Name: Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: למדו לזהות זרחון Rab10 על ידי LRRK2 באמצעות SDS-PAGE עם תג מחייב פוספט. שיטה זו מאפשרת הערכת סטויכיומטריה ב-Western blot פשוט ומסייעת בחקר מחלת פרקינסון ומוטציות LRRK2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר טאקאשי Iwatsubo (אוניברסיטת טוקיו, יפן) בחביבות לספק את פלסמידים קידוד 3xFLAG-LRRK2 WT ו מוטנטים. אנו מודים גם ד ר אולאסי דריו (אוניברסיטת של דנדי, בריטניה) למתן בחביבות MLi-2 ואת פלסמיד קידוד HA-Rab10. עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) KAKENHI גרנט מספר JP17K08265 (ג'י. איי).

<ol><li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+symptoms+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li>
<li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+in+Parkinson+disease%3A+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li>
<li>Paisán-Ruíz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Gilks, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+LRRK2+mutation+in+idiopathic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease.</a> Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Klein, C., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson%27s+disease%3A+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).</li>
<li>Ozelius, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+North+African+Arabs%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).</li>
<li>Bouhouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+Mutation%3A+Prevalence+and+Clinical+Features+in+Moroccans+with+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons.+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease.</a> Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).</li>
<li>West, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+is+essential+to+the+protein+kinase+activity+of+LRRK2%2C+a+causative+gene+product+for+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease.</a> Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).</li>
<li>Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-binding+tag%2C+a+new+tool+to+visualize+phosphorylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).</li>
<li>Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017).</li>
<li>Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038386">Immunoblotting and Immunodetection.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).</li>
<li>Reith, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK2578215A%3B+a+potent+and+highly+selective+2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide+LRRK2+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+potent%2C+selective+and+centrally+active+compound+for+exploring+the+therapeutic+potential+and+safety+of+LRRK2+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).</li>
<li>Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519(2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים שיטה נתיישב חזקה של גילוי Rab10 זרחון על ידי LRRK2 ברמות אנדוגני בהתבסס על המתודולוגיה P-תג. כי הנוגדן זמין כעת נגד phosphorylated Rab10 עובד רק עם חלבונים overexpressed15, השיטה נוכח ניצול P-תג מרחביות-דף היא הדרך היחידה להערכת רמות אנדוגני של זרחון Rab10. יתר על כן, השיטה הנוכחית מאפשרת את אומדן סטויכיומטריה של זרחון Rab10 בתאים. מאחר המתודולוגיה P-תג חל כללי פוספו-חלבונים, בפרוטוקול הנוכחי ניתן "טיפוס" להקמת שיטות דומות פוספו-חלבונים אחרים.
השלבים הקר...

משטרת היא אחת ממחלות ניווניות הנפוץ ביותר, בעיקר משפיע על נוירונים דופאמין במוח התיכון, והתוצאה היא חוסר תפקוד של מערכות מנוע קשישים1. בעוד רוב החולים לפתח PD באופן סדיר, יש משפחות הורשת המחלה. מוטציות בגנים מספר נמצאו יקושרו עם FPD2. הוא אחד הגנים סיבתי עבור FPD LRRK2, שבו שמונה missense מוטציות (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S ו I2020T) קשורה FPD דומיננטית תורשתית בשם PARK8 כה דווח על3,4,5. מספר מחקרים הגנום כולו האגודה (GWAS) של חולי PD סדיר גם זיהו גנומית וריאציות על מיקומה LRRK2 כגורם סיכון עבור PD, רומז ליקוי בפונקציה של LRRK2 הוא גורם נפוץ הקשורים ניוון מוחיים בשתי סדיר ו PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 הוא חלבון גדול (חומצות אמינו 2,527) בהיקף של תחום אני חוזר לאוצין-עשיר, הראס GTP-איגוד של חלבונים מורכבים (ROC) תחום, C-מסוף של תחום ROC (קור), תחום סרין/תראונין פרוטאין קינאז, תחום אני חוזר WD409. מוטציות FPD שמונה לאתר בתחומים פונקציונליים אלה; N1437H, R1441C/G/H/S בתחום ROC, Y1699C בתחום קור, G2019S ו- I2020T בתחום קינאז. מאז מוטציה G2019S, אשר נמצא לעתים קרובות ביותר מוטציה ב- PD חולים10,11,12, מגביר את פעילות קינאז LRRK2 על ידי קיפול במבחנה2-313, זה המשוערות כי העלייה חריג זירחון של LRRK2 substrate(s) רעיל נוירונים. עם זאת, זה כבר בלתי אפשרי ללמוד אם זירחון של סובסטרטים LRRK2 רלוונטי מבחינה פיזיולוגית היא שונה בחולים PD משפחתית/סדיר עקב המחסור של שיטות להערכת זה בדגימות נגזר החולה.
זירחון חלבונים מזוהה בדרך כלל על-ידי immunoblotting או מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) באמצעות נוגדנים במיוחד להכרת המדינה phosphorylated של חלבונים, או על ידי ניתוח המוני spectrometric. עם זאת, האסטרטגיה לשעבר לפעמים אין אפשרות להחיל בשל הקשיים ביצירת נוגדנים ספציפיים זירחון. תיוג מטבולית של תאים עם פוספט רדיואקטיבי הוא אפשרות נוספת לבחון רמות פיזיולוגיים של זרחון נוגדנים ספציפיים זרחון אינם זמינים. עם זאת, הוא דורש כמות גדולה של חומרים רדיואקטיביים, ולכן כרוך איזה ציוד מיוחד עבור המכון להגנת14. ניתוח spectrometric המוני הוא רגיש יותר לעומת שיטות immunochemical אלה והפך פופולרי בניתוח זירחון חלבונים. עם זאת, הכנת הדוגמא היא גוזלת זמן, כלי נגינה יקר נדרשים לניתוח.
תת-קבוצה של משפחת ראב GTPase כולל Rab10 ו- Rab8 דווח לאחרונה סובסטרטים פיזיולוגיים ישירים עבור LRRK2 בהתבסס על התוצאה של ניתוח phosphoproteomic בקנה מידה גדול15. אנחנו מכן הפגינו זרחון Rab10 הוגדל על ידי מוטציות FPD fibroblasts עובריים בעכבר, הריאות של knockin עכברים16. בדו ח זה, בחרנו להעסיק נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד)-המבוסס על שיטת שבו מולקולה P-תג הוא שותף polymerized לתוך ג'לים מרחביות-דף (P-תג מרחביות-עמוד) לגילוי הרמות אנדוגני של זרחון Rab10, כי נוגדן רגישה מאוד ספציפיות עבור phosphorylated Rab10 היה עדיין חסר. אנחנו נכשלנו לזהות זירחון של Rab8 אנדוגני בשל מידת הבררנות המסכן של נוגדנים זמין כעת עבור Rab8 סה לכן, החלטנו להתמקד זירחון Rab10. LRRK2 phosphorylates Rab10 ב Thr73 באיתור באמצע של אזור מאוד שנשמרת "להחליף II". גבוהה שימור האתרים זרחון בין חלבונים רב יכול להיות אחת הסיבות למה קשה לעשות נוגדנים phosphospecific זיהוי חלבונים ראב ברורים.
זירחון של Rab8A על ידי LRRK2 מעכב את הכריכה של Rabin8, גואנין נוקלאוטיד exchange גורם (בתאוריה) אשר מפעילה Rab8A על ידי החלפת התל מאוגד עם GTP15. זירחון של Rab10 ו- Rab8A על ידי LRRK2 מעכב גם את הכריכה של מעכבי התמ ג-דיסוציאציה (GDIs), המהווה מרכיב חיוני להפעלת ראב חלבונים על-ידי חילוץ התמ ג מכורך ראב חלבונים ממברנות15. באופן קולקטיבי, זה זה שיערו כי זירחון של ראב חלבונים על ידי LRRK2 מונעת מהם ההפעלה למרות המנגנון המולקולרי המדויק ואת ההשלכות הפיזיולוגיות של זירחון אינן ברורות.
P-תג מרחביות-דף שהומצאה על ידי קינוסיטה. et al. 2006: בשיטה זו, אקרילאמיד covalently תמיד עם P-תג, מולקולה לכידת פוספטים עם זיקה גבוהה, אשר copolymerized לתוך מרחביות-דף ג ' לים-17. כי המולקולות P-תג של ג'ל מרחביות-דף מפגר באופן סלקטיבי electrophoretic ניידות של חלבונים phosphorylated, P-תג מרחביות-דף יכול להפריד חלבונים phosphorylated אלה שאינם phosphorylated (איור 1). אם החלבון-של-העניין הוא phosphorylated על משקעים מרובים, יתקיימו סולם של להקות המתאים טפסים באופן שונה phosphorylated. במקרה של Rab10, אנו מבחינים הלהקה שהוסטו אחד בלבד, המציין כי Rab10 הוא phosphorylated רק ב Thr73. היתרון העיקרי של P-תג מרחביות-דף מעל immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים זרחון הוא כי ניתן להבחין phosphorylated Rab10 באמצעות immunoblotting עם נוגדנים לא זרחון-ספציפית (קרי, בזיהוי Rab10 סה) לאחר שהועבר על ממברנות, אשר בדרך כלל יותר ספציפיים, רגיש ו זמין ממקורות מסחריים/אקדמית. יתרון נוסף של השימוש P-תג מרחביות-דף זה כי הוא יכול להשיג אומדן משוער סטויכיומטריה של זרחון, שזה בלתי אפשרי immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים זרחון או על ידי תיוג מטבולית של תאים עם רדיואקטיבי פוספטים.
מלבד השימוש אקרילאמיד P-תג יקר כמה שינויים מזעריים הקשורות אליו, השיטה נוכח גילוי של זרחון Rab10 על ידי LRRK2 כדלקמן פרוטוקול הכללי של immunoblotting.לכן, זה צריך להיות ישירה בקלות הפעלה במעבדות כל איפה immunoblotting אימון כרגיל, עם כל סוגי דגימות כולל חלבונים מטוהרים, lysates תא של רקמת homogenates.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr>תמיסת <tr><td>מלח פוספט (DPBS)</td> <td>תוצרת בית</td><td></td><td>של Dulbecco 150 מ"מ NaCl, 8 מ"מ Na2HPO4-12H2O, 2.7 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ KH2PO4 in MilliQ מים ועוקרו על ידי חיטוי</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>נקלאי Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דיסודיום הידרוגנפוספט 12-מים</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2.5% טריפסין (10X)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>לדלל פי 10 עם DPBS סטרילי להכנת תמיסת עבודה</td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>מושבת בחום ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (100X)</td> <td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין HCl MAX, ליניארי, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>תמיסת מלאי הוכנה ב-20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.0 ב-1 מ"ג/מ"ל ולאחר מכן ה-pH הותאם ל-7.0 עם NaOH</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן(10) אוקטילפניל אתר</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>שווה ערך לטריטון X-100</td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>קאנטו כימיקל</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-חומצה גליצרופוספורית מלח דיסודיום פנטהידראט</td><td>נקלאי טסק</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירופוספט דקהידראט</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוציסטין-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>ממיסים טבליה אחת ב-1 מ"ל מים, שניתן לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C לחודש. השתמש בו בדילול של 1:50 לליזה תאים</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) ערכת בדיקת חלבון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>קאנטו כימיקל</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>תג מחייב פוספט אקרילאמיד</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-tag אקרילאמיד</td></tr><tr><td>40% (w/v) תמיסת אקרילאמיד</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>אקרילאמיד: Bis = 29: 1</td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td> <td>Wako</td><td>016-08021</td><td>תמיסה של 10% (w/v) הוכנה על ידי המסת אבקת אמוניום פרסולפט במי MilliQ</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>מנגן כלוריד טטרהידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus חלבון צבוע מראש</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>סמן משקל מולקולרי המשמש בפרוטוקול</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW סמן גודל חלבון צבוע מראש III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>קרום ניטרוצלולוזה</td></tr><tr><td>מסנן ממברנה Durapore</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>PVDF ממברנה</td></tr><tr><td>מסנן ניירות מסנן מס' 1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>פוליאוקסיאתילנסאורטן מונולאורט</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td> <td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב רזה</td><td>מעבדות Difco</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>תמיסת ECL (רגישות רגילה)</td></tr> <tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>תמיסת ECL (רגישות גבוהה)</td></tr> <tr><td>תמיסת צביעה CBB</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>1 גרם CBB R-250, 50% (v/v) מתנול, 10% (v/v) חומצה אצטית ב-1 ליטר מים</td></tr><tr><td>MilliQ CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB תמיסה</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>12% (v/v) מתנול, 7% (v/v) חומצה אצטית ב-1 ליטר MilliQ מים</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים</נוגדן חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נגד HA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11583816001</td><td>בשימוש ב-0.2 &mu; גרם/מ"ל לאימונובלטינג.</td></tr><tr><td>anti-Rab10 נוגדנים</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>בשימוש בשעה 1:1000 עבור אימונובלוטינג. הספציפיות אושרה על ידי CRISPR KO ב- Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>נוגדן anti-pSer935</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>בשימוש ב 1 &mu; גרם/מ"ל לאימונובלטינג.</td></tr><tr><td>נוגדן נגד LRRK2</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>בשימוש ב 1 &mu; גרם/מ"ל לאימונובלטינג.</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-&אלפא;-טובולין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>בשימוש ב-1 &mu; גרם/מ"ל לאימונובלטינג.</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GAPDH</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>בשימוש ב-0.02 &mu; גרם/מ"ל לאימונובלטינג.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>בשימוש ב-0.16 &mu; גרם/מ"ל לאימונובלטינג.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>בשימוש ב-0.16 &mu; גרם/מ"ל לאימונובלטינג.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>InhibitorsGSK2578215A</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>תמיסת המלאי של MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>הוכנה ב-DMSO ב-10 מ"מ ואוחסנה ב-80 מעלות; C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>סופק על ידי ד"ר דריו אלסי (אוניברסיטת דנדי)</td><td></td><td>תמיסת המלאי הוכנה ב-DMSO ב-10 מ"מ ואוחסנה ב-80 מעלות; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/strong<></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT ל-HA</td><td>שסופק על ידי ד"ר דריו אלסי (אוניברסיטת דנדי)</td><td></td><td>פלסמיד זה מבטא Rab10 אנושי מתויג HA.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>איטו ואחרים, ביוכימיה, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). פלסמיד זה מבטא LRRK2 אנושי מסוג פרא מתויג באמינו 3xFLAG.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>איטו ואחרים, ביוכימיה, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). פלסמיד זה מבטא מוטציה לא פעילה K1906M קינאז מתויגת אמינו-טרמינלית של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>מאמר זה. פלסמיד זה מבטא מוטציה N1437H FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441C FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441G FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441H FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>מאמר זה. פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441S FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה Y1699C FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה G2019S FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)</td><td></td><td>קאמיקאוואג'י ואחרים, ביוכימיה, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה I2020T FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה<</td><td>strong>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>Forma Series II 3110 פיפטה אוטומטית עם מעטפת</td><td></td>מים</tr><tr><td></td><td>דראמונד</td><td>Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash; 10 &mu; L</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &mu; L</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash; 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטה P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td></td></tr><tr><td>טיפים סטריליים למיקרופיפטה P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td></td></tr><tr><td>טיפים סטריליים למיקרופיפטה P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה ניתנת לחלוקה</td><td>גריינר</td><td>606180</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה ניתנת לחלוקה</td><td>גריינר</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 25 מ"ל פיפטה ניתנת לחלוקה</td><td>פלקון</td><td>357535</td><td></td></tr> סטרילי <tr><td>המטוציטומטר</td><td>זכוכית עופרת</td><td>שמש A126</td><td>מיקרוסקופ נויביואר משופר</td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ כלים</td><td>פלקון</td><td>353003</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>AGC טכנו זכוכית</td><td>3810-006</td><td>לתרבית</td></tr> <tr><td>רקמותמערבל מערבולת</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>מגרדי תאים</td><td>Sumitomo Bakelite</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>AGC טכנו זכוכית</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>AGC טכנו זכוכית</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגות</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>גריינר</td><td>655061</td><td>לא לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; מיכלי PAGE</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי העברה</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>צלחות ג'ל (מחורצות)</td> <td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>צלחות ג'ל (רגילות)</td> <td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>מרווחי סיליקון</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>מסרקים 17 בארות</td><td>Nihon Eido</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית</tr><tr><td>קליפס קלסר</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 5 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>תחנת כוח 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>ספק כוח עבור SDS&ndash; עמוד והעברה</td></tr><tr><td>סירות שקילה גדולות</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי פלסטיק</td><td></td><td>כמארז PS אחד מס'</td><td>4 10 x 80 x 50 מ"מ</td></tr><tr><td>שייקר נדנדה</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>קופסת קצף סטירן</td><td>גנרית</td><td></td><td>המידות הפנימיות צריכות להתאים למיכל העברה אחד (200 x 250 x 250 מ"מ).</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>צילום מצויד במצלמת CCD מקוררת לזיהוי ECL</td></tr></tbody></table>

rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות lrrk2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

מוטציות בגן עשיר לאוצין קינאז חוזר 2 (LRRK2) הוכחו להיות מקושר עם משפחתית מחלת פרקינסון (FPD). מאז הפעלת נורמלית של פעילות קינאז LRRK2 היה מעורב בפתוגנזה של המשטרה, זה חיוני להקים שיטה להעריך את רמות פיזיולוגיים של פעילות קינאז LRRK2. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי LRRK2 phosphorylates בני משפחת ראב GTPase, כולל Rab10, בתנאים פיזיולוגיים. למרות זירחון של Rab10 אנדוגני מאת LRRK2 בתאים בתרבית יכול להתגלות על ידי ספקטרומטר מסה, זה היה קשה לזהות את זה על-ידי immunoblotting עקב הרגישות המסכן של נוגדנים ספציפיים זרחון זמין כעת עבור Rab10. כאן, אנו מתארים פשוט שיטת זיהוי הרמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי LRRK2 בהתבסס על immunoblotting ניצול נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) בשילוב עם תג מחייב פוספט (P-תג), אשר הוא N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- טריס (pyridin-2-yl-מתיל) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. בפרוטוקול הנוכחי לא רק מספק דוגמה של המתודולוגיה ניצול P-התג אלא גם מאפשרת את ההערכה של מה מוטציות וכן מעכב טיפול/ניהול או כל גורמים אחרים לשנות באיתות במורד הזרם של LRRK2 ב תאים ורקמות .

ביטוי מערכת: זירחון של HA-Rab10 על-ידי 3 × הדגל-LRRK2 ב HEK293 תאים:
HEK293 התאים היו transfected עם µg 0.266 של HA-Rab10 פראי-סוג של 1.066 µg של 3 × הדגל-LRRK2 (מוטציה פראי-סוג, לא פעיל-קינאז (K1906M), או מוטציות FPD). זרחון Rab10 נבדק על ידי P-תג מרחביות עמודים ואחריו immunoblotting באמצעות של אנטי-HA נוגדנים (איור 2). 10 µg של חלבונים היו להפעיל על ג'ל 10% (80 x 100 x 1 מ מ) המכיל 50 מיקרומטר P-תג א...

המחקר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה של גילוי רמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי לאוצין-עשיר אני חוזר קינאז 2.

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות את זרחון Rab10 על ידי LRRK2 באמצעות SDS-PAGE עם תג קושר פוספט. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של פרקינסון, כגון כיצד מוטציות מחלה ב-LRRK2 משפיעות על זרחון Rab10. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבל הערכה גסה של הסטוכיומטריה של זרחון Rab10 באמצעות כתם מערבי פשוט.רבים מהשלבים של פרוטוקול זה הם סטנדרטיים למדי ומתוארים בפירוט מספיק על ידי פרוטוקול הטקסט הנלווה לסרטון זה. כאן, אנו רוצים להראות לך את השלבים המפיקים תועלת רבה ביותר מהוראה חזותית. הכן לוחות של תאי HEK293 שעברו טרנספטציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כשהצלחות על קרח, שאבו והשליכו את המדיה. לאחר מכן, הוסף בזהירות שני מיליליטר DPBS לפינת כל צלחת ונדנד את הצלחות כדי להפיץ את התמיסה. לאחר מכן הסר והשליך את ה- DPBS.לאחר מכן, לכל צלחת הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה. הטה את הצלחת והשתמש במגרד כדי לפזר את המאגר ולשחרר את ליזט התא. לאחר מכן שאפו את הליזטים והעבירו אותם לצינורות מיקרופוגה מקוררים מראש על קרח והמתינו 10 דקות.לאחר מכן, אספו ליזאטים של תאים נטולי פסולת על ידי צנטריפוגה של הצינורות והעברת הסופרנטנטים לצינורות חדשים על קרח. לאחר מכן מדוד את ריכוזי החלבון של הליזטים המנוקים באמצעות מבחן ברדפורד. לנתוני הריכוז, הכינו 100 דגימות מיקרוליטר של הליזטים לניתוח הג'ל.הכן ליזטים צפופים יותר למדידת Rab10 אנדוגני בהשוואה להמגלוטינין Rab10 המתבטא יתר על המידה. סיים את הכנת הדגימות על ידי דגירה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן אחסן את הדגימות מתחת למינוס 20 מעלות צלזיוס עד הצורך עד שישה חודשים או יותר.כדי להתחיל, הכן את תאי SDS-PAGE בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן טען את הג'ל למיכל ואבטח אותו בעזרת קליפס קלסר. לאחר מכן, מלאו את המיכל בחיץ רץ והסירו את בועות האוויר בבארות ומתחת לג'ל בעזרת מחט המחוברת למזרק.כעת הוסף מנגן כלוריד לדגימות וסובב אותן כלפי מטה כדי להסיר את המשקעים. לאחר מכן טען את הג'ל בכמויות שוות של דגימה, 10 מיקרוגרם חלבון לניתוח המגלוטינין Rab10 או 30 מיקרוגרם חלבון לניתוח Rab10 אנדוגני. טען את הנתיבים הריקים עם מאגר דגימה המכיל מנגן כלוריד.השלם גם את סמן המשקל המולקולרי עם בופר ומנגן כלוריד כדי להפוך אותו לאותו נפח כמו הדגימות. עכשיו התחל להפעיל את הג'ל ב 50 וולט. לאחר ערימת הדגימה, הגדל את המתח ל-120 כדי לקבל הפרדה.כאשר חזית הצבע מגיעה לתחתית הג'לים, הרגו את המתח. לאחר מכן, שטפו את הג'ל שלוש פעמים כדלקמן. טען את ג'ל ההפרדה לאמבטיה של מאגר העברה נקי בתוספת EDTA ו-SDS.לאחר מכן הניחו לו להתנדנד על שייקר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש כביסות, בצע שטיפה אחת נוספת באמצעות מאגר העברה עם תוספת SDS אך ללא EDTA. לאחר מכן העבירו את הג'ל באמצעות מיכל רטוב.טען את המיכל לקופסת קצף מלאה במים קרים כקרח, חבר את המיכל לאספקת חשמל והתחל את ההעברה. העברה ארוכה עם קירור יעיל חיונית להליך. לאחר ההעברה, בדוק את ההעברה על ידי צביעת הממברנה ב-Ponceau S, ולאחר מכן שטיפה ב-TBST לפי פרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, החל בלוק. טבלו את הכתם ב-TBST חלבי ונדנדו את הכתם על שייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר והשליך את תמיסת החסימה והחל את תמיסת הנוגדנים העיקרית.כעת נדנד את הממברנה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית. לאחר מכן שטפו את הממברנה עם TBST טרי שלוש פעמים כמו קודם.לאחר השטיפות, טבלו את הכתם בתמיסת נוגדנים משנית ודגרו את הממברנה על נדנדה למשך כשעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף את הממברנה עם TBST שלוש פעמים שוב. עכשיו פתח את הממברנה.הוסף מיליליטר אחד של תמיסת ECL לסדין ניילון גדול. לאחר מכן הניחו את הממברנה לתוך ה-ECL והפכו אותה במהירות כדי להרטיב את שני הצדדים. לאחר מכן, הרם את הממברנה ותן לה להתנקז.לאחר הניקוז, הניחו לקצה אחד לגעת במגבת נייר למשך כחמש שניות כדי לעזור לנדף עודפי תמיסה. לאחר מכן עטפו את הממברנה בסרט שקוף נוקשה ללא קמטים והעבירו אותה למגש שחור להדמיה. תאי HEK293 הועברו עם המגלוטינין Rab10 מסוג פרא ו-3xFLAG-LRRK2.נבדקו קינאז מסוג פרא לא פעיל במוטציות משפחתיות של מחלת פרקינסון של LRRK2. ביטוי יתר של LRRK2 ו-Rab10 הביא לשינוי פס משמעותי בג'ל P-tag. לעומת זאת, ביטוי משותף עם מוטציה לא פעילה של קינאז לא הביא לשינוי בניידות Rab10, מה שמרמז על הקינאז כגורם לשינוי הלהקה.כמו כן, כצפוי, המוטציות המשפחתיות במחלת פרקינסון הגדילו את שינוי הלהקה. מערכת הג'ל P-tag שימשה גם לניתוח תאי פיברובלסטים עובריים לבקנים שוויצריים 3T3-Swiss שטופלו במעכב LRRK2. הסטת הפס המתאימה ל-Rab10 אנדוגני זרחני נעלמה כאשר התאים טופלו GSK2578215A.אותה בדיקה בוצעה גם באמצעות תאי A549 אנושיים. בניסויים אלה, יעילותו של מעכב LRRK2 אומתה באמצעות נוגדן אנטי-p סרין 935 LRRK2 שהוא סמן מבוסס היטב לעיכוב LRRK2. לאחר שליטה, טכניקה זו זקוקה רק ל-14 דקות נוספות בהשוואה להליך ספיגה מערבי רגיל המיועד לשטיפת ג'לים לפני ההעברה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ספקטרומטריית מסה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם מוטציות FPD מזרחנות את אותן שאריות של Rab10. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הפרקינסון לחקור את הרמות האנדוגניות של זרחון Rab10 בתאים מתורבתים כמו גם ברקמות. אל תשכח שעבודה עם מיקרוציסטין שנוסף למאגר הליזיס עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים בעת הכנת ליזטים לתאים.

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר...

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

סרטון זה מדגים טכניקת כימות רגישה של זרחן חלבונים באמצעות בדיקה של מולקולה אחת הנפתחת כלפי מטה. הפונקציונליות של פוליאתילן גליקול-ביוטין והשימוש בנוגדנים מסומנים מגבירה את הזיהוי של טירוזין פוספורילציה עם ספציפיות.

בדיקת משיכה של מולקולה יחידה לניתוח זרחן חלבונים: טכניקת תפוקה גבוהה לכימות זרחן חלבונים בליזט התא

קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם חלבוני multidomain אשר לקודד שני GTPase ותחומים קינאז ואשר פוספורילציה בתאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתייג LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות phophorylation הסלולרי הכוללות שלהם.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

כאן אנו מתארים הליך המאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-native-PAGE בשילוב עם אימונובלוט באמצעות נוגדנים מרובים של פוספו-ספציפיות.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

מוטציות ב לאוצין העשיר חזרה לחזור 2 גנים (LRRK2) לגרום למחלת פרקינסון תורשתית. פיתחנו שיטה קלה ואיתנה להערכת זרחון LRRK2 נשלט של Rab10 בדם היקפי הדם נויטרופילים. הדבר עשוי לסייע בזיהוי אנשים עם פעילות מסלול מוגברת של LRRK2 קינאז.

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול זה מתאר את הכימות המהיר ורגיש מאוד של העברת אנרגית תהודת פורסטר נתוני חיישנים (סריג) באמצעות נתח סריג נייד מחוייט. המכשיר שימש לאיתור מלטוז בטווח טמפרטורה קריטית הממקסם רגישות זיהוי, שמאפשרים להעריך מעשית ויעילה של תכולת הסוכר.

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

למדו לזהות זרחון Rab10 על ידי LRRK2 באמצעות SDS-PAGE עם תג מחייב פוספט. שיטה זו מאפשרת הערכת סטויכיומטריה ב-Western blot פשוט ומסייעת בחקר מחלת פרקינסון ומוטציות LRRK2.

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

גלה סרטונים נוספים