבנה הרשתית חשף מציג תבנית מאורגן. Autofluorescence חזק נתפסת ברשתית דג זברה, כאשר visualized עם מיקרוסקופ זריחה. לפיכך, ויזואליזציה של רק את שכבת כלי הדם באמצעות סריקת קונאפוקלית מומלץ להפחית קרינה פלואורסצנטית רקע ולהגדיל את הניגודיות. עבור רכישת התמונות מהר יותר או מצבים נתונים איכותי איפה מספיק, הוא המיקרוסקופ פלורסצנטיות חלופה אטרקטיבית.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
איור 9: תמונות נציג של tg(fli:EGFP) למבוגרים דג זברה להערכת ברשתית. שתי דוגמאות להערכת ברשתית מורפולוגי טיפוסי מוצגים: העורק המרכזי מתפשט לתוך כלי ראשי 5-7, אשר הסניף ואז לתוך רצף של אולמות. כל כלי נוסף לנקז לתוך הווריד במבניו (CV) מגביל את החלק החיצוני של כל עלה כותרת. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ זריחה ב- 2.5 x הגדלה (א). ויזואליזציה של להערכת הרשתית על ידי לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ דרך בשילוב 5 x 5 תמונה בודדת אריח סריקה (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
העורק חודר הרשתית בראש עצב הראייה, רוב דגימות, מתפשט לתוך כלי ראשי 5-7 (איור 10A). כלי ראשי אז הסניף לתוך רצף של אולמות ולהתחבר למעגל הפנימי אופטיים (IOC), המכונה גם את הווריד במבניו (CV), המקיפות את הדיסק אופטיים בפריפריה של הרשתית הנטען שטוח (ראה איור 10 ב'). הוועד האולימפי הוא הכלי ורידים זה מנקז דם עורקי על השפה הפנימית של כדור הארץ עינית (bulbus החוגי). להערכת רשתית דג זברה מציגה גם תחומי פעילות כלי הדם גבוהה עם הסתעפות של נימים, האנגיוגנזה הלבלוב (איור 10C). זו פעילות כלי הדם בעיקר ממוקם בסמיכות ליד הוועד האולימפי. חשוב לשים לב כי אותה העין יכולים להדגים שתי פעילויות גבוה ונמוך כלי הדם באזורים שונים של הרשתית (השווה איור 10 ב' ואת דמות 10C). באופן כללי, להערכת רשתית של דג זברה מראה יותר מקום avascular נימים פחות בין הענפים העיקריים אם בהשוואה, לדוגמה, הרשתית של עכברים17. צריך להיות מנותח בשתי העיניים של כל מדגם כי להערכת עשויים להשתנות בין פיקוח יחיד יכול להוביל הטיה.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
איור 10: יוגדל תחומי tg(fli:EGFP) למבוגרים דג זברה להערכת ברשתית ויזואליזציה. העורק הסתעפות לתוך כלי הראשי (א). נימים הרשתית באזור של פעילות כלי הדם נמוך חיבור למעגל אופטיים הפנימי (IOC) בחלק התחתון של התמונה (B). נימים הרשתית באזור של פעילות כלי הדם גבוהה מתחבר הוועד האולימפי (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
ארכיטקטורת והתפאורה מאוד של שכבות עצביים כבר נמצא דג זברה מ כ 72 h פוסט הפריה (hpf)18ואילך. הרשתית דג זברה בוגרת מציג את השכבות הבאות מבפנים החוצה (איור 11): שכבת תאים גנגליון (שזכתה), השכבה הפנימית plexiform (IPL), השכבה הפנימית גרעינית (להיכנס), השכבה החיצונית plexiform (OPL), השכבה החיצונית גרעינית (גרת), שכבה קולט אור (PL), רשתית פיגמנט האפיתל (RPE). הערכת פרמטרים כלי הדם של הרשתית להערכת ויזואליזציה מוצג באיור12. להערכת ברשתית הפנימי ממוקם על הרובד תא גנגליון (שזכתה) (איור 13 ב', לבנה) בעת חיבור נימים יהיה משוייך ברשתית פיגמנט האפיתל (RPE).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
איור 11: הוא מכתים של העין דג זברה בוגרת. סקירה כללית של חתך הרוחב של העין כל לאחר הסרת העדשה (א). שכבות הרשתית של דג זברה למבוגרים העין19 (B). חיווי (חץ שחור) נקודת השבירה טבעי ב- PL (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן, אנו נדון פרוטוקול השיטה אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה neoangiogenesis ושינויים מבניים.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול דיסקציה זה עבור כלי הדם ברשתית של דג הזברה הבוגר היא לספק קריאה מהירה בהגדרות של פתולוגיות כלי דם ארוכות טווח הקשורות לניאואנגיוגנזה ושינויים מבניים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית או סריקת לייזר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסיבוכים המיקרו-וסקולריים כגון התפתחות רטינופתיה סוכרתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להציג ולנתח את כל הרטינובסקולטורה בתהליכים פיזיולוגיים ומחלות ללא כל יישום של פלואורסצנציה בין-וסקולרית בצורה מהירה וסטנדרטית יחסית.כדי להתחיל, העבירו שישה מיליליטר של תמיסת PFA PBS שהוכנה טרייה של ארבעה אחוזים לדגימה לבארות של שש צלחות באר. לאחר המתת חסד של דגי זברה בוגרים לפי פרוטוקול הטקסט, הניחו אותם על מגבות נייר טריות וייבשו אותם. השתמש באזמל וחתוך את הראשים מאחורי האופרקולום.ואז העבירו את הראשים ישירות לבארות של קיבוע טרי שהוכן לאחרונה. אחסן את הצלחות המכילות את ראשי הדגים בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות כדי להבטיח שהקיבוע חודר לשכבות הרשתית העמוקות יותר. עם אגרוז מחומם של שני אחוזים, ממלאים צלחת פטרי עד שליש ומחכים עד שהאגר יציב.כסו את צלחת האגר ב-X PBS אחד כדי ליצור סביבת עבודה לניתוח העיניים. מעבירים את הדגימה הקבועה לצלחת הפטרי. ועל ידי החזקת הראש במשטח החתוך עם פינצטה אחת, הכנס פינצטה נוספת, מוצמדת יחד מתחת לגלגל העין בחלל המסלול.פתחו לאט את הפינצטה מתחת לעין ואחזו בעצב הראייה. ואז לקרוע בזהירות ולנתק את העין. כדי להסיר כל אחד מארבעת פי הטבעת ושני השרירים החוץ-עיניים האלכסוניים המחוברים לעין, כמו גם שאריות של רקמה חוץ עינית המחברת את העין לחלל המסלול, החזיקו את העין באמצעות פינצטה סגורה למחצה ואחזו במבנה בפינצטה השנייה השתמשו בתנועה קוטרית כדי לקרוע אותה ברכות.לאחר מכן, השתמש במחט חד פעמית בגודל 27 כדי לנקב את הקרנית בטווח החיצוני. דרך פתח זה השתמשו בשתי הפינצטות כדי להחזיק את הקרנית ולקרוע אותה מעט. לאחר מכן עבדו בזהירות כדי ליצור קרע ממורכז בערך בגודל האישון המתאים.הפעל לחץ על צד הקרנית של גלובוס העין בקצה הקרנית החיצוני מעל הקשתית. זה ייצור שקע קטן וידחוף את העדשה לגובה הקרע בקרנית. לאחר מכן הפעל את הפינצטה מתחת לעדשה והסר אותה.לאחר מכן, הפוך את העין כשעצב הראייה פונה כלפי מעלה. שימו לב שהסקלרה והקרנית מחוברות ויוצרות את הטוניקה הסיבית של הנורה כדי להגן על הרשתית בצורת. מעטפת זו, המכונה קורנסקלרה חוסכת את האזור סביב עצב הראייה.הכנס מחט בהפסקה זו כדי ליצור פתח בין הסקלרה לרשתית. לאחר מכן, באמצעות גישה זו עם שתי הפינצטה, קרע בזהירות את הסקלרה באופן צירי לרצועות כדי להגדיל את הפתח סביב עצב הראייה. הקפד לשמור על הקורנסקלרה שלמה במעבר להיקף הצד של הקרנית.לפני הסרת הקורנסקלרה מהרקמה התוך-עינית שנותרה, נסה להחמיר קשרים כלשהם מכיוון שהיצמדות למבנים אחרים תהיה נקודה קריטית. לאחר מכן החזק את הסקלרה בפינצטה אחת ועל ידי תפיסת עצב הראייה בשנייה ומשיכה, הסר את הקורנסקלרה לחלוטין מהעין והשליך אותה. שלב זה יספק מבנה בצורת המורכב מהענביה והרשתית המכילה את כלי הדם ברשתית.לאחר מכן, צור קרע בשכבת הכורואיד וה-RPE על ידי החזקת מחט בגודל 27 לצדדים לכוס הנותרת תוך גרידת המשטח החיצוני עם שפת קצה המחט. השתמש בקרע כנקודת גישה כדי להשיג אחיזה בשכבת הכורואיד וה-RPE והשתמש בשתי הפינצטות כדי לקרוע אותה לפסים תוך שמירה על החיבור לקשתית שלם. לאחר מכן, העבירו פינצטה אחת מתחת לקשתית והזיזו אותה במעגל מבחוץ תוך יצירת מתח על ידי משיכת שכבת הכורואיד וה-RPE שהופסקה וניתקו את המבנה המשולב.אם לא ניתן להסיר חלקים מהקשתית ולהישאר מחוברים לרשתית בצורת לאחר הסרת שכבת הכורואיד וה-RPE השתמש בנקודת שבירה טבעית נוספת שעין דג הזברה הבוגרת מציגה בתוך שכבת קולטני האור. באופן דומה רק מודגם להסרת הקשתית. מגרדים מעל הרשתית הנותרת בצורת כדי לגרום להפסקות בשכבת קולטני האור.לאחר מכן השתמש בגישה שנוצרה כדי להסיר את השכבה תוך שמירה על החיבור האפשרי לקשתית שלם. לאחר מכן, העבירו את הפינצטה מתחת לקשתית והמשיכו במעגל כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה כדי לנתק את המבנה המשולב. חיוני לנתק את הקשתית מהרקמה הבסיסית שלה בצורה הגיונית מכיוון שהיא תחסום את הקרינה ישירות מעל המעגל האופטי הפנימי במהלך הדמיה של כלי הדם.גישה ישירה מדי עלולה להוביל לשבירת כלי שיט. לאחר מכן השתמש במספריים קפיציים מיקרו-דיסקציה עם קצה חיתוך ישר של שני נקודות חמישה מילימטר כדי לחתוך את עצב הראייה קרוב ככל האפשר לרשתית. זה יאפשר הרכבה שטוחה טובה יותר של הרקמה.כדי להרכיב ולדמיין את כלי הדם ברשתית, השתמש ב-X PBS אחד כדי לשטוף את הרשתית המנותחת פעמיים במשך חמש דקות כל אחת. הניחו טיפה של PBS על מגלשת זכוכית. לאחר מכן בעזרת מרית מעבדה עם קצה כף, העבירו את הרשתית לטיפה.בעזרת פינצטה שמרו על הרקמה במקומה תוך שימוש באזמל כדי לחתוך את המבנה בצורת ליצירת צורה שטוחה של ארבעה עלי כותרת או חמישה עלי כותרת, בהתאם לגודל הרשתית. בעזרת פיסת נייר דקה מוצצים את השמאל מעל PBS, נזהרים לא לגעת ברשתית. לאחר מכן מצפים את הרשתית המותקנת השטוחה במדיום הרכבה ומכסים אותה בכיסוי.היזהר לא ליצור קצף מכיוון שבועות אוויר עלולות לעוות את ההדמיה של כלי הרשתית. השתמש בלק כדי לאטום את הכיסוי. לבסוף, בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי או סריקת לייזר כדי לדמיין את כלי הדם ברשתית.מוצגת כאן דוגמה מורפולוגית של כלי הדם ברשתית בדג זברה EGFP זבוב טרנסגני בוגר המוצג במיקרוסקופ פלואורסצנטי ודוגמה שנייה שצולמה במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המפחית את הקרינה ברקע. מבנה הרשתית שנחשף מראה דפוס מאורגן מאוד. עורק הראייה חודר לרשתית בראש עצב הראייה וברוב הדגימות מתפשט לחמישה עד שבעה כלי דם עיקריים.לאחר מכן הכלים העיקריים מסתעפים לרצף של ארקדות ומתחברים למעגל האופטי הפנימי או IOC, הנקרא גם הווריד ההיקפי, המקיף את הדיסק האופטי בפריפריה של הרשתית המותקנת השטוחה. רשתית דג הזברה הבוגרת מורכבת מהשכבות הבאות מבפנים החוצה. שכבת תאי הגנגליון, שכבת הפרספקס הפנימית, השכבה הגרעינית הפנימית, שכבת הפרספקס החיצונית, השכבה הגרעינית החיצונית, שכבת קולטני האור והאפיתל הפיגמנטי של הרשתית.הערכת פרמטרי כלי הדם מהדמיית כלי הדם ברשתית מוצגת כאן. כלי הדם הפנימיים של הרשתית ממוקמים על שכבת תאי הגנגליון ואילו הנימים הלבביים יהיו קשורים לאפיתל הפיגמנטי של הרשתית. לאחר האימון, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-20 דקות אם היא מבוצעת כראוי.כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור להתאמן באופן קבוע מכיוון שהיעדרות ממושכת מההכנה מפחיתה את התוצאה של שלמות כלי הדם. בעקבות הליך זה ניתן לנתח סוכרת ופתולוגיות נוירו-וסקולריות בדג זברה בוגר.

studying-diabetes-through-eyes-fish-microdissection-visualization

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון...

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

פרוטוקול זה אינו פולשני גורם היפרגליקמיה ב zebrafish עד 8 שבועות. באמצעות פרוטוקול זה, מחקר מעמיק של ההשפעות השליליות של היפרגליקמיה יכול להתבצע.

טבילה חלופית בגלוקוז כדי לייצר היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

למד פרוטוקול ניתוח רשתית של דג זברה בוגר לניתוח מערכת כלי הדם ברטינה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של פתולוגיות וסקולריות וניאו-אנגיוגנזה במחלות כמו רטינופתיה סוכרתית.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

גלה סרטונים נוספים