ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לדמיין את היווצרות הביופילם של קנדידה אלביקנס בזמן אמת בתנאים פיזיולוגיים של המארח. שיטה זו מאפשרת תצפית על היווצרות הביופילם בזמן אמת וניתן להשתמש בה כדי לבחון את יעילותם של חומרים אנטי-מיקרוביאליים או להעריך מוטציות גנטיות. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן טיפולים פוטנציאליים לפעילות נגד ביופילמים בצורה בעלת תפוקה גבוהה וניתן למדוד, לדמיין ולהשוות את יעילותם לטיפולים הנוכחיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחון היווצרות ביופילם במספר תנאים שונים שמעניינים את החוקרים. למרות ששיטה זו פותחה במיוחד כדי לחקור את היווצרות הביופילם של קנדידה אלביקנס, ניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים היוצרים ביופילם, כולל מיני פטריות אחרים כמו גם חיידקים. כדי להתחיל, הכינו תרביות מושבה בודדת של זנים שונים של C.albicans מתאים המצופים על תמצית שמרים פפטון דקסטרוז או אגר בינוני YPD בהתאם לשיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות.

לאחר מכן, הפעל את המערכת המיקרופלואידית הכוללת את הבקר, שתי יחידות אספקת החשמל, המיקרוסקופ, המצלמה והמחשב המחוברים למערכת. לאחר טעינת המחשב, פתח את התוכנה השולטת במערכת. אתר את מספר הברקוד של הלוחית בשימוש והזן את המספר כאשר תתבקש על ידי התוכנה.

ואז במודול הבקרה, הגדר את טמפרטורת המערכת המיקרופלואידית ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחץ על בארות הכניסה I1, I7, I13 ו-I19 והזרם אוויר סטרילי דרך צינורות לוחית הממשק למשך חמש דקות כדי להסיר כל עיבוי. כאשר כל העיבוי מתאדה, הנח את הצלחת המיקרופלואידית של 48 בארות 0-20 דיין על במת המיקרוסקופ.

לניסוי היווצרות ביופילם של 12 שעות, התחל בהוספת 600 מיקרוליטר של מדיום מחומם מראש לבארות הכניסה. הורד לאט את לוחית הממשק הנקייה על גבי הצלחת המיקרופלואידית בת 48 הבארות. לאחר מכן החלק את לוחית הממשק מעט שמאלה עד שהצינורות ממוקמים על גבי בארות הכניסה והיציאה וננעלים במקומם.

בקטע בקרת הגזירה של התוכנה, הגדר את מצב הזרימה לקבוע, והגדר את הגזירה המקסימלית לדיין אחד לסנטימטר בריבוע. לאחר מכן לחץ על בארות הכניסה עם המדיה כדי להתחיל את זרימת המדיה מכניסה לבארות יציאה על מנת לטשטש את הערוץ. לאחר חמש דקות של זרימה, לחץ על כפתור העצירה בקטע בקרת לוחית הבאר של התוכנה.

לאחר מכן הסר את לוחית הממשק והתבונן בבארות הצלחת המיקרופלואידית. רק טיפה קטנה של מדיה צריכה להיות גלויה בבארות היציאה. כדי לבדוק זני C.albicans מסוג בר ומוטנטי, הוסף 50 מיקרוליטר של תרבית תאים SC5314 מסוג בר במדיה עכביש לשתי בארות יציאה, הוסף את מוטנט bcr1 במדיה עכביש לשתי בארות יציאה והוסף את מוטנט EFG1 במדיה עכביש לשתי בארות יציאה.

הנח את לוחית הממשק בחזרה על הצלחת המיקרופלואידית ונעל את המכסה במקומו. בחזרה לקטע בקרת הגזירה של התוכנה, הגדר את מצב הזרימה לקבוע, והגדר את הגזירה המקסימלית לשני דיין לסנטימטר בריבוע. לחץ על בארות היציאה עם תאים כדי להתחיל בזרימת המדיה מהיציאה לבארות הכניסה כדי להתחיל בזריעה של C.albicans.

לאחר שלוש שניות, לחץ על כפתור העצירה בקטע בקרת לוחית הבאר כדי למנוע כניסת תאים לבארות הכניסה. אפשר לתאים להישאר נייחים ללא זרימה במשך 10-20 דקות בערוץ הצפייה להיצמדות ראשונית לתאים. בחלון מודול ההדמיה, פתח את מודול הרכישה הרב-ממדית ולחץ על הכרטיסייה stage בתפריט בצד שמאל.

בקטע הבמה, טען את רשימת הבמה הראשית עבור הצלחת המיקרופלואידית של 48 בארות 0-20 דיין. לאחר מכן, פתח את התאמת הטעינה מחדש של הדגימה והעבר את השלב למודולי מיקום מוחלטים. במודול התאמת הטעינה מחדש לדוגמה, לחץ על הלחצן החי כדי לראות תצוגה מקדימה של תמונה עם כוונת.

בעזרת הג'ויסטיק, מקם את לוחית הבאר כך שקצה החץ הסמוך לערוץ הצפייה ארבע יתיישר עם הכוונת בתוכנה. לאחר מכן עבור להזזה stage לתפריט מיקום מוחלט ולחץ על כפתור המקור המוגדר. לאחר מכן, חזור למודול התאמת הטעינה מחדש של הדגימה, לחץ על קטע נקודת הייחוס הראשונית בתפריט השמאלי וטען את file עבור הצלחת המיקרופלואידית של 48 בארות 0-20 דיין.

בקטע ה-stage של מודול הרכישה הרב-ממדי, לחץ פעמיים על הבמה מיקום 22.2 כדי להביא את המיקרוסקופ viewstage ואת מיקוד המצלמה קרוב לסמן החץ על ידי צפייה בערוץ 22. לאחר מכן השתמש בג'ויסטיק כדי למקם את לוחית הבאר כך שקצה החץ הסמוך לצפייה בערוץ 22 יתיישר עם הכוונת. העתק את קואורדינטת ה-Y במודול הרכישה הרב-ממדית למצב Y של.

2 בכרטיסייה עדכון נקודות התייחסות של מודול התאמת הטעינה מחדש לדוגמה. לבסוף, בכרטיסייה עדכון מיקומי שלב של מודול התאמת הטעינה מחדש לדוגמה, לחץ על החל על רשימת השלבים של MDA. בחלון מודול ההדמיה, השתמש במודול הרכישה הרב-ממדי ולחץ על הכרטיסייה שמירה בתפריט השמאלי.

לאחר מכן בחר את שם הקובץ עבור הניסוי ואת התיקיה לאחסון התמונות שנרכשו במחשב. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה Timelapse והגדר אותה כך שתשיג 145 תמונות בסך הכל חמש דקות בין כל תמונה. לאחר מכן, בכרטיסייה אורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל לאחד וצלם ב-50% שדה בהיר ו-50% מצלמה עם זמן חשיפה של 12-20 אלפיות השנייה.

הגדר את הרווח ל-0.6 ואת הדיגיטייזר ל-20 מילי-הרץ. לאחר הגדרת המיקוד כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, בחר לרכוש כדי להתחיל לצלם תמונות שטיפה מראש של תאים מודבקים עבור כל תת-השלבים. בקטע בקרת הגזירה, הגדר את מצב הזרימה לקבוע, ואת הגזירה המקסימלית לדיין אחד לסנטימטר בריבוע.

לאחר מכן לחץ על בארות הכניסה כדי להתחיל בזרימת המדיה מכניסה לבארות יציאה על מנת להסיר תאים שאינם דבוקים. לאחר חמש דקות, לחץ על כפתור העצירה בקטע בקרת צלחת הבאר. אפשר לרכוש סבב שני של תמונות ולאחר מכן בקטע בקרת הגזירה, כוונן את זרימת הגזירה המקסימלית ל-0.5 דיין לסנטימטר בריבוע ואשר את השינוי.

בחלון מודול ההדמיה, בחר בכרטיסייה כלי ניתוח ולחץ על סקור נתונים רב-ממדיים מהתפריט הנפתח. לאחר מכן לחץ על בחר קובץ בסיס. פעולה זו תפתח את חלון כלי השירות של סל הנתונים הרב-ממדי.

לאחר מכן, לחץ על כפתור בחירת הספרייה ובחר את התיקיה ששימשה לשמירת הניסוי. ברשימת ערכות הנתונים, בחר את יומן קבצי הניסוי. לאחר טעינת היומן, לחץ על כפתור התצוגה.

בחר את אורך הגל על ידי לחיצה על האפשרויות בתפריט אורכי הגל השמאלי ובחר את מיקום הבמה לצפייה מתפריט נפתח. בחר את התמונה לטעינה מהמספרים בחלק העליון של המודול על ידי לחיצה ימנית על מספר התמונה. לאחר מכן בחר את כל התמונות על מנת ליצור סרטון זמן-lapse.

התמונות שנבחרו ייפתחו כסרטון בחלון חדש. לחץ על הכרטיסייה file בחלון מודול ההדמיה ובחר שמור בשם מהתפריט הנפתח. שמור את הסרטון שהתקבל כפורמט הקובץ המוגדר כברירת מחדל.

לבסוף, פתח וטען את קובץ הווידאו השמור לתמונה J.In לתמונה J, לחץ על הכרטיסייה קובץ ולאחר מכן לחץ על שמירה בשם. בחר AVI מהתפריט הנפתח והמר את הקובץ לקובץ AVI באמצעות המרת JPEG מוגדרת ל -10 פריימים לשנייה. בתנאים מסוג פרא במדיה RPMI 1640, מספר תאים נצמדו חזק לערוץ.

הם יוצרים קורים וניתן לראות ביופילם עבה עם קורים ותאי שמרים משולבים. לקראת סוף הניסוי המיקרופלואידי, הביופילם מסוג הבר ממלא לחלוטין את ערוץ הצפייה הזה. עם זאת, לנוכחות של אמפוטריצין B יש השפעה בולטת על הפחתת היווצרות הביופילם.

באופן ספציפי, היצמדות התאים פוחתת וניתן לראות מספר תאים זורמים עם זרימת הגזירה של המדיה. תאי הבקרה מסוג הבר, הפעם גדלו במצע עכביש, יצרו ביופילם דומה לזה שהוצג זה עתה גדל ב-RPMI. במדיה זו גדלים גם שני מוטאנטים פגומים בביופילם.

שני הזנים מראים ירידה משמעותית בהיווצרות ביופילם בהשוואה לקבוצת הביקורת. באוכלוסיית תאים זו, תאים דבוקים אינם יוצרים קורים והביופילם שנוצר פגום מאוד. זן אחר זה פגום הן ביצירת ביופילם והן ביכולתו להיצמד לתעלה.

לאחר שליטה, ניתן להגדיר את הניסוי הזה תוך פחות משעה. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד הרבה על מספר היבטים שונים של היווצרות ביופילם, כולל היצמדות ראשונית של תאים, הבשלת ביופילם ופיזור תאים. פרוטוקול זה ניתן להתאמה אישית ורב-תכליתי.

ניתן להתאים אותו כדי להעריך מינים מיקרוביאליים שונים ברחבי הממלכות. קצבי זרימה, טמפרטורות, זמני דגירה ומדיה יכולים לשמש גם לחקר ביופילמים של מינים מעורבים. אנו ממליצים בחום על בדיקת ביופילם מיקרופלואידית זו כבדיקת מבחנה לשימוש לפני ניסויים בבעלי חיים in vivo.

מניסיוננו, התוצאות מבדיקה זו מתואמות היטב עם מבחני ביופילם קיימים in vivo.