באמצעות ניתוח פילוגנטי לחקור האיקריוטים מקור גנטי
14 באוגוסט 2018
מתוארת שיטה של בניית עץ פילוגנטי בהתבסס על הומולוגיה רצף של ממתקים פרוקריוטים, SemiSWEETs של אאוקריוטים. ניתוח פילוגנטי הוא כלי שימושי עבור המסביר את relatedness האבולוציוני בין חלבונים הומולוגיים או גנים מקבוצות אורגניזם שונים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיטוגנטי כגון כיצד לאסוף רצפים וכיצד לבחור את מודל החישוב הנכון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שקל מאוד ללמוד אותה. בדרך כלל, מי שחדש בשיטה זו עשוי להיאבק פשוט מכיוון שהוא לא יודע כיצד לטפל בנתונים בגלל חוסר ידע בסיסי בעקרונות ובשיטות הפילוגניה.
שיטה זו פותחה לראשונה כאשר ניתחנו את היישור של גנים אוקריוטיים SWEET. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שיש גודל של אפשרויות והגדרות להיבטים שונים של היישור. התחל הליך זה עם בחירה של 35 חלבוני SWEET מועמדים מאורגניזמים אוקריוטיים חד-תאיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
יישר את 35 רצפי ה-SWEET על ידי הזנתם ל-Clustal Omega. העתק והדבק את רצפי החלבון בפורמט FASTA בתיבת הקלט או העלה קובץ רצף בפורמט FASTA. ציין שמדובר ברצף חומצות אמינו על ידי לחיצה על הסמל מתחת לתפריט הנפתח בסעיף שלב ראשון.
ציין את פורמט הפלט ופרמטרים אחרים בסעיף שלב שני במידת הצורך. עבור מחקר זה, הגדר את פורמט הפלט כ-Clustal ללא מספר והשאר את הפרמטרים האחרים בהגדרות ברירת המחדל. ברוב המקרים, פרמטרי ברירת המחדל עובדים היטב ללא כל מפרט.
שלח והפעל את היישור בסעיף שלב שלוש. ייתכן שיחלפו בין מספר שניות לדקות עד לסיום היישור. בחלונית Result Summary , לחץ לחיצה ימנית על הקישור תחת Alignment in CLUSTAL format ושמור את הרצפים המיושרים כ- 35.clustal.
כדי לפתוח את קובץ תוצאת היישור ב-BioEdit, לחץ על רצף ובחר ערוך מצב רוח בתפריט הנפתח הראשון בחלונית הראשית של BioEdit. לאחר מכן לחץ על ערוך שאריות בתפריט המשנה. בחר את הרצפים הבולטים בצד שמאל של היישור עם הסמן ולחץ על הסמל מחק מתחת לתפריט עריכה כדי להסיר את הרצפים שנבחרו.
בחר ומחק את הרצפים בצד ימין של תחום הרוק הראשון של MtN3 ושמור את רצפי תחום הרוק הראשונים של MtN3 שנחתכו כ- 35-1.fas. באופן דומה, מחק את רצפי הצד השמאלי והימני של תחום הרוק השני של MtN3 ושמור אותו כ- 35-2.fas. ניתן לחזות מראש את רצפי תחום הרוק הראשון והשני של MtN3 באמצעות קצב או TMHMM.
פתח את הקובץ 35-1. fas עם MEGA ולחץ על ישר כאשר תתבקש. תחת תפריט עריכה, לחץ על בחר הכל.
לאחר מכן לחץ על Select Sequences. השמות והרצפים של הטקסונים ייבחרו בשחור. בחר Copy מתפריט Edit כדי להעתיק את הרצפים ללוח ולאחר מכן להדביק את הרצפים שהועתקו בקובץ doc.
בקובץ ה-doc, החלף את כל סימני המספרים בסימן הגדול מ-ולאחר מכן מחק את כל התווים הלא קשורים כדי להמיר אותם לפורמט FASTA. הוסף 1 בסוף כל שם טקסון כדי לסמן אותם כרצפי תחום הרוק הראשונים של MtN3. עבד את רצפי תחום הרוק השני של MtN3 באותה שיטה והוסף 2 אחרי כל שם טקסון.
כעת שלב את רצפי תחום הרוק הראשון והשני של MtN3 בפורמט FASTA בקובץ מסמך. כדי לעשות זאת, טען שוב את הרצפים המשולבים לתוך Clustal Omega ויישר את הרצפים כמו קודם. שמור את התוצאה כ- 35realigned.clustal.
פתח את ה-35realigned. קובץ clustal ב-BioEdit. מחק את שאריות חומצות האמינו הלא אחידות בשני קצות הרצפים המיושרים ולאחר מכן שמור את הרצפים כ- 35realigned.fas.
לחץ על כן כאשר אתה מזהיר שלא ניתן לשמור תווים לא סטנדרטיים מסוימים. פתח 35מיושר מחדש. fas ב-MEGA.
לחץ על תפריט נתונים ובחר ייצוא יישור. לאחר מכן שמור את היישור בפורמט POP כ- 35. הבא לשימוש מאוחר יותר ב-MR Base.
בינתיים, לחץ על סמל הדגמים בפאנל הראשי של MEGA. בחר מצא את דגמי חלבון ה-DNA הטובים ביותר ולחץ על אישור בחלון המוקפץ. לחץ על מחשוב כדי להתחיל בתהליך חיפוש המודל.
לוח התקדמות חדש ייפתח. תהליך זה נמשך מספר דקות עד מספר ימים בהתאם למורכבות הרצפים הטעונים וביצועי המחשב. טבלה המציגה את התוצאות תיפתח לאחר סיום תהליך חיפוש המודל.
ציון ה-BIC הקטן ביותר יופיע ראשון ואחריו סדרה של מודלים שונים עם ציוני BIC הולכים וגדלים בהדרגה. המודל הראשון LG + G + F עם ציון ה- BIC הקטן ביותר הוא המודל המומלץ עבור עץ ה- ML המבוסס על 35 מיושר מחדש. FAS.
לאחר מכן, לחץ על סמל פילוגנזה בלוח הראשי של MEGA. לחץ על בנה/בדוק את עץ הסבירות המקסימלית ולאחר מכן לחץ על כן בחלונית הקופצת. ייפתח חלון חדש המציג פרמטרים שונים שיש לציין.
ראשית, הגדר את ערך האתחול במבחן של תיבת הפילוגניה. 500 או 1,000 מספיקים ברוב המקרים. תחת מודל ההחלפה, בחר חומצת אמינו כסוג ההחלפה.
מטרת בחירת מודל החלפה היא להעריך את ההבדל האמיתי בין רצפים על סמך מצבם הנוכחי. בחר LG עם מודל תדרים בתיבה מודל ושיטה. בתיבה תעריפים ותבניות, בחר גאמה המחולקת כדי לתאר וריאציות קצב בין אתרים, כגון מתן משקל רב יותר לשינויים באתרים המתפתחים לאט.
בתיבה ערכת משנה של נתונים, בחר מחיקה מלאה כדי להסיר את כל העמודות המכילות מקפים. שמור את כל הפרמטרים האחרים במצבי ברירת המחדל שלהם. לאחר פירוט פרמטרים אלה, לחץ על סמל מחשוב כדי להתחיל בחישוב.
עץ ML פילוגנטי יוצג בסיום החישוב באמצעות MEGA. תחת התפריט הנפתח של סמל קובץ בחלונית עץ, בחר שמור הפעלה נוכחית כדי לשמור את התוצאה. במחקר הנוכחי, התוצאה נשמרה כ-35.mas.
בחלונית Tree, פרמטרים רבים, כולל אורך הקלייד, סגנון העץ, טופולוגיית העץ, גופן שם הטקסון, גודל וצבע, מוצגים וניתן להגדיר אותם לאפשרויות שונות. שמור את קובץ העץ הסופי על ידי לחיצה על תמונה סמל ושמור את הדמות בפורמטים שונים או העתק את התמונה כמקור לעריכת תמונות. המשך בניתוח הקשר בין SWEETs ו-semiSWEETs וכן שימוש בבניית העץ הפילוגנטי של יישור הרצף עם MR Base כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
עצים פילוגנטיים מראים שכל תחומי הרוק הראשונים של MtN3 של 35 רצפי SWEET מקובצים כקלידה אחת ותחומי הרוק MtN3 השניים של רצפי SWEET מקובצים כקלידה אחרת. בנוסף, תוצאות היישור של ה-SWEETs וה-semiSWEETs מראות שחלק מה-semiSWEETs מ-Alpha-Proteobacteria מיושרים עם תחום הרוק הראשון של MtN3 של רצפי ה-SWEET בעוד ש-semiSWEETs מ-Methanobacteria מיושרים עם תחום הרוק השני של MtN3 של רצפי ה-SWEET. תוצאות אלה יחד מצביעות על כך ששני תחומי הרוק של MtN3 המכילים SWEETs עשויים להיגזר ממיזוג אבולוציוני של חיידק למחצה וארכאי.
לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה עד מספר ימים בהתאם למורכבות הנתונים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לאסוף רצפים באיכות גבוהה מראש. לאחר פיתוחו, פרוטוקול זה סלל את הדרך לחוקרי אבולוציה לחקור את הקשרים בין גנים הומולוגיים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות עץ פילוגנטי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לבניית עץ פילוגנטי המבוסס על הומולוגיה של רצפים של SWEETs מאוקריוטים ו-SemiSWEETs מפרוקריוטים. הטכניקה היא ידידותית למשתמש ומסייעת בהבנת קשרים אבולוציוניים בין חלבונים או גנים הומולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פילוגנטיקה
- אבולוציית חלבונים
- ניתוח רצפים
רקע
- ניתוח פילוגנטי מסייע בהסבר של קרבה אבולוציונית.
- הבנת חלבוני SWEET ו-SemiSWEET היא קריטית למחקרים אבולוציוניים.
- מבצעים חדשים עלולים להתקשות בטיפול בנתונים עקב חסר בידע בסיסי.
- הדגמות חזותיות משפרות את הבנת השיטה.
מטרת המחקר
- מתן מתודולוגיה ברורה לבניית עצי פילוגינומיים.
- סיוע בבחירה של מודלים חישוביים מתאימים.
- סיוע לחוקרים באיסוף וניתוח של נתוני רצפים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירה של 35 חלבוני SWEET מועמדים מאוקריוטים חד-תאיים.
- יישור של גני SWEET אוקריוטיים.
- שימוש בהגדרות שונות עבור היבטי היישור.
- הדגמות חזותיות להדרכת המשתמשים במהלך התהליך.
תוצאות עיקריות
- השיטה מפשטת את תהליך האנליזה הפילוגנטית.
- היא מספקת מסגרת להבנת אבולוציית חלבונים.
- משתמשים יכולים לטפל בנתוני רצפים באופן יעיל עם הנחיה נכונה.
- עזרים חזותיים משפרים באופן משמעותי את תוצאות הלמידה.
מסקנות
- שיטה זו נגישה עבור חוקרים שאינם מומחים בתחום הפילוגנטיקה.
- היא מגשרת על הפער שבין הידע התאורטי ליישום המעשי.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על מתודולוגיה יסודית זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח פילוגנטי של משפחות חלבונים, כגון נשאי SWEET, מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרת מקורות אבולוציוניים וגיוון תפקודי. גישה זו תומכת בתיקוף מטרה על ידי הבחנה בין דומיינים שמורים לבין חידושים ספציפיים לשושלות, ובכך מפחיתה עמימות ביצירת השערות. תובנות לגבי אירועי היתוך גנים מסייעות בגיבוש אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים ובבחירת מודלים פרה-קליניים עבור נתיבים הקשורים להובלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר ארכיטקטורת הדומיינים עד לאבות קדמונים פרוקריוטיים וארכאליים.
- ערך תפעולי: הבהרת תיקוף של מטרה פונקציונלית באמצעות שימור אבולוציוני של דומייני MtN3 ברוק saliva בחלבוני SWEET.
- ערך חיזוי: תמיכה במיון תיקי מוצרים (portfolio triage) באמצעות זיהוי אזורים מוגבלים אבולוציונית, הפחותים בעמידות למנגנונים מפצים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף באמצעות הגדרת גבולות דומיינים לבניית חלבונים כימריים.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות דומיינים של MtN3 המיושרים לפי רצף, המשמשים כמדדים כמותיים לפעילות הנשא.
- יכולת הרחבה: מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות תהליכי עבודה של Clustal Omega ו-MEGA לסריקת משפחת ה-SWEET בין מינים שונים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי אישור שימור הדומיין על פני איקריוטים ופרוקריוטים.
- התאמת ביומרקרים: תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קורלציה בין שונות דומיין SWEET לתוצאות פנוטיפיות של הובלת סוכרים.
- קידום מותאם סיכון: מספקת מידע להחלטות go/no-go על ידי הדגשת מגבלות אבולוציוניות של סבילות מוטציונית במטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת הקשר אבולוציוני לתפקוד החלבון.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי הבהרה אם תפקוד SWEET שנצפה נובע מירושה אנכית או מהעברה אופקית של גנים.
- סינון (Screening): מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות דומייני MtN3 מיושרים כיחידות יציבות וכמותיות לסינון בסריקה רחבה (high-throughput screening).
- אנליטיקה: מדגיש את תוצרי Maximum Likelihood ו-Bayesian Inference כמדדים סטטיסטיים של ביטחון הקלייד (clade confidence) לצורך תעדוף יעדים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי תיקוף שימור הדומיין כמדד (proxy) לשימור התפקוד במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את זרימת העבודה של Clustal Omega-MEGA-MrBayes כיכולת הניתנת לשימוש חוזר לצורך הפחתת סיכונים (de-risking) של משפחות נשאים (transporter families) לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בבחירת מטרה באמצעות הפחתת סיכונים אבולוציונית של הנחות מכניסטיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והסבירות לשחזור באמצעות פרמטרי יישור קבועים וקריטריונים לבחירת מודל (LG+G+F).
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקה של הפיתוח (go/no-go), על ידי הפחתת הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב שיוך שגוי של מנגנון המטרה.
- השפעה על פורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על מדדי אילוץ אבולוציוני הנגזרים מתמיכה של קלייד פילוגנטי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור רצפים, בדיקת מודלים פילוגנטיים ופירוש עצי שושלה.
- תלוי בגישה ל-Clustal Omega, MEGA ו-MrBayes לצורך יישור ובניית עצי שושלה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים בנוגע לפרוטוקולים של קיורציה של רצפים ובחירת מודלים.
- כולל שיקולי התאמה בעת היישום על משפחות חלבונים שאינן נשאיות (non-transporters) בעלות ארכיטקטורות דומיין שונות.
- מוגבל בשל חוסר היכולת לאשר שקילות תפקודית של מצבים אבודים שהוסקו ללא תיקוף ניסיוני.
