ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית
7 במרץ 2018
פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.
המטרה הכוללת של מערך ניסוי זה היא לתאר את השכבות העיקריות של ויסות RNA ו-DNA כדי לחשוף מנגנונים מולקולריים עיקריים המתרחשים בתגובה לגירוי או טיפול. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים ביולוגיים רבים ושונים, כגון תגובות חיסוניות באופן כללי, אך גם תגובות מולקולריות לטיפול תרופתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להציג בו זמנית שכבות מרובות של ויסות גנים לאורך זמן.
לכן, חשוב להשתמש באותו מאגר תאים עבור כל שיטה. באופן כללי, שלושת הפרוטוקולים הללו כוללים תחילה מניפולציה של תאים מעניינים בנקודות זמן שונות. לאחר כל מניפולציה, התאים מאוגדים ומחולקים לשלוש קבוצות, אחת לכל בדיקה.
חלק זה של הסרטון מתאר את התיוג והטיהור של התמלילים האחרונים שהופקו באמצעות תיוג 4sU. כל פרוטוקול מייצר בסופו של דבר דגימות מוכנות לריצוף. ראשית, חפש את ריכוז ה-4sU הנדרש וזמן הדגירה הדרושים לקו התא המעניין.
לדוגמה, 200 מיקרו-מולרי 4sU משמשים על תאי T למשך שעה אחת. הפרד את מאגר התאים לאחר הטיפול לכלי נפרד אחד לכל שיטה ונקודת זמן. לאחר מכן, הפשירו את המספר הנדרש של 4sU aliquots לחלוטין, והוסיפו את ה-4sU ישירות למדיום התא ודגרו על התרביות לפי ההוראות.
לאחר מכן, אספו את התאים המסומנים ב-4sU בצינורות פוליפרופילן. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים. השעו מחדש את הגלולה בטריזול בכשלושה מיליון תאים למיליליטר, ודגרו על התאים בטריזול בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
כעת הכינו 30 עד 80 מיקרוגרם של RNA, או יותר, בשיטה של ראדל ושות'. לאחר מכן, ערבבו את תגובת הביוטינילציה הספציפית לתיול בסדר זה. התחילו עם מים נטולי נוקלאז, לאחר מכן חיץ פי 10, לאחר מכן RNA, ולבסוף ביוטין-HPDP.
לאחר מכן, מערבבים עם פיפטינג ודוגרים. המשך בשלב הניקוי כדי לייצר דגימות של RNA ביוטיניל מתומלל לאחרונה מעורבב עם RNA קיים ללא תווית. לאחר מכן, מחממים את הדגימות ל 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר מכן, הניחו אותם מיד על קרח. לאחר שכל דגימה מתקררת, מוסיפים 100 מיקרוליטר חרוזי סטרפטווידין, ודוגרים אותם בטמפרטורת החדר עם סיבוב למשך 15 דקות. כעת, בודדו את החרוזים המעוטרים ב-RNA שזה עתה תומלל באמצעות עמוד מגנטי, ולאחר מכן השליכו את ה-RNA ב-11 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לרצף.
סעיף זה מתאר כיצד לבודד רנ"א שנמצא בתרגום פעיל. רצף התמלילים הללו סוקר את התרגום הדינמי. יחד עם נתוני ריצוף RNA, בדיקה זו מאפשרת לחשב את תחלופת ה-RNA ושיעורי התרגום.
התחל בהוספת ציקלוהקסימיד לתרחיף וערבוב באמצעות היפוכים. לאחר דקה אחת בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את התאים, הסר את המדיום ושטוף תאים עם לפחות 10 מיליליטר PBS בתוספת ציקלוהקסימיד. לאחר מכן, שאפו את המדיום, והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאי יונקים לכל 10 מיליון תאים.
יש לשלש את התערובת כדי לזרוק את התאים באמצעות מחט בגודל 20 עד 25. לאחר מכן, העבירו את ליזט התא לצינור מקורר מראש של 1.50 מיליליטר, ודגרו את הליזאט על קרח למשך 10 דקות עם היפוכים תקופתיים. לאחר 10 דקות, צנטריפוגה את הליזאט והעבירו את הסופרנטנט לצינור קריר של 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן, הכינו דילול של 1 עד 10 של הליזאט במים נטולי נוקלאז, ומדדו את הספיגה ב-260 ננומטר. לאחר מכן, צור 200 מיקרוליטר של הליזט הלא מדולל, וטפל בכל אחד מהם ב-7.5 יחידות נוקלאז עבור כל יחידת ספיגה. אפשר לנוקלאז להגיב במשך 45 דקות, ולאחר מכן לסיים את התגובה באמצעות 15 מיקרוליטר של מעכב RNase, או לאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, טהר את ה-RPF RNA באמצעות ערכה מסחרית, והמשיך עם דלדול rRNA, גם באמצעות ערכה. לאחר מכן, בצע טיהור PAGE על 500 ננוגרם של RNA RPF מבודד. לאחר הכנת הדגימות לטעינה בג'ל, יש לפרק אותן, את האחרון ואת הבקרות, עם דגירה של חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הפעל את הדגימות ב-180 וולט במשך כ-75 דקות, והעריך את התוצאות. עבור קולקציית פרוסות הג'ל, תקעו חורים בתחתית צינור של 0.5 מיליליטר באמצעות מחט סטרילית בגודל 20. לאחר מכן, בלו פרוסות ג'ל המתאימות לאזור הנוקלאוטידים הבסיסיים של 28 עד 30, והעבירו אותן לצינורות המוכנים של 0.5 מיליליטר.
כלול דגימה של בקרת ה-RNA ודגימה של הבקרה השלילית כדי לבדוק אם יש זיהום. לאחר מכן, טען את צינורות הדגימה הקטנים והמכוסים לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות גדולים יותר. לאחר מכן, צנטריפוגה את המכלולים כדי לגרוס את הג'ל, ולהעביר את הדגימה לצינור של 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן, הוסף מים, אמוניום אצטט ו-SDS לצינורות הדגימה כדי לסלק את ה-RNA בתגובת לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמשו בערכה מסחרית כדי ליצור ספריית cDNA מה-RNA הקטן, והמשיכו בריצוף ספריית ה-cDNA. ChIP-seq משמש למיפוי הקישור של גורם שעתוק מעניין בכל הגנום.
בשילוב עם נתונים מפרופיל ריבוזום וסקר כל התמלילים החדשים, ChIP-seq חושף את ההשפעה הממשית של קשירת גורם השעתוק. כדי להתחיל, הצליב את דגימות התאים באמצעות פורמלדהיד לריכוז סופי של 1%לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין, עצור את התגובה על ידי העלאת ריכוז הגליצין ל-0.125 טוחנת. לאחר מכן, אספו את התאים ושטפו אותם שלוש פעמים עם PBS קר כקרח, והקפיאו את כדור התא בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.
מאוחר יותר, השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאים קרים כקרח עם מעכבי פרוטאז טריים שנוספו, ודגרו את התאים על הקרח למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, סובב את התאים, שאב את הסופרנטנט וחזור על הוספת מאגר הליזיס והדגירה. לאחר מכן, השתמש בסוניקציה כדי ליצור כרומטין גזוז בין 200 ל-1,000 זוגות בסיסים.
לאחר מכן, חבר את הכרומטין לחרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים, והוציא את קומפלקסי החלבון-DNA ב-50 מיקרוליטר של מאגר פליטה. לאחר מכן, הוסף את חמשת המיקרוליטרים של 40% RNase ומאגר פליטה, ודגר את הדגימה למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה יחידה אחת של פרוטאינאז K ו-20 מיקרוגרם גליקוגן, ודגרו עליה למשך שעתיים.
לאחר מכן, העבר את הדגימה ל-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להפוך אותה לקישור צולב. למחרת, הניחו את הדגימה כנגד המגנט למשך 30 שניות לפחות, ואז אספו את הסופרנטנט, שמכיל את הדנ"א המבוקש. לאחר מכן, טהר את ה-DNA, השתמש ב-PCR כמותי לאימות ורצף את ה-DNA.
תיוג 4sU יכול להלחיץ תאים ולהוביל לאפופטוזיס. צביעת נספח V ו-7-AAD שימשה לזיהוי תאים אפופטוטיים ומתים. לאחר תיוג תאי Th1 עם 4sU באמצעות טיפולים של 30 או 60 דקות, התאים לא מתו או עברו אפופטוזיס.
תקינות הרנ"א נבדקה תמיד לפני הריצוף באמצעות מבחן סטנדרטי, שכן יש לכך חשיבות רבה בעת עיבוד רנ"א. לספריות מוגברות היה טווח בריא של נוקלאוטידים. דימרים מוגזמים של מתאם היו זקוקים לטיהור נוסף על ידי PAGE.
יותר מדי תבנית או יותר מדי מחזורים מביאים לנוקלאוטידים כבדים, מוצרים מרוחים ומוצרי דימר מתאם גזירת כרומטין נמצאה כיעילה ביותר כאשר החלק העיקרי של הכרומטין הגזוז היה בסביבות 1,000 זוגות בסיסים או מעט פחות. PCR כמותי שימש לבדיקת תחולת הנוגדן לריצוף חיסון כרומטין. פריימרים לבקרה שלילית מיועדים לגנים שאינם באים לידי ביטוי בתאים המעניינים.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין תוכנית מפורטת של מערך הניסוי, כולל לוח זמנים מתי להוסיף 4sU ומתי לקצור את התאים עבור כל שיטה. ודא תמיד את תנאי התיוג האופטימליים של 4sU על ידי בדיקת ההשפעה של 4sU על כדאיות התאים ותגובת הלחץ מראש. לסיכום, גישה זו מאפשרת לנו לדמיין את כל אירועי ויסות הגנים שעלולים להתרחש במהלך תהליך של הפעלה תאית.
ניתן להשתמש בשיטה זו גם עבור תאי חיסון ראשוניים ותגובתם לגירוי או לתרופה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורי ב-ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq ופרופיל ריבוזומים עבור שורות תאים ותאים ראשוניים. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בקישור של גורמי שעתוק, שעתוק de novo, עיבוד RNA, תחלופה ותרגום לאורך זמן, והצגת מהלך האירועים הכולל בתאים מופעלים ו/או תאים העוברים שינויים מהירים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי מוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- שיטה זו מסייעת במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחומים ביולוגיים שונים.
- היא מאפשרת תצוגה סימולטנית של שכבות מרובות של ויסות גנים לאורך זמן.
- שימוש באותו מאגר תאים עבור כל שיטה הוא קריטי להשגת תוצאות מדויקות.
- הפרוטוקולים כוללים מניפולציה של תאים בנקודות זמן שונות.
מטרת המחקר
- להגדיר את השכבות העיקריות של ויסות RNA ו-DNA.
- לחשוף מנגנונים מולקולריים מרכזיים בתגובה לגירויים או לטיפולים.
- לנתח תגובות חיסוניות ותגובות מולקולריות לטיפולים תרופתיים.
שיטות במחקר
- סימון באמצעות 4sU לבידוד RNA שכתוב לאחרונה.
- פרופיל ריבוזומים (Ribosome profiling) לסקר של הטרנסלטוזום הדינמי.
- ChIP-seq למיפוי קישור של גורמי שעתוק ברחבי הגנום.
- ריצוף של דגימות RNA לניתוח בקרה גנטית.
תוצאות עיקריות
- ניתוח סימולטני של קישור גורמי שעתוק ודינמיקה של RNA.
- תובנות לגבי קצבי תחלופה ותרגום של RNA.
- חשיפת ההשפעה של קישור גורמי שעתוק על ביטוי גנים.
- מתן מבט מקיף על תגובות תאיות לגירויים.
מסקנות
- הגישה המשולבת משפרת את ההבנה של בקרה גנטית.
- היא מציעה כלי רב-עוצמה לחקר תגובות תאיות בהקשרים שונים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומי ביולוגיה אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח בזמן אמת של קישור גורמי שעתוק, שעתוק, תרגום ותחלופת RNA בו-זמנית מספק מבט מקיף על דינמיקת הבקרה הגנטית במהלך הפעלה תאית. גישה משולבת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בנקודות תפנית קריטיות של תהליכי גילוי. השיטה תומכת במחקר ופיתוח ארגוני על ידי מתחה פרופילינג מולקולרי רב-שכבתי וחסון בתגובה לגירויים או לחשיפה לתרופות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של קישור גורמי שעתוק ושל אירועי בקרה גנטית במורד הזרם.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור שינויים בשעתוק לסינתזה פונקציונלית של חלבונים.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות פרופיל מולקולרי רחב-גנומי ורזולוציית זמן.
- משפר את רמת הוודאות החיזוית לצורך מיון תיקי פיתוח באמצעות שילוב של מספר שכבות בקרה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך התהליך, באמצעות כימות תגובות שעתוק ותרגום.
- מסטנדרט את תוצרי הבדיקה עם נתוני רצף כמותיים הניתנים לשחזור על פני שכבות רגולטוריות.
- מאפשר ניתוח רחב-היקפי (high-throughput) וניתן להרחבה של ביטוי גנים ותרגום לצורך מוכנות לסריקה.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על בקרה גנטית וסינתזת חלבונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מדדים מולקולריים למודלים של הפעלה תאית ותגובה לתרופות הרלוונטיים למחלה.
- מבטיחה רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי מעקב אחר אירועי ויסות גנים לאורך זמן.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתונים מולקולריים מקיפים.
- משפרת הפחתת סיכונים חזויה לפיתוח ביומרקרים תרגומיים כאשר הדבר נתמך על ידי הנתונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
סבב עבודה זה של רצף קומבינטורי מגשר בין השלב המוקדם של הגילוי, זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח מולקולרי רב-שכבתי בזמן אמת ברצף ניסיוני אחד.
- ביולוגיה של גילוי: משלבת בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים באמצעות מיפוי של קישור גורמי שעתוק והשפעות במורד המסלול.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה של שעתוק, תרגום ומחזור RNA לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אירועים מולקולריים לתגובות תאיות הרלוונטיות למחלה ומנגנוני תרופות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור פרופיל מולטי-אומיקס בסוגי תאים ובגירויים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומצמצם עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות מולקולריות רב-שכבתיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום תוכניות גילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית, ריצוף וניתוח ביו-אינפורמטיקה.
- מצריך גישה לפלטפורמות ריצוף בעלת תפוקה גבוהה ותשתית אנליטית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת של הכנת דגימות ועיבוד נתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל שונות, כולל תאים ראשוניים ואורגניזמים שונים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות עקה תאית כתוצאה מהסימון וצורך בבקרות קפדניות של חיוניות ואיכות.
