הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גרורות הסרטן לגבי תפקיד קולוניזציה של הריאות בהשגת גרורות סרטניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין תאים סרטניים מוקדמים בריאות במהלך גרורות סרטניות. מי שתדגים את ההליך תהיה צ'נג-האן יאנג, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי.

כאשר תרבית תאי הגידול הגיעה למפגש של 70 עד 80 אחוזים, שטפו את התרבית פעמיים בשני מיליליטר PBS סטרילי לכל שטיפה, והוסיפו מיליליטר אחד של 0.5% טריפסין-EDTA לצלחת התרבות. הסר מיד 800 מיקרוליטר של הסופרנטנט והניח את צלחת התרבות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 שניות עד שרוב התאים התנתקו מהצלחת. הוסף מיליליטר אחד של מדיום טרי, בתוספת 10% FBS כדי לעצור את התגובה והשתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לערבב במרץ את תמיסת התא.

העבירו את התרחיף החד-תאי שנוצר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן השעו מחדש את כדור תאי הגידול ב-1.5 מיליליטר של מדיום בתוספת 20% FBS, וסובבו את התאים מקצה לקצה למשך שעתיים, ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, ספרו את התאים ברי הקיימא על ידי אי הכללה כחולה של טריפן ואספו אותם על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS סטרילי לצנטריפוגה שנייה והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS בתוספת 10% FBS ו-20 מיקרו מיליליטר CFSE. לאחר עשר דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך, צנטריפוגה את התאים, ותלה מחדש את הכדור בארבעה מיליליטר של מדיום בתוספת אחוז אחד FBS לצנטריפוגה נוספת. לאחר השטיפה האחרונה, השעו מחדש את התאים לחמש פעמים עשרה עד שישית תאי גידול למיליליטר של מדיום טרי ללא ריכוז FBS, והניחו את התאים על קרח.

לאחר מכן, חממו את הזנב של עכבר C570 Black Six זכר בן ארבעה עד שישה שבועות למשך חמש עד עשר דקות כדי להרחיב את ורידי הזנב והשתמשו במזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26 וחצי כדי לערבב היטב את התאים עד להשגת תרחיף תא בודד. טען בזהירות את המזרק עם 200 מיקרוליטר תאים והנח את העכבר במרסן. לאחר מכן הזרקו את כל נפח התאים ללומן של וריד זנב מורחב.

בנקודת הזמן המתאימה לאחר ההזרקה, בצע חתך עור אורכי ורקמות תת עוריות מהבטן לחזה ופתח את חלל הצדר כדי לחשוף את הלב והריאות. בעזרת תפרים כירורגיים סטריליים, קשרו את הווריד הנבוב העליון והתחתון כדי למנוע זרימה חוזרת של תמיסת השפע והשתמשו במספריים כדי ליצור סדק של שניים עד ארבעה מילימטרים בחדר השמאלי כדי להקל על ניקוז הפרפוזה מהריאות. לאחר מכן השתמש במזרק של שלושה מיליליטר כדי להזריק PBS לחדר הימני והשתמש ביניקה מתמשכת כדי להסיר את התמיסה המרוקנת עד שהריאות משתנות מצבע אדמדם לחיוור לחלוטין.

הקפד לאבטח את הווריד הנבוב העליון והתחתון כראוי לזלוף ריאות מוצלח. לאחר קצירת הריאות, הניחו את האונות במחזיק ריאות בהתאמה אישית בצלחת של שישה סנטימטרים, ואבטחו את הריאות על המרקם המרושת של המחזיק. מכסים ומרטיבים את האונות ב- PBS, ומניחים את צלחת התרבות על שלב ההדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי.

בחר את המטרה 5x וסובב את גלגל המסנן ל-NIBA. באמצעות לייזר של 488 ננומטר, עורר את ה-CFSE כדי לאפשר הדמיה ברורה של תאי הגידול הכחולים הפלורסנט בתוך אונות הריאה. סובב את גלגל המסנן ל-R690 כדי לסרוק במהירות סריקה של שתי מיקרו-שניות לפיקסל ולייעל את רמות הרווח וההיסט של המתח הגבוה.

לאחר מכן צלם חמש תמונות פלואורסצנטיות בגודל 12 על 5 פיקסלים באמצעות מהירות סריקה של 10 מיקרו-שנייה לפיקסל. באמצעות שיטת הצביעה, כפי שהודגם זה עתה, תאי הגידול מסומנים ביעילות ב-CFSE באופן תלוי מינון. עם עוצמת הקרינה של התיוג, כמעט הגיעה לרמה בשש כפול 10 לתאי קרצינומה ריאה חמישית של לואיס למיליליטר בריכוז של 20 מיקרומולרי.

זלוף ריאות לפני הקציר כפי שהודגם זה עתה מנקה את כלי הדם של הריאות מתאי גידול במחזור לא קצוצים במיוחד לפני ניתוח ההדמיה. מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית חושפת את נוכחותם של תאי הגידול המתיישבים המסומנים ב-CFSE בתוך אונות הריאה שנקטפו והוחדרו. שימוש בתוכנת ניתוח תמונה מתאימה להמרת התמונות הפלואורסצנטיות לשחור לבן, מקל על כימות קולוניזציה של הריאות.

אספקה תוך ורידית של פיברונקטין המבטא או פיברונקטין מקושקש המבטא תאי קרצינומה של ריאות לואיס מדגים מספר נמוך משמעותית של תאים המבטאים פיברונקטין ברקמת הריאה שנקטפו 38 ו-45 שעות לאחר ההזרקה, מה שמדגיש את תפקידו של פיברונקטין בהתיישבות אונות הריאה ובהתפתחות הגידול. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחלחל בזהירות את הריאות כדי שניתן יהיה לשטוף את התאים הלא מחוברים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום גרורות סרטניות לחקור קולוניזציה של ריאות על ידי מחזור תאי גידול במודל אפס גרם של עכבר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג באופן פלואורסצנטי תרחיפי תאי גידול, לחסן תוך ורידי את תאי הגידול לחלחל לריאות עכבר, ולהשתמש במיקרוסקופ פלורסנט קונפוקלי כדי לדמות את תאי הגידול הגרורות.