Name: ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: למד הדמיית ביופילמים בזמן אמת של Candida albicans באמצעות מכשיר מיקרו-פלואידי אוטומטי. שיטה זו מאפשרת בדיקת יעילות תרופות אנטי-פטרייתיות והערכת מוטנטים גנטיים במחקר מיקרוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי המעבדה Nobile לדיונים מועיל על מבחני biofilm. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק R21 AI125801 (C.J.N.). D.L.R. נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מאוניברסיטת קליפורניה המכון מקסיקו, ארצות הברית (UC-MEXUS) ו y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Technologia (CONACYT).

<ol><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Biofilms+and+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Biofilms and Human Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).</li>
<li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+infections+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida infections of medical devices.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).</li>
<li>Fox, E. P., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+EP+%22Candida+albicans%3A+Symptoms%2C+Causes+and+Treatment+Options%22">Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options</a>. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).</li>
<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Uppuluri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+as+an+important+step+in+the+Candida+albicans+biofilm+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).</li>
<li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li>
<li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li>
<li>Nett, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+indwelling+urinary+catheter+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection.</a> Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).</li>
<li>Krom, B. P., Willems, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+for+Candida+Biofilm+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models for Candida Biofilm Development.</a> Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).</li>
<li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Candida+species+on+the+surface+of+catheter+materials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro.</a> Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).</li>
<li>Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+Candida+biofilm+microtiter+plate+model+for+measurement+of+antifungal+susceptibility+by+tetrazolium+salt+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay.</a> J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).</li>
<li>Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+candidal+biofilm+microtiter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized candidal biofilm microtiter assay.</a> J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).</li>
<li>Lohse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+Optimizations+of+Candida+albicans+In+Vitro+Biofilm+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).</li>
<li>Winter, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Identification+of+Biofilm-Specific+Proteolysis+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans.</a> mBio. 7 (5), (2016).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Fox, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+regulatory+network+temporally+controls+Candida+albicans+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
<li>Baker, K. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/atbench2.htm">At the bench: A laboratory navigator</a>. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

קלריסה ג'יי Nobile הוא מייסד BioSynesis, inc., חברה פיתוח מעכבי ואבחון של biofilms אלביקנס ג .

Microfluidic להתאמה אישית biofilm וזמינותו המתוארים כאן מאפשר החזיית ביופילמים ב בזמן אמת ברמה תא בודד כאשר הם נחשפים זרימה שכבתית בריבית קבועה עם טמפרטורה קבועה. הוא מספק אמצעי רב עוצמה כדי ללמוד על התפתחות biofilms בפראי-סוג של מוטציה זנים, ההשפעות של הסוכן מיקרוביאלית טיפולים על biofilms בתנאים המחקים בתנאים פיזיולוגיים שנצפתה הגדרות קליניים. שלא כמו רוב במבחנה biofilm מבחני, שיטה זו מאפשרת בחינת ממבנה biofilm המתפתח בזמן אמת כמו צורות.
בשיטה זו ניתן להשתמש באופן תפוקה גבוהה, בו עד...

קנדידה אלביקנס הוא חבר commensal microbiota האנושית, אולם זה גם פתוגן הזדמנותית, מסוגל לגרום זיהומים פטרייתיים שטחית וחמור1,2. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס היא יכולתה להעביר טופס גמיש, biofilms עמידים בפני התרופה, קהילות של תאים דבקה משטח המוקף בסוגריים גשמי1,מטריצה חוץ-תאית3. ג אלביקנס biofilms בנויות מאוד, המכיל מספר שכבות של סוגי תאים מרובים (סיבוב ניצני שמרים-טופס תאים, התאים pseudohyphal אובל ותאים hyphal צינורי)4. פיתוח biofilm אלביקנס ג מתחיל עם הדבקות של תאי שמרים עגולה-טופס משטח (זריעה של biofilm), ואחריו ההתפשטות של תאים אלה על פני השטח ולאחר מכן ההבשלה של biofilm ילדותי מבנה לתוך biofilm מלא שנוצר המוקפת מטריצה חוץ-תאית גשמי4. בוגרת biofilm מורכב בעיקר מוארך התאים hyphal היוצרים רשתות צפופות ולא מחוברים, מספקת את היציבות אדריכלי עד biofilm4. לאורך כל מחזור חיי biofilm, עגול ניצני שמרים תאים לפזר מן biofilm בוגרת, עשוי לטייל באזורים אחרים של הגוף כדי לגרום לזיהומים המופץ או זרע biofilms חדש על אתרים אחרים,4,5. ג אלביקנס יכולים ליצור biofilms על משטחים ביוטיים, כגון משטחים הרירית וברחבי רקמות הפונדקאי, ועל משטחים והאביוטיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, המפרקים תותבת. בשל מאפייני biofilms הסרבן, הם קשים מאוד לשרש, במקרים רבים אסטרטגיית טיפול יעיל רק הסרה של התקן נגוע4. לכן חשוב לחקור ביופילמים בתנאים דומים לאלה הנהוגות הגדרות קליניים.
ישנם כמה קריטי ויוו חייתיים המשמשות ללימוד אלביקנס ג biofilm היווצרות6,7,8; עם זאת, מחקרים אלה יכול להיות יקר, זמן רב, מוגבלים על ידי מספר זנים, סוכני מיקרוביאלית יכול להיבדק בזמן נתון. במבחנה biofilm מבחני, מצד שני, לאפשר ההערכה המהירה, תפוקה גבוהה של תרכובות פטריות מוטציה זנים, והם הרבה יותר חסכונית, אתי מבחני biofilm נשא שם חיה מודלים9, 10,11,12,13,14. כאן נתאר assay במבחנה אנו פיתח, אופטימיזציה להתבונן ביופילמים חנותם תחת זרימה שכבתית באמצעות14,התקן15microfluidic להתאמה אישית. וזמינותו מאפשר החזיית בכל שלב של ביופילמים, כולל את שלב הדבקות ראשונית, התפשטות תאים, ההבשלה biofilm תא פיזור. וזמינותו שימושי גם לדמיין תא מורפולוגיה שינויים במהלך התפתחות ממבנה biofilm.
לוחות Microtiter, אשר בדרך כלל מנוצלים עבור במבחנה biofilm מבחני, בעוד תפוקה גבוהה, אינם מאפשרים תנאים זרימה מבוקרת. מסורתי, תא מנדפים תאפשר להערכה מתמשכת של ביופילמים בתנאי זרימה מבוקרת, אך אלה הם לעתים קרובות זמן רב כדי להגדיר, נוטים מוגבל טווח דינמי שליטה והתפוקה. המכשיר microfluidic מנוצל כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שילוב לוחות תפוקה גבוהה (מכיל 48 וולס) עם תא זרימה שכבתית מובנה, היא מאוד לשחזור, תכליתי, הניתנים להתאמה אישית.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לשימוש של מכשיר microfluidic אוטומטיים זמינים מסחרית כדי להעריך ביופילמים של פראי-סוג אלביקנס ג להתאמץ, את ההשפעות של סוכן פטריות ידוע על הפיתוח של biofilm ו biofilm -צורה שני זנים מוטציה (Δbcr1/Δ וδ efg1/Δ) אשר היו בעבר דווח כי biofilm פגמים במבחנה , ויוו16,17,18. הפרוטוקול המתואר ניתן לבדוק את היעילות של סוכני מיקרוביאלית עיכוב ביופילמים במהלך התפתחות ממבנה biofilm, וכדי לזהות גנים הדרושים לפיתוח biofilm רגילה על-ידי הקרנת ספריות מוטציה.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>מכשיר מיקרופלואידית אוטומטי לניתוח תאים חיים</td></tr><tr><td>צלחת 48 בארות 0-20 דיין</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>צלחת מיקרופלואידית</td></tr><tr><td>מונטאז' תוכנה</td><td>Fluxion</td><td>גרסה 7.8.4.0</td><td>תוכנת ניתוח הדמיה</td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>תמצית</td> <td>שמריםקריטריון</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז (D-גלוקוז)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td></td><td>קריטריון</td> מרק תזונתי <td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Mannitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Criterion</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>לולאות חיסון סטריליות</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי עם מכסה שקוף</td><td>פישר Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>קובטות חד פעמיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>נייר עדשה</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרופלייט וקובטה</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן microfluidic אוטומטי

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

קנדידה אלביקנס היא המחלה פטרייתי הנפוץ ביותר של בני האדם, גורם כ 15% של המקרים רכשה החולים אלח דם. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס הוא היכולת ליצור biofilms שלה, קהילות מובנית של תאים מחוברת משטחים ביוטיים והאביוטיים. Biofilms ג אלביקנס יכולים ליצור רקמות מארח, כגון שכבות הרירית, ועוד מכשירים רפואיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, תותבות משותפת. Biofilms מהוות אתגרים משמעותיים קלינית כי הם עמידים מאוד בפני לפליטת פיזיקליות, כימיות, ויש לפעול כפי מאגרים זרע המופץ זיהומים. מבחני במבחנה שונים כבר נעזרו ללמוד אלביקנס ג ביופילמים, כגון מבחני צלחת microtiter, מדידות משקל יבש, מבחני הכדאיות תא קונפוקלית לייזר סריקה. כל מבחני אלה הם מבחני מובילים בודד, היכן שקובעת ביופילמים בנקודת זמן מסוימת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ללמוד ביופילמים בזמן אמת באמצעות מכשיר microfluidic אוטומטית תחת תנאי זרימה שכבתית. שיטה זו מאפשרת התבוננות ביופילמים כפי biofilm מתפתחת עם הזמן, שימוש להתאמה אישית בתנאים המחקים את אלה של המחשב המארח, כגון אלה המצויים קטטרים לכלי הדם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הליקויים biofilm של מוטציות גנטיות וכן אפקטים המעכבת של סוכני מיקרוביאלית על פיתוח biofilm בזמן אמת.

ביצענו microfluidic biofilm וזמינותו המתוארים כאן על ידי שימוש פראי-סוג של מתח אלביקנס ג בתנאים מדיה שני (RPMI-1640, עכביש מדיה), המתח פראי-סוג בנוכחות הסם פטריות ידוע שהוא גוסס B (16 µg/mL)-RPMI, שני זנים מוטציה בעבר דווח כי פגמים במבנה biofilm (Δbcr1/Δ וδ efg1/Δ) בתקשורת עכביש.
וידאו 1 מציג את התפתחות ממבנה biofilm פראי-סוג RPMI-1640 בינונית, את ההשפעות של התרופה נגד פטריות, המפוטריצין, על ביופילמים...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לדמיין את היווצרות הביופילם של קנדידה אלביקנס בזמן אמת בתנאים פיזיולוגיים של המארח. שיטה זו מאפשרת תצפית על היווצרות הביופילם בזמן אמת וניתן להשתמש בה כדי לבחון את יעילותם של חומרים אנטי-מיקרוביאליים או להעריך מוטציות גנטיות. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן טיפולים פוטנציאליים לפעילות נגד ביופילמים בצורה בעלת תפוקה גבוהה וניתן למדוד, לדמיין ולהשוות את יעילותם לטיפולים הנוכחיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחון היווצרות ביופילם במספר תנאים שונים שמעניינים את החוקרים. למרות ששיטה זו פותחה במיוחד כדי לחקור את היווצרות הביופילם של קנדידה אלביקנס, ניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים היוצרים ביופילם, כולל מיני פטריות אחרים כמו גם חיידקים. כדי להתחיל, הכינו תרביות מושבה בודדת של זנים שונים של C.albicans מתאים המצופים על תמצית שמרים פפטון דקסטרוז או אגר בינוני YPD בהתאם לשיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות.לאחר מכן, הפעל את המערכת המיקרופלואידית הכוללת את הבקר, שתי יחידות אספקת החשמל, המיקרוסקופ, המצלמה והמחשב המחוברים למערכת. לאחר טעינת המחשב, פתח את התוכנה השולטת במערכת. אתר את מספר הברקוד של הלוחית בשימוש והזן את המספר כאשר תתבקש על ידי התוכנה.ואז במודול הבקרה, הגדר את טמפרטורת המערכת המיקרופלואידית ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחץ על בארות הכניסה I1, I7, I13 ו-I19 והזרם אוויר סטרילי דרך צינורות לוחית הממשק למשך חמש דקות כדי להסיר כל עיבוי. כאשר כל העיבוי מתאדה, הנח את הצלחת המיקרופלואידית של 48 בארות 0-20 דיין על במת המיקרוסקופ.לניסוי היווצרות ביופילם של 12 שעות, התחל בהוספת 600 מיקרוליטר של מדיום מחומם מראש לבארות הכניסה. הורד לאט את לוחית הממשק הנקייה על גבי הצלחת המיקרופלואידית בת 48 הבארות. לאחר מכן החלק את לוחית הממשק מעט שמאלה עד שהצינורות ממוקמים על גבי בארות הכניסה והיציאה וננעלים במקומם.בקטע בקרת הגזירה של התוכנה, הגדר את מצב הזרימה לקבוע, והגדר את הגזירה המקסימלית לדיין אחד לסנטימטר בריבוע. לאחר מכן לחץ על בארות הכניסה עם המדיה כדי להתחיל את זרימת המדיה מכניסה לבארות יציאה על מנת לטשטש את הערוץ. לאחר חמש דקות של זרימה, לחץ על כפתור העצירה בקטע בקרת לוחית הבאר של התוכנה.לאחר מכן הסר את לוחית הממשק והתבונן בבארות הצלחת המיקרופלואידית. רק טיפה קטנה של מדיה צריכה להיות גלויה בבארות היציאה. כדי לבדוק זני C.albicans מסוג בר ומוטנטי, הוסף 50 מיקרוליטר של תרבית תאים SC5314 מסוג בר במדיה עכביש לשתי בארות יציאה, הוסף את מוטנט bcr1 במדיה עכביש לשתי בארות יציאה והוסף את מוטנט EFG1 במדיה עכביש לשתי בארות יציאה.הנח את לוחית הממשק בחזרה על הצלחת המיקרופלואידית ונעל את המכסה במקומו. בחזרה לקטע בקרת הגזירה של התוכנה, הגדר את מצב הזרימה לקבוע, והגדר את הגזירה המקסימלית לשני דיין לסנטימטר בריבוע. לחץ על בארות היציאה עם תאים כדי להתחיל בזרימת המדיה מהיציאה לבארות הכניסה כדי להתחיל בזריעה של C.albicans.לאחר שלוש שניות, לחץ על כפתור העצירה בקטע בקרת לוחית הבאר כדי למנוע כניסת תאים לבארות הכניסה. אפשר לתאים להישאר נייחים ללא זרימה במשך 10-20 דקות בערוץ הצפייה להיצמדות ראשונית לתאים. בחלון מודול ההדמיה, פתח את מודול הרכישה הרב-ממדית ולחץ על הכרטיסייה stage בתפריט בצד שמאל.בקטע הבמה, טען את רשימת הבמה הראשית עבור הצלחת המיקרופלואידית של 48 בארות 0-20 דיין. לאחר מכן, פתח את התאמת הטעינה מחדש של הדגימה והעבר את השלב למודולי מיקום מוחלטים. במודול התאמת הטעינה מחדש לדוגמה, לחץ על הלחצן החי כדי לראות תצוגה מקדימה של תמונה עם כוונת.בעזרת הג'ויסטיק, מקם את לוחית הבאר כך שקצה החץ הסמוך לערוץ הצפייה ארבע יתיישר עם הכוונת בתוכנה. לאחר מכן עבור להזזה stage לתפריט מיקום מוחלט ולחץ על כפתור המקור המוגדר. לאחר מכן, חזור למודול התאמת הטעינה מחדש של הדגימה, לחץ על קטע נקודת הייחוס הראשונית בתפריט השמאלי וטען את file עבור הצלחת המיקרופלואידית של 48 בארות 0-20 דיין.בקטע ה-stage של מודול הרכישה הרב-ממדי, לחץ פעמיים על הבמה מיקום 22.2 כדי להביא את המיקרוסקופ viewstage ואת מיקוד המצלמה קרוב לסמן החץ על ידי צפייה בערוץ 22. לאחר מכן השתמש בג'ויסטיק כדי למקם את לוחית הבאר כך שקצה החץ הסמוך לצפייה בערוץ 22 יתיישר עם הכוונת. העתק את קואורדינטת ה-Y במודול הרכישה הרב-ממדית למצב Y של.2 בכרטיסייה עדכון נקודות התייחסות של מודול התאמת הטעינה מחדש לדוגמה. לבסוף, בכרטיסייה עדכון מיקומי שלב של מודול התאמת הטעינה מחדש לדוגמה, לחץ על החל על רשימת השלבים של MDA. בחלון מודול ההדמיה, השתמש במודול הרכישה הרב-ממדי ולחץ על הכרטיסייה שמירה בתפריט השמאלי.לאחר מכן בחר את שם הקובץ עבור הניסוי ואת התיקיה לאחסון התמונות שנרכשו במחשב. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה Timelapse והגדר אותה כך שתשיג 145 תמונות בסך הכל חמש דקות בין כל תמונה. לאחר מכן, בכרטיסייה אורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל לאחד וצלם ב-50% שדה בהיר ו-50% מצלמה עם זמן חשיפה של 12-20 אלפיות השנייה.הגדר את הרווח ל-0.6 ואת הדיגיטייזר ל-20 מילי-הרץ. לאחר הגדרת המיקוד כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, בחר לרכוש כדי להתחיל לצלם תמונות שטיפה מראש של תאים מודבקים עבור כל תת-השלבים. בקטע בקרת הגזירה, הגדר את מצב הזרימה לקבוע, ואת הגזירה המקסימלית לדיין אחד לסנטימטר בריבוע.לאחר מכן לחץ על בארות הכניסה כדי להתחיל בזרימת המדיה מכניסה לבארות יציאה על מנת להסיר תאים שאינם דבוקים. לאחר חמש דקות, לחץ על כפתור העצירה בקטע בקרת צלחת הבאר. אפשר לרכוש סבב שני של תמונות ולאחר מכן בקטע בקרת הגזירה, כוונן את זרימת הגזירה המקסימלית ל-0.5 דיין לסנטימטר בריבוע ואשר את השינוי.בחלון מודול ההדמיה, בחר בכרטיסייה כלי ניתוח ולחץ על סקור נתונים רב-ממדיים מהתפריט הנפתח. לאחר מכן לחץ על בחר קובץ בסיס. פעולה זו תפתח את חלון כלי השירות של סל הנתונים הרב-ממדי.לאחר מכן, לחץ על כפתור בחירת הספרייה ובחר את התיקיה ששימשה לשמירת הניסוי. ברשימת ערכות הנתונים, בחר את יומן קבצי הניסוי. לאחר טעינת היומן, לחץ על כפתור התצוגה.בחר את אורך הגל על ידי לחיצה על האפשרויות בתפריט אורכי הגל השמאלי ובחר את מיקום הבמה לצפייה מתפריט נפתח. בחר את התמונה לטעינה מהמספרים בחלק העליון של המודול על ידי לחיצה ימנית על מספר התמונה. לאחר מכן בחר את כל התמונות על מנת ליצור סרטון זמן-lapse.התמונות שנבחרו ייפתחו כסרטון בחלון חדש. לחץ על הכרטיסייה file בחלון מודול ההדמיה ובחר שמור בשם מהתפריט הנפתח. שמור את הסרטון שהתקבל כפורמט הקובץ המוגדר כברירת מחדל.לבסוף, פתח וטען את קובץ הווידאו השמור לתמונה J.In לתמונה J, לחץ על הכרטיסייה קובץ ולאחר מכן לחץ על שמירה בשם. בחר AVI מהתפריט הנפתח והמר את הקובץ לקובץ AVI באמצעות המרת JPEG מוגדרת ל -10 פריימים לשנייה. בתנאים מסוג פרא במדיה RPMI 1640, מספר תאים נצמדו חזק לערוץ.הם יוצרים קורים וניתן לראות ביופילם עבה עם קורים ותאי שמרים משולבים. לקראת סוף הניסוי המיקרופלואידי, הביופילם מסוג הבר ממלא לחלוטין את ערוץ הצפייה הזה. עם זאת, לנוכחות של אמפוטריצין B יש השפעה בולטת על הפחתת היווצרות הביופילם.באופן ספציפי, היצמדות התאים פוחתת וניתן לראות מספר תאים זורמים עם זרימת הגזירה של המדיה. תאי הבקרה מסוג הבר, הפעם גדלו במצע עכביש, יצרו ביופילם דומה לזה שהוצג זה עתה גדל ב-RPMI. במדיה זו גדלים גם שני מוטאנטים פגומים בביופילם.שני הזנים מראים ירידה משמעותית בהיווצרות ביופילם בהשוואה לקבוצת הביקורת. באוכלוסיית תאים זו, תאים דבוקים אינם יוצרים קורים והביופילם שנוצר פגום מאוד. זן אחר זה פגום הן ביצירת ביופילם והן ביכולתו להיצמד לתעלה.לאחר שליטה, ניתן להגדיר את הניסוי הזה תוך פחות משעה. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד הרבה על מספר היבטים שונים של היווצרות ביופילם, כולל היצמדות ראשונית של תאים, הבשלת ביופילם ופיזור תאים. פרוטוקול זה ניתן להתאמה אישית ורב-תכליתי.ניתן להתאים אותו כדי להעריך מינים מיקרוביאליים שונים ברחבי הממלכות. קצבי זרימה, טמפרטורות, זמני דגירה ומדיה יכולים לשמש גם לחקר ביופילמים של מינים מעורבים. אנו ממליצים בחום על בדיקת ביופילם מיקרופלואידית זו כבדיקת מבחנה לשימוש לפני ניסויים בבעלי חיים in vivo.מניסיוננו, התוצאות מבדיקה זו מתואמות היטב עם מבחני ביופילם קיימים in vivo.

visualization-biofilm-formation-candida-albicans-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה וחזקה...

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

פיתחנו פלטפורמה בצפיפות גבוהה microarray המורכב 3D ננו biofilms...

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

מקור: קורץ, ד. ל. ואחרים. פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סגימה ביולוגית במדיה נקבובית. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לחקר יצירת ביופילם. השעיה חיידקית מוכנסת לתעלה המיקרו, ואחריה אינקובציה לאפשר התפתחות ביופילם. לאחר מכן מתחדשת הזרימה, וניטור לחץ יחד עם הדמיה משמש לזיהוי היווצרות ביופילם וחסימת נקבוביות לאורך זמן.

מכשיר מיקרופלואידי להדמיה בזמן אמת ומעקב לחץ במהלך יצירת ביופילם

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל עכבר in vivo לחקר היווצרות ביופילם של קנדידה אלביקנס ברקמה תת-עורית. הניסוי כולל השתלת מכשירים נגועים בקנדידה באזור הגב של החיה לצורך פיתוח ביופילם.

קנדידה אלביקנס היווצרות ביופילם במודל עכבר In Vivo

סרטון זה מתאר שיטה לגידול וניתוח איכותי של ביופילמים חיידקיים על קורים פטרייתיים באמצעות מיקרוסקופיה. ביופילמים חיידקיים נוצרים לעתים קרובות על משטחים פטרייתיים וכוללים תהליכי אינטראקציה חיידקיים-פטרייתיים רבים, כגון שיתוף פעולה מטבולי, תחרות או טריפה.

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

נדונים פרוטוקולים לחקר היווצרות ביופילם במכשיר מיקרופלואידי, המחקה מדיה נקבובית. המכשיר המיקרופלואידי מורכב ממערך של מיקרו-עמודים והיווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens במכשיר זה נחקרת.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

אנו מציגים הליך ניסיוני של התפתחות ביופילם של קנדידה אלביקנס במודל תת עורי של עכבר. ביופילמים פטרייתיים כומתו על ידי קביעת מספר היחידות היוצרות מושבה ועל ידי הדמיית ביולומינסנציה לא פולשנית, כאשר כמות האור המופקת תואמת את מספר התאים הקיימאים.

קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

כדי להציג ולכמת את התכונות הפנימיות של קנדידה אלביקנס ביוילאמים, אנו מכינים דגימות שלמות קבוע כי מובהר על ידי השבירה המדד התאמה. לאחר מכן ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אופטית כדי להשיג נתוני תמונה תלת-ממדיים למרות העובי המלא של הנתונים.

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

למד הדמיית ביופילמים בזמן אמת של Candida albicans באמצעות מכשיר מיקרו-פלואידי אוטומטי. שיטה זו מאפשרת בדיקת יעילות תרופות אנטי-פטרייתיות והערכת מוטנטים גנטיים במחקר מיקרוביולוגי.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

גלה סרטונים נוספים