Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט
14 בדצמבר 2017
המחקר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה של גילוי רמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי לאוצין-עשיר אני חוזר קינאז 2.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות את זרחון Rab10 על ידי LRRK2 באמצעות SDS-PAGE עם תג קושר פוספט. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של פרקינסון, כגון כיצד מוטציות מחלה ב-LRRK2 משפיעות על זרחון Rab10. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבל הערכה גסה של הסטוכיומטריה של זרחון Rab10 באמצעות כתם מערבי פשוט.
רבים מהשלבים של פרוטוקול זה הם סטנדרטיים למדי ומתוארים בפירוט מספיק על ידי פרוטוקול הטקסט הנלווה לסרטון זה. כאן, אנו רוצים להראות לך את השלבים המפיקים תועלת רבה ביותר מהוראה חזותית. הכן לוחות של תאי HEK293 שעברו טרנספטציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כשהצלחות על קרח, שאבו והשליכו את המדיה. לאחר מכן, הוסף בזהירות שני מיליליטר DPBS לפינת כל צלחת ונדנד את הצלחות כדי להפיץ את התמיסה. לאחר מכן הסר והשליך את ה- DPBS.
לאחר מכן, לכל צלחת הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה. הטה את הצלחת והשתמש במגרד כדי לפזר את המאגר ולשחרר את ליזט התא. לאחר מכן שאפו את הליזטים והעבירו אותם לצינורות מיקרופוגה מקוררים מראש על קרח והמתינו 10 דקות.
לאחר מכן, אספו ליזאטים של תאים נטולי פסולת על ידי צנטריפוגה של הצינורות והעברת הסופרנטנטים לצינורות חדשים על קרח. לאחר מכן מדוד את ריכוזי החלבון של הליזטים המנוקים באמצעות מבחן ברדפורד. לנתוני הריכוז, הכינו 100 דגימות מיקרוליטר של הליזטים לניתוח הג'ל.
הכן ליזטים צפופים יותר למדידת Rab10 אנדוגני בהשוואה להמגלוטינין Rab10 המתבטא יתר על המידה. סיים את הכנת הדגימות על ידי דגירה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן אחסן את הדגימות מתחת למינוס 20 מעלות צלזיוס עד הצורך עד שישה חודשים או יותר.
כדי להתחיל, הכן את תאי SDS-PAGE בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן טען את הג'ל למיכל ואבטח אותו בעזרת קליפס קלסר. לאחר מכן, מלאו את המיכל בחיץ רץ והסירו את בועות האוויר בבארות ומתחת לג'ל בעזרת מחט המחוברת למזרק.
כעת הוסף מנגן כלוריד לדגימות וסובב אותן כלפי מטה כדי להסיר את המשקעים. לאחר מכן טען את הג'ל בכמויות שוות של דגימה, 10 מיקרוגרם חלבון לניתוח המגלוטינין Rab10 או 30 מיקרוגרם חלבון לניתוח Rab10 אנדוגני. טען את הנתיבים הריקים עם מאגר דגימה המכיל מנגן כלוריד.
השלם גם את סמן המשקל המולקולרי עם בופר ומנגן כלוריד כדי להפוך אותו לאותו נפח כמו הדגימות. עכשיו התחל להפעיל את הג'ל ב 50 וולט. לאחר ערימת הדגימה, הגדל את המתח ל-120 כדי לקבל הפרדה.
כאשר חזית הצבע מגיעה לתחתית הג'לים, הרגו את המתח. לאחר מכן, שטפו את הג'ל שלוש פעמים כדלקמן. טען את ג'ל ההפרדה לאמבטיה של מאגר העברה נקי בתוספת EDTA ו-SDS.
לאחר מכן הניחו לו להתנדנד על שייקר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש כביסות, בצע שטיפה אחת נוספת באמצעות מאגר העברה עם תוספת SDS אך ללא EDTA. לאחר מכן העבירו את הג'ל באמצעות מיכל רטוב.
טען את המיכל לקופסת קצף מלאה במים קרים כקרח, חבר את המיכל לאספקת חשמל והתחל את ההעברה. העברה ארוכה עם קירור יעיל חיונית להליך. לאחר ההעברה, בדוק את ההעברה על ידי צביעת הממברנה ב-Ponceau S, ולאחר מכן שטיפה ב-TBST לפי פרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, החל בלוק. טבלו את הכתם ב-TBST חלבי ונדנדו את הכתם על שייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר והשליך את תמיסת החסימה והחל את תמיסת הנוגדנים העיקרית.
כעת נדנד את הממברנה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית. לאחר מכן שטפו את הממברנה עם TBST טרי שלוש פעמים כמו קודם.
לאחר השטיפות, טבלו את הכתם בתמיסת נוגדנים משנית ודגרו את הממברנה על נדנדה למשך כשעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף את הממברנה עם TBST שלוש פעמים שוב. עכשיו פתח את הממברנה.
הוסף מיליליטר אחד של תמיסת ECL לסדין ניילון גדול. לאחר מכן הניחו את הממברנה לתוך ה-ECL והפכו אותה במהירות כדי להרטיב את שני הצדדים. לאחר מכן, הרם את הממברנה ותן לה להתנקז.
לאחר הניקוז, הניחו לקצה אחד לגעת במגבת נייר למשך כחמש שניות כדי לעזור לנדף עודפי תמיסה. לאחר מכן עטפו את הממברנה בסרט שקוף נוקשה ללא קמטים והעבירו אותה למגש שחור להדמיה. תאי HEK293 הועברו עם המגלוטינין Rab10 מסוג פרא ו-3xFLAG-LRRK2.
נבדקו קינאז מסוג פרא לא פעיל במוטציות משפחתיות של מחלת פרקינסון של LRRK2. ביטוי יתר של LRRK2 ו-Rab10 הביא לשינוי פס משמעותי בג'ל P-tag. לעומת זאת, ביטוי משותף עם מוטציה לא פעילה של קינאז לא הביא לשינוי בניידות Rab10, מה שמרמז על הקינאז כגורם לשינוי הלהקה.
כמו כן, כצפוי, המוטציות המשפחתיות במחלת פרקינסון הגדילו את שינוי הלהקה. מערכת הג'ל P-tag שימשה גם לניתוח תאי פיברובלסטים עובריים לבקנים שוויצריים 3T3-Swiss שטופלו במעכב LRRK2. הסטת הפס המתאימה ל-Rab10 אנדוגני זרחני נעלמה כאשר התאים טופלו GSK2578215A.
אותה בדיקה בוצעה גם באמצעות תאי A549 אנושיים. בניסויים אלה, יעילותו של מעכב LRRK2 אומתה באמצעות נוגדן אנטי-p סרין 935 LRRK2 שהוא סמן מבוסס היטב לעיכוב LRRK2. לאחר שליטה, טכניקה זו זקוקה רק ל-14 דקות נוספות בהשוואה להליך ספיגה מערבי רגיל המיועד לשטיפת ג'לים לפני ההעברה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ספקטרומטריית מסה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם מוטציות FPD מזרחנות את אותן שאריות של Rab10. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הפרקינסון לחקור את הרמות האנדוגניות של זרחון Rab10 בתאים מתורבתים כמו גם ברקמות. אל תשכח שעבודה עם מיקרוציסטין שנוסף למאגר הליזיס עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים בעת הכנת ליזטים לתאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לזיהוי פוספורילציה אנדוגנית של Rab10 על ידי LRRK2 באמצעות SDS-PAGE עם תג קושר פוספט. טכניקה זו משמעותית להבנת ההשפעה של מוטציות ב-LRRK2 במחקר על מחלת הפרקינסון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביוכימיה
רקע
- Rab10 הוא סובסטרט של LRRK2, חלבון המעורב במחלת פרקינסון.
- הבנת הפספורילציה של Rab10 יכולה לספק תובנות לגבי תפקידו של LRRK2 בניוון עצבי.
- שיטות נוכחיות לחקר פספורילציה עלולות להיות מורכבות וגוזלות זמן.
- מחקר זה שואף לפשט את תהליך הזיהוי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה לזיהוי פוספורילציה של Rab10.
- הערכה של האופן שבו מוטציות ב-LRRK2 משפיעות על רמות הפוספורילציה של Rab10.
- מתן מדריך ויזואלי לשלבים ניסיוניים מרכזיים.
שיטות שהשתמשו בהן
- טרנספקציה של תאי HEK293 ב-LRRK2.
- שימוש ב-SDS-PAGE להפרדת חלבונים.
- יישום של תג קושר-פוספט לצורך זיהוי.
- ניתוח Western blot להערכת סטוכיומטריה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת להעריך את הסטוכיומטריה של הפספורילציה של Rab10.
- הנחיות חזותיות משפרות את הבנת הפרוטוקול.
- התוצאות מצביעות על השפעתן של מוטציות ב-LRRK2 על רמות הפספורילציה.
- גישה זו יכולה לסייע למחקרים נוספים במחלת פרקינסון.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לחקר הפספורילציה של Rab10.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחוקרים הבוחנים מנגנונים הקשורים ל-LRRK2.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על טכניקה זו כדי לבחון מטרות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרגי ניהול
שיטה זו מאפשרת זיהוי של פוספורילציה אנדוגנית של Rab10 על ידי LRRK2, אירוע מרכזי בפתוגנזה של מחלת הפרקינסון, תוך שימוש בתג קושר-פוספט כדי להתגבר על מגבלותיהם של נוגדנים ספציפיים לפוספורילציה. היא מספקת גישה מהירה, שאינה תלויה בנוגדנים, להערכת פעילות קינאז של LRRK2 ויעילות של מעכבים במודלים תאיים, ובכך תומכת בתיקוף המטרה ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות לניוון עצבי. הטכניקה מאפשרת השוואה כמותית של מצבי פוספורילציה בין הפרעות גנטיות ופרמקולוגיות, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בתוכניות המכוונות ל-LRRK2.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של פוספורילציה של סובסטרט LRRK2 כדי לתקף את Rab10 כמדד תפקודי לפעילות קינאז במודלים רלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מספק בדיקה פשוטה מבוססת immunoblot להשוואה בין מוטציות LRRK2 מסוג פרא (wild-type) למוטציות פתוגניות לצורך אישור המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: יוצר הסטות ניידות כמותיות הפרופורציונליות לסטוכיומטריה של הפוספורילציה, מה שמאפשר ניתוח של תגובה למינון של מעכבי LRRK2.
- ערך תפעולי: דורש רק תשתית סטנדרטית של SDS-PAGE ו-western blot, מה שמאפשר התאמה מהירה במעבדות שונות לצורך סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר זיהוי של פוספורילציה אנדוגנית של Rab10 בסוגי תאים מרובים (HEK293, A549, פיברובלסטים של עכבר), ובכך תומך ברלוונטיות תרגומית בין מינים שונים.
- ערך תפעולי: מאמת את המעורבות של המטרה (target engagement) של מעכבי LRRK2 (למשל, GSK2578215A) באמצעות אובדן של אות הפוספורילציה, ובכך מספק מידע על פרמקודינמיקה פרה-קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף תיקוף המטרה של LRRK2, החל מבדיקת השערה ראשונית במערכות של ביטוי יתר ועד לאפנון של מסלולים אנדוגניים במודלים של מחלות, ובכך היא תומכת במעבר מזיהוי תרכובות מובילות לבחירת מועמדים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור פעילות kinase של LRRK2 למצב הפוספורילציה של Rab10 בהקשרים תאיים.
- סריקה: מאפשרת הערכה של השפעות תרכובות על רמות פוספורילציה באמצעות תשומות חלבון סטנדרטיות (10–30 µg) ומדידות של mobility shift.
- אנליטיקה: מספקת הערכות סטוכיומטריות חצי-כמותיות באמצעות עוצמת band shift, מה שמקל על השוואה בין תנאים ללא שימוש בספקטרומטריית מסות.
- מחקר תרגומי: מדגימה רגישות למעכבים בתאי אדם ומכרסומיים, ובכך תומכת ברציפות התרגומית של סיגנל LRRK2-Rab10.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת לשימוש חוזר על פני קווי תאים, רקמות וסוגי הפרעות (מוטנטים, מעכבים, מפעילים) כפלטפורמת זיהוי מודולרית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באיתות של LRRK2 על ידי אספקת ראיות ישירות לפוספורילציה של סובסטרט.
- ערך תפעולי: מוסיף 14 דקות בלבד לפרוטוקול Western Blotting סטנדרטי, ובכך ממזער את ההשפעה על תפוקת העבודה תוך הגברת עומק הנתונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי קישור בין מודולציה של LRRK2 לבין איתות תפקודי במורד המסלול.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מודולטורים של LRRK2 בהתבסס על מעורבות במסלול המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בליזיס של תאים, הקמת בדיקת קינאז ואופטימיזציה של וסטרן בלוט.
- תלוי בגישה לריאגנט של תג קושר פוספט ולמנגנז כלוריד להכנת הג'ל.
- מחייב סטנדרטיזציה של טעינת חלבון (10 µg עבור ביטוי יתר, 30 µg עבור Rab10 אנדוגני) בין הקבוצות הניסוייות.
- התאמה לרקמות ראשוניות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הליזיס כדי לשמר מצבי פוספורילציה.
- מוגבל לזיהוי שינויי ניידות המושרים על ידי פוספורילציה; אינו מזהה אתרי פוספורילציה ספציפיים ללא שימוש בשיטות משלימות.
