השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מודל בעל חיים בעל עיניים גדולות של אטרופיה גיאוגרפית להשתלת תאי אפיתל פיגמנט רשתית עובריים אנושיים לתוך העין ולהעריך את אינטגרציית התאים התורמים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון טיפול מבוסס תאי גזע במחלות ניווניות. היתרון העיקרי של מסגרת כירורגית זו הוא המקור הבלתי מוגבל של תאים בריאים והמסגרת הכירורגית להזרקה תת-רשתית, שיש לה קווי דמיון רבים להליך המיועד למטופל.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בניוון מקולרי הקשור לגיל באמצעות ראוותנות של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים. טכנאית בעלי החיים שלנו, מוניקה ארונסון, מחזיקה את הארנב במקומו כדי שנוכל לדמיין ולדמיין את הרשתית באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. לאחר הרדמת ארנב על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את הארנב מתחת למיקרוסקופ הכירורגי כשהראש פונה למנתח.

לאחר מכן, השתמשו במחזיר עפעפיים כדי להסיר את העפעפיים ובמטלית סטרילית כדי להסיר את קרום הניקטיטנים. למיקרו-כירורגיה, השתמש בטכניקת pars plana טרנס-ויטריאלית עם שתי יציאות או שלוש יציאות אופציונליות עם טרוקרים ללא שסתומים להחדרת מכשירים מיקרו-כירורגיים. למכונת כריתת הזגוגית הרב-תכליתית יש יציאות לחיבור צינורית עירוי, אנדו-תאורה, ויטרקטור ואנדולייזר.

עבור הזרקות תת-רשתית, רק האנדו-תאורה היא חובה, מה שהופך הגדרה של שתי יציאות למספיקה. השתמש במלקחיים כדי לתפוס ולעקור את הלחמית, סמן מעל את מקום ההחדרה. הכנס באופן טרנססקלרלי אחד משני הטרוקרים העליונים, מילימטר אחד עד שני מילימטרים מהלימבוס, בזווית מקבילה של שלושים עד ארבעים וחמש מעלות.

המשך להכניס את הטרוקר לאמצע הקצה. לאחר מכן, סובב את הטרוקר תשעים מעלות וקדם אותו לתוך העין, מכוון אל הקוטב האחורי. זה ימנע את הדליפה לאחר הניתוח מטרשת זו וגם יפחית את הסיכון לאנדופתלמיטיס.

חזור על הפעולה עם הטרוקר העליון השני. בעת החדרת הטרוקר, חשוב להיות במרחק של מילימטר עד שניים מהלימבוס כדי לחפור את ההחדרה ולכוון לקוטב האחורי כדי למזער את הסיכון לזיהום, דימום בזגוגית, היפרדות רשתית ומגע העדשה שלנו. מרחו דמעות סינתטיות כג'ל התכווצות על הקרנית ולאחר מכן הניחו עדשת מגע שטוחה חד פעמית על הקרנית כדי לדמיין את הרשתית.

לאחר מכן, זרוק חמש מאות מיקרוליטר של נתרן יוד למזרק מיליליטר אחד המחובר לצינור הארכה המופעל על ידי עוזר ולצינורית פולי-קצה בגודל 38 המופעלת על ידי המנתח. הכנס את בדיקת האנדו-תאורה דרך הטרוקר השמאלי העליון. לאחר מכן, הכנס את צינורית ההזרקה דרך הטרוקר הימני העליון וקדם את הצינורית דרך חלל הזגוגית לכיוון הרשתית, מכוון לאזור שמתחת לראש עצב הראייה.

אפשר לקצה הצינורית לגעת באיטיות ברשתית עד להלבנה מוקדית. אל תתנו לצינורית לחדור לרשתית מכיוון שהדבר עלול לגרום לדימום. כעת, חודרים לרשתית עם המחט, מזריקים חמישים מיקרוליטר של נתרן יוד תת-רשתית במשך תקופה של חמש שניות.

מכיוון שיש מישור מחשוף טבעי בין הרשתית לכורואיד שמתחתיו, גוש שקוף למחצה הנראה בבירור אמור להיווצר בהדרגה במהלך ההזרקה. בזמן ההזרקה, משוך לאט את המחט אך וודא שהקצה נשמר בתוך הבלב כדי למזער ריפלוקס. לאחר הסרת האנדו-אילומינציה וצינורית ההזרקה, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הטרוקרים.

לאחר מכן השתמש בקצה, או בקצה הקהה של המלקחיים, כדי להפעיל לחץ קל למשך שלושים שניות על הטרשת ללא תפרים רכה. במהלך ההחלמה, יש לטפל בבעל החיים על פי פרוטוקול הטקסט ולהמתין שבעה ימים להשתלה. שבעה ימים לאחר הזרקת נתרן יוד ולאחר מתן טריאמצינולון תוך זגוגית, על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את מדיום ההתמיינות התאית מעשרים וארבע שכבות hESC-RPE משולבות היטב והשתמש בחמש מאות מיקרוליטר של PBS ללא סידן ומגנזיום כדי לשטוף כל באר.

לאחר ניסיון התאים, הטה את הצלחת והסר בזהירות את הטריפסין כדי לאפשר לתאים להישאר מחוברים לצלחת. אסוף את התאים בשמונה מאות מיקרוליטר של מדיום התמיינות טרי של שלושים ושבע מעלות צלזיוס שחומם מראש על ידי פיפטינג עדין, או אפילו גירוד במידת הצורך, לקבלת תרחיף תא בודד. בעזרת נקודת אפס שני אחוז טריפן כחול, ספרו את התאים בתא המוציטומטר לפי הוראות היצרן.

לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של מדיום התמיינות לתרחיף התא וצנטריפוגה את התאים בשלוש מאות פעמים גרם, בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-PBS מעוקר טרי עם פילטר בריכוז סופי של אלף תאים למיקרוליטר. יש להקצות את תרחיף התאים הקודם לשש מאות מיקרוליטר ולשמור אותם על קרח עד ובמהלך הניתוח.

לאחר הרדמת הארנב והרחבת האישונים על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו את הארנב כשהראש פונה למנתח. השתמש במחזיר העפעף כדי להסיר את העפעפיים ובמטלית סטרילית כדי להסיר את קרום הניקטיטנים. למיקרו-כירורגיה, השתמש בטכניקת pars plana טרנס-ויטריאלית עם שתי יציאות או שלוש יציאות אופציונליות עם טרוקרים הממוקמים באותם מיקומים כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה.

אם הטרשת הקודמת נראית לעין, בצע החדרת טרוקר ממש בסמוך אך לא דרך אתרי ההחדרה הללו כדי למזער את הסיכון לדליפה לאחר הניתוח. מרחו דמעות סינתטיות על העין כמו קודם והניחו עדשת מגע שטוחה חד פעמית על התמיסה על הקרנית כדי לדמיין את הרשתית. לאחר מיקום נכון של הקצה וכיוון למרכז האזור המטופל מראש של נתרן יודאט, המובחן ברפלקס אנדו-תאורה מתכתי אופייני, הזריק תת-רשתית חמישים מיקרוליטר של מתלה hESC-RPE מעורבב בעדינות.

הרשתית הנוירו-סנסורית אמורה להיפרד בקלות, וליצור כתם גלוי בבירור. במהלך ההזרקה, משוך לאט את המחט אך וודא שהקצה נשמר בתוך העפעף כדי למזער ריפלוקס. לאחר הסרת צינורית האנדו-תאורה וההזרקה, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הטרוקרים והשתמש בקצה הקהה של המלקחיים כדי להפעיל לחץ קל למשך שלושים שניות כמו קודם.

השתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום ספקטרלי, או מכשיר SD-OCT, עם התוכנה הנלווית כדי לקבל סריקות B חתך של בעלי החיים המטופלים, בהתאם להוראות היצרן. הנח את החיה המורדמת ומורחבת האישונים בתושבת מתכווננת כדי לקבל נתיב ללא הפרעה ממקור האור של המכשיר לרשתית הארנב. כדי למנוע טשטוש תמונה, שמור על הקרנית לחה על ידי שטיפה במי מלח מקומיים כל שלושים עד שישים שניות.

השג לפחות שלוש סריקות OCT עם סריקה קונפוקלית אינפרא אדום סימולטנית אופטלמוסקופיה לייזר או תמונות התייחסות להחזרת SLO קונפוקלית המייצגות את החלק העליון, המרכזי והתחתון של האזור המוזרק. השג מספר צבעי לייזר בו זמנית של תמונות פונדוס פנים עם השתקפות לייזר קונפוקלית כחול, ירוק, אינפרא אדום ורב צבעוני. צלם תמונות אוטו-פלואורסצנטיות באור כחול באמצעות יכולת לייזר האור הכחול של התקן SD-OCT.

תמונות מייצגות in vivo של BAF, IR-cSLO ו-SD-OCT של רשתית ארנב לבקנית רגילה מוצגות כאן. פיצוץ של תמונת SD-OCT ממחיש את שכבות הרשתית השונות עם רמות החזרת האור הייחודיות שלהן שנלכדו על ידי מכשיר SD-OCT. כפי שמוצג בתמונת SD-OCT זו, שצולמה שלושה חודשים לאחר הזרקת חמישים מיקרוליטר של תמיסת נתרן יודאט מילי-מולרית אחת, נוצר בלב שנפתר והתנוון בהדרגה את הרשתית החיצונית.

ניתן להבחין בדילול של השכבות הנוירו-רשתית החיצוניות ביותר באזורי SD-OCT והיפו-BAF, המקביל לאובדן RPE, ובכך ליצור מחדש פנוטיפ דמוי GA. עם זיהוי אזור הנזק, חמישים אלף תאי hESC-RPE הוזרקו מחדש להשתלה, ויצרו כתם שני שנעלם. אזורי היפר-BAF קלים עד בינוניים קיימים עם היפר-BAF מוגבר פוקאלית על גבול אזור הנזק, מה שמעיד על מתח כרוני של ה-RPE המקומי.

הכתם המתאים להזרקת hESC-RPE בעיניים שלא טופלו מראש המראה כתמים של תאים פיגמנטיים בתמונת MC ומבני רשתית שמורים היטב בסריקת SD-OCT מוצג להשוואה. שליטה בשיטה קלינית יפה זו להזרקה תת-רשתית תקל על השתלה קלינית של טיפול מבוסס תאים למצבים, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר זריקות תת-רשתית במודל מסוג חיים, כיצד להכין תאים שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים להזרקות תת-רשתית, וכיצד לדמיין אינטגרציה של תאי תורם באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית.