Name: אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: חקור מעקב ביטוי גנים שעון היממה בגרעין הסופרכיאסמטי בעכברים חופשיים באמצעות ניטור פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת מדידות ברזולוציה גבוהה בתנאי אור-חושך וחושך-חושך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לחברי במעבדה ג'אנג למתן גירוי חברים במעבדה Zhan ודיונים על מתן סיוע טכני. מחקר זה נתמך על ידי מענקים 31500860 (כדי C.Z.) של NSFC, 2012CB837700 (ל E.E.Z. ו- C.Z.) של התוכנית 973 מ M.O.S.T. של סין, על ידי מימון מהממשלה העירוני של בייג'ינג. E.E.Z. נתמך על ידי הסינים "גיוס תוכנית גלובלית הנוער המומחים".

לכל השגרות פרוטוקול זה נערכו עם האישור של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של הלאומית המכון הביולוגי למדעים, בייג'ינג, בהתאם לכללים ממשלתיים של סין.
1. בניית הכתב זריחה Cry1
הערה: מחקרים היממה הקודמת באמצעות ביולומינסנציה מערכת2,12,13 נתיך מקדם היממה עם destabilized לוציפראז (dLuc) כדי לעודד ביטוי אומנותית dLuc . כדי לפתח כתב פלורסצנטיות, גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז הוחלף עם פלורסצנטיות גרם אולי לפגיעה ביציבות חלבון (dVenus) כדי לעודד ביטוי אומנותית dVenus . הדור של P (Cry1)-כתבונוס d היא כמפורט להלן, הבונה של אשר כעת להיות מוגשים Addgene ויהיה זמין בקרוב לשימוש אקדמי.
<ol><li>להגביר יזם Cry1 את העכבר פונקציונלי (+328 לאזור-1208 bp של הגן Cry1 , תמלול התחלה האתר מיועד לשמש כ '-1 '). השתמש האנזים PCR (KOD פלוס-ניאו), תחל F1 ו- R1 (ראה טבלה 2), עכבר הגנום כמו תבנית ו- PCR של היצרן פרוטוקול כדי להגביר את מקטע DNA יזם Cry1 .</li>
	<li>להגביר אינטרון 336 של הגן Cry1 , אשר חשוב עבור פונקציית שעון היממה Cry114. השתמש האנזים PCR, תחל F2 ו- R2, העכבר גנום בתור תבנית PCR פרוטוקול של היצרן כדי להגביר את מקטע ה-DNA אינטרון 336.</li>
	<li>להגביר את ונוס. השתמש האנזים PCR, תחל F3 ו R3, pVENUS-N1 פלסמיד וגם תבנית PCR פרוטוקול של היצרן כדי להגביר את מקטע ה-DNA ונוס .</li>
	<li>להגביר את מקטע ה-DNA של NLS-D2. השתמש האנזים PCR, תחל F4 ו- R4, pcDNA3.3-d2eGFP פלסמיד וגם תבנית PCR פרוטוקול של היצרן כדי להגביר את מקטע ה-DNA של NLS-D2.</li>
	<li>לסנתז DNA קטע 1 כמו אקסון 1.</li>
	<li>לסנתז DNA קטע 2 כמו מקשר בין אינטרון 336 את מקטע ה-DNA ונוס .</li>
	<li>לחתוך את pAAV-EF1a-כפול floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA פלסמיד וקטור עם אנזימים MluI, EcoRI. להשתמש ערכת חילוץ ג'ל כדי לטהר את מקטע דנ א גדולים יותר. להשתמש בפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>באמצעות שילוב הרכבה גיבסון והפרוטוקול סטנדרטי, להרכיב כל שברי DNA יחד כדי לייצר הכתב-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1). להשתמש בפרוטוקול של היצרן.</li>
</ol>2. הפקה של וירוס Adeno-הקשורים15
<ol><li>להכין פלסמיד הבאים דנ א מניות: 31.25 µg של pRV1, µg 31.25 של pH21, 125 µg של pFdelta6 ו- µg 62.5 של pAAV-P (Cry1) - intron336 - ונוס-NLS - D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>היכונו חמש מנות 15 ס מ של תאים 293T והמתן עד התאים להיות 90% confluent.</li>
	<li>Transfect של פלסמידים לתוך התאים 297T בעקבות פרוטוקול ריאגנט תרביות תאים. עבור כל מנה, השתמש 6.25 µg של pRV1, µg 6.25 של pH21, µg 25 של pFdelta6, µg 12.5 של pAAV-P (Cry1)-µL intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA ו-120 של ריאגנט תרביות תאים.</li>
	<li>72 h לאחר תרביות תאים, לנתק את התאים של כל צלחת באמצעות אקדח פיפטה; לקצור את התאים לתוך שני צינורות 50 מ.</li>
	<li>גלולה התאים ב g 800 x 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים על ידי הצבת 20 מ"ל של תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) לתוך כל שפופרת; גלולה התאים ב g 800 x 10 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend כדורי 150 מ"מ NaCl ו 20 מ"מ טריס פתרון, pH 8.0; השתמש 25 מ של פתרון/צינור. מוסיפים 1.25 מ ל שזה עתה הוכנו 10% נתרן deoxycholate (ב- dH2O) כל שפופרת. להוסיף נוקלאז benzonase ריכוז סופי של 50 יחידות מ"ל ומערבבים היטב. דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.</li>
	<li>הסרת לכלוך התאית על ידי צריך שתוציאו ב 3000 g x למשך 15 דקות. להבטיח כי כל פסולת הוסר על ידי דחיפת את התערובת דרך מסנן מזרק 0.45 μm; שלב זה יעזור למנוע את החסימה של הפארין עמודות.</li>
	<li>להגדיר את העמודות הפארין באמצעות משאבה סחרור; הגדר את קצב הזרימה 1 mL/min, המבטיח כי אין בועות אוויר יוכנסו העמודות.</li>
	<li>Equilibrate את העמודות עם 10 מ ל מ 150 NaCl, 20 מ מ טריס פתרון, pH 8.0. הוסף את הפתרון המכיל וירוס כדי כל עמודה. לשטוף את העמודות עם 20 מ ל מ 100 NaCl, 20 מ מ טריס פתרון, pH 8.0. לאחר מכן, באמצעות מזרק 5 מ ל, לשטוף את העמודות עם 1 מ ל מ 200 NaCl ו- 20 מ מ טריס פתרון pH 8.0, ואחריו 1 מ"ל מ 300 NaCl ו 20 מ מ טריס פתרון, pH 8.0.</li>
	<li>השתמש מזרק 5 מ ל כדי elute את הוירוס עם 3 מ ל מ 400 NaCl, הפתרון טריס 20 מ מ, pH 8.0, ואחריו 4 מ ל מ 450 NaCl, הפתרון טריס 20 מ מ, pH 8.0, ולבסוף על ידי 3 מ ל מ 500 NaCl , הפתרון טריס 20 מ מ, pH 8.0. לאסוף את החומרים שחולצו.</li>
	<li>ריכוז וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV), טען החומרים שחולץ, 4 מ ל בכל פעם, ליחידות צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי 100,000 הקיצוץ. Centrifuge כל מדגם 4-mL-g x 2000 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, השמטת את הזרימה דרך.</li>
	<li>כאשר כל החומרים שחולצו שנוהלו באמצעות היחידות צנטריפוגלי מסנן, להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, centrifuge את התערובת לתוך μL כ-250. להסיר rAAVs (כייל ויראלי צריכים להיות 2-8 x 1012 חלקיקים נגיפיים לכל mL) צנטריפוגלי מסנן יחידות, aliquot, חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. בשלב זה, ניתן לאחסן את הוירוס למשך מספר חודשים.</li>
</ol>3. rAAV הזרקת והוספה סיבים אופטיים לתוך SCN למבוגרים העכבר
<ol><li>הזרקה של זריחה היממה נושא כתב rAAVs לתוך SCN<ol>
<li>לטעון 5 µL של rAAV (כייל וירוס הוא על 2-8 x 10 חלקיקי וירוס12 לכל mL) לתוך מזרק מיקרו.</li>
		<li>עזים ומתנגד של העכבר למבוגרים (2 עד 5-בן חודש, רקע C57BL/6) עם מסקלין (80 מ ג/ק ג) באמצעות הזרקת בקרום הבטן. בדוק עומק מספיק של הרדמה לתחושה של חוסר תגובה הבוהן-קורט.</li>
		<li>להשתמש במספריים כדי להסיר פרווה מראשו של העכבר ולאחר מכן לטעון את העכבר לתוך מנגנון stereotaxic. לספק מקור חום לבעלי ומורדמת באמצעות שמיכה במחזור מים חמים או התקן חימום נוסף. הערה: לחלופין, להשתמש קוצץ שיער קרם או חשמלי depilatory כדי להסיר את הפרווה.</li>
		<li>נקה באתר כירורגית עם הסוכנים חיטוי מתאים. לדוגמה, זה יכול לכלול סטרילי מים או אלכוהול, יוד, betadine, או למהול chlorhexidine מתחלפים scrubs. חזור על פחות 3 פעמים. לעטוף באתר כירורגית.</li>
		<li>השתמש את המספריים אעשה חתך בקרקפת ולחשוף את הגולגולת.</li>
		<li>להתאים את המנגנון stereotaxic כך bregma למבדה הם באותו מישור אופקי; להפוך שתי נקודות סימטריות bregma באותו מישור אופקי.</li>
		<li>שימוש ספוגית כותנה סטרילי טבולים 4% H2O2/H2O מנפחם קרום מוח העצם. לאחר מכן להשתמש ספוגית כותנה נקי, סטרילי כדי לנקות לייבש את פני השטח של הגולגולת.</li>
		<li>באמצעות תרגיל מיקרו, לבצע חור על 1 מ מ קוטר האחורי 0.46 מ"מ ו 0.25 מ"מ לרוחב bregma.</li>
		<li>
fi השתמש ספוגית כותנה נקי סטרילי עם תמיסת מלח פיזיולוגית פתרון כדי לנקות את שברי העצם מפני השטח החשוף של המוח.</li>
		<li>הכנס מזרק מיקרו לתוך המוח, להבטיח כי קצה המזרק המיקרו האחורי 0.46 מ"מ ו 0.25 mm לרוחב כדי bregma, ו- 5.7 מ מ עמוקה מפני השטח של הגולגולת.</li>
		<li>להזריק 500 nL של rAAV (50 nL דקות-1) לתוך SCN, עוזבים את המזרק המיקרו במקום 10 דקות אחרי הזריקה כדי להבטיח פעפוע מוחלט של rAAV.</li>
		<li>לסגת לאט את המזרק-המיקרו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנס את סיב אופטי לתוך אזור SCN.<ol>
<li>באמצעות סכין של סיב אופטי, חתך של סיבים 17 מ מ אורך, מוודא כי בכל צד של סיבים אופטיים היא חלקה.</li>
		<li>להוסיף סיבים אופטיים ferrule קרמיקה ולתקן את סיבים אופטיים ferrule קרמיקה עם חמצן מתיל אתיל קטון (AB דבק), ולהבטיח כי מיושרים המשטחים של סיב אופטי ו ferrule קרמיקה.</li>
		<li>לנקות את הסיבים עם פתרון או אתילן אוקסיד sterilant קר.</li>
		<li>לאחר ההזרקה rAAV (שלב 3.1.11), הכנס את קרמיקה ferrule המכילים סיבים אופטיים SCN.</li>
		<li>לתקן את ferrule קרמיקה ו סיבים אופטיים על גבי הגולגולת באמצעות שרף שיניים ולאפשר להתייבש.</li>
		<li>כתם על פני השרף שיניים עם גב לק. חזור על ההליכים המתוארים 3.1.2 ל 3.2.5, תוך השמטת הזרקה בפועל של rAAV עבור פקד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיפול לאחר ניתוח<ol>
<li>מספקים עכברים עם משככי כאבים לאחר הניתוח, כגון הבופרנורפין 2 מ"ג/ק"ג משקל גוף, subcutaneously, פעמיים ביום.</li>
		<li>הצב עכברים בכלוב התאוששות בזמן שהם באים מתוך הרדמה.</li>
		<li>עכברים בבית בנפרד תחת תנאי/כהה 12 שעות (עוצמת האור ~ 100 לאקס בתחתית הכלוב) עם מזון/מים זמינים ad libitum. שמונה ימים צריכה להקציב לפני עוד ניסויים כדי לאפשר מספיק זמן ההחלמה ולהבטיח ביטוי כתב פלורסצנטיות אופטימלית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in vivo פלורסצנטיות אות ניטור של איסוף נתונים
<ol><li>שמונה ימים לאחר הניתוח, לחבר הסיבים על הראש העכבר הצג האות קרינה פלואורסצנטית (למשל., הצופה ג'ין). בדוק את האות זריחה ב- SCN בקרת עכברים להקים את האות רקע. לנהל את תצפית ומדידה של האות הזה באמצעות קרינה פלואורסצנטית אות צג.</li>
	<li>להעריך את האות זריחה של העכבר ניסיוני עם הפעולה זהה של שליטה בעכבר. הכללת עכברים אשר קיבלו את וקטור ויראלי אבל אשר מציגים רק את האות רקע מניתוח, כי זה סביר מצביע על הקצה של סיבים אופטיים פספסה את SCN. לאחר אותם אמצעים הראשונית להחזיר עכברים לכלובים הביתה עוד 3 שבועות לאפשר את האות פלורסצנטיות לייצב.</li>
	<li>לאחר 3 שבועות, להתחבר העכברים עם הצג האות זריחה. למדוד את פלורסצנטיות 15 s כל 10 דקות, בתדר של 100 הרץ. במהלך המדידות הללו, העכברים הן נעה בחופשיות בכלובים שלהם עם מזון/מים זמינים ad libitum. להשתמש על עוצמת האור בתחתית הכלוב של לאקס ~ 100, ו- a עוצמת הלייזר בקצה של סיבים אופטיים בין 15-20 µW.</li>
	<li>לאחר השלמת כל ההקלטות, perfuse עכברים עם 4% paraformaldehyde, להסיר, לחתוך את המוח כדי לבדוק את המיקום של סיבים אופטיים. אל תכלול עכברים ניתוח אם העצה סיבים אופטיים הוא לא מושתל כראוי ב- SCN.</li>
</ol>5. נתונים ניתוח והצגת
<ol><li>פלורסצנטיות מדידה אות בכל 10 דקות עבור 15 s, בתדר של 100 הרץ, להניב 1500 נקודות נתונים. הממוצע של אלה נקודות 1500 מתרגם לאות פלורסצנטיות בכל נקודת זמן נתונה. התוויית ממוצעים מרובים לאורך זמן מייצרת עקומת האות לעת התואם לקצב תעתיק של Cry1 בתנאי בקרת אור ב- SCN לנוע בחופשיות עכברים.</li>
</ol>

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+not+winding+down%3A+unravelling+circadian+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li>
<li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li>
<li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+preparation%2C+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35055628">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li>
<li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310(2015).</li>
<li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+PER2%3A%3ALUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li>
<li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023(2008).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348(2011).</li>
<li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li>
<li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abrupt+shift+in+the+day%2Fnight+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li>
<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

לעומת שיטות שמחוץ , כגון פרוסה תרבות4,5, RT-PCR16 בחיי עיר הכלאה17, אשר דורשים כי חיות להרוג, ויוו הקלטה בשיטה מאפשר החוקרים ללמוד על ביטוי גנים היממה בחיים. ככזה, טכנולוגיה זו מספקת את היכולת להעריך את השפעת לפליטת פיזיים שונים (למשל, מניעת שינה, מתח, צריכת המזון, וכו ') על השעון היממה עצבית. בניגוד ויוו ביולומינסנציה7,<sup cla...

ביונקים, העל-תצלובתי (SCN) מושלת שעון ביולוגי בכל הגוף לתאם של הפרט בתגובה שינויים סביבתיים אקסוגני (למשל, אור, טמפרטורה, לחץ, וכו ')1. רכיבי שעון הליבה מורכבת Per1-3, Cry1-2, שעוןו- Bmal1, תפקיד מרכזי בוויסות השעון היממה של כל תא. כל תא ב- SCN מכיל activator תעתיק, שעון/BMAL1, אשר משמש heterodimer לזירוז הביטוי של פי ולבכות. פי / מתחם לבכות ואז מעכב את הפונקציה של השעון/BMAL1 ליצירת לולאת משוב תרגום תמלול שלוקח בערך 24 שעות כדי להשלים2,3.
מחקרים קודמים ב- SCN בעיקר המועסקים שמחוץ SCN פרוסה תרבות שיטה4,5,6 , ואילו גישה זו סיפקה מידע רב-ערך, המגבלות יש עכבות היכולת שלנו לקבל נתונים לגבי ההשפעה של אחרים גרעינים במוח ב- SCN, כמו גם השפעת גירויים אקסוגני (למשל, אור) על תאים המתגוררים באזור קריטי זה. בשנת 2001, הקבוצה של היטושי אוקמורה היה הראשון להשתמש למערכת ביולומינסנציה ויוו ביטוי גנים צג שעון היממה SCN במעבר בחופשיות עכברים7. הקבוצה של קן-איצ'י Honma בילה כמה שנים נוספות לפתח את ביולומינסנציה ויוו למערכת ההקלטה ב- SCN8,9,10. יחד, מחקרים אלה סיפקו לחוקרים את היכולת לנטר את שעון היממה בחשכה קבוע או אחרי דופק אור. עם זאת, מכיוון ביולומינסנציה מעומעם מדי כדי לאפשר ניטור רציף במהלך המחזור/כהה, בשילוב עם העובדה כי אור היא האות הדומיננטית הדרושות את entrainment בתיווך SCN של שעונים היממה11, יש הגדלת הביקוש לפיתוח שיטות נסיוניות אשר להתגבר על המגבלות הקשורות ביולומינסנציה הקלטה. הדו ח הנוכחי מתאר מערכת מבוססת פלורסצנטיות, אשר נבנה כדי לנטר את שעון היממה של ה SCN ויוו במעבר בחופשיות עכברים. שיטה זו קלה לשימוש מאפשר ניטור רציף במהלך המחזור/כהה ומאפשר התבוננות שעתוק של גנים שעון היממה SCN בזמן אמת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה לטווח ארוך.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td> <td># 61854</td><td>פלסמיד</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td> <td># 26821</td><td>פלסמיד</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-כפול floxed-hChR2 (H134R) -mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td> <td># 20297</td><td>מגיב</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פלסמיד MluI Thermo Scientific FD0564EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>12566014</td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td> מגיב <td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&nbsp; ומיקרו; מ&nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap עמודות הפרין</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>פילטר צנטריפוגלי אולטרה 4 Amicon</td><td>EMD Millipore</td><td>&nbsp; UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>בנזונאז נוקלאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E1014</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5670</td><td>הכינו פתרון טרי לכל</td></tr><tr><td>מנגנון סטריאוטקסי של עכבר</td> אצווה <td>B& E TEKSYSTEMS בע"מ</td><td>#SR-5M/6M</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>פנטוברביטל</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>עכבר סטריאוטקסי מנגנון</td><td>B& E TEKSYSTEMS בע"מ</td><td>#SR-5M/6M</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>ריאגנט</td></tr><tr><td>סיבים</td><td>אופטיים Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA, &Oslash; 200 ומיקרו; </td></tr><tr><td>משאבת מיקרו-מזרק</td> m <td>מזרק ננוליטר 2000, ציוד WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טבעת קרמית</td><td>שנחאי Fiblaser</td><td></td><td>230&thinsp; &mu; m תעודת זהות, 2.5 מ"מ OD</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>ציוד</td></tr></tbody></table>

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

טכניקה זו משלבת סיב אופטי מתווכת הקלטות זריחה עם מסירה מדויקת של וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים, המבוסס על ג'ין כתבים. חדש, קל לשימוש ויוו פלורסצנטיות ניטור מערכת זו פותחה להקליט את הקצב תעתיק של הגן השעון, Cry1, העל-תצלובתי (SCN) לנוע בחופשיות עכברים. לשם כך, כתב פלורסצנטיות שעתוק Cry1 היה מתוכנן ונארז לתוך וירוס Adeno-הקשורים. מזוכך, מרוכז וירוס היה מוזרק העכבר SCN ואחריו את ההוספה של סיבים אופטיים, שהיה אז מקובע על גבי המשטח של המוח. החיות היו חזר לכלובים הביתה והתירו את תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח חודש להבטיח ביטוי עיתונאי מספיק. קרינה פלואורסצנטית נרשמה ואז לנוע בחופשיות עכברים באמצעות יישום ויוו ניטור המערכת אשר נבנה במוסד שלנו. עבור ה- ויוו למערכת ההקלטה, 488 ננומטר לייזר היה יחד עם 1 × 4 קרן-מפצל זה מחולק האור ארבע יציאות עירור לייזר של כוח שווה. תוכנית התקנה זו אפשרה לנו להקליט מתוך ארבע חיות בו זמנית. כל אחד האותות פלורסצנטיות הנפלט נאסף באמצעות צינור האופטיקה וכרטיס רכישת נתונים. לעומת זאת כדי הקודם ביולומינסנציה ויוו שעון היממה הקלטה הטכניקה, קרינה פלואורסצנטית זה ויוו למערכת ההקלטה מותר את ההקלטה של ביטוי גנים שעון היממה במהלך מחזור אור.

קרינה פלואורסצנטית עיצוב הכתב של Cry1 היה מופע איור 1A. באמצעות הגישה שתוארו לעיל, 500 nL של rAAV-P (Cry1) - intron336 - ונוס-NLS-D2 היה מוזרק בהצלחה SCN עכבר למבוגרים, הציג ונוס חזקים ביטוי (איור 1B, 1c). קרינה פלואורסצנטית אותות שנרשם תחת h 12h 12/כהה (LD) ותנאי כהה/dark (DD) (איור 2) הניב חזקים שעון ביולוגי על שני התנאים. לבסוף, קרינה פלואורסצנטית אות הוקלט בתנאי...

טכנולוגיה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית פיתח ' מאפשר ניטור לטווח ארוך של שעתוק של גנים שעון היממה העל-תצלובתי (SCN) לנוע בחופשיות עכברים בזמן אמת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה.

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

שיטה זו מספקת דרך לנטר את ביטוי הגן של השעון הביולוגי בזמן אמת ברזולוציה זמנית גבוהה בעכברים הנעים בחופשיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פועלת הן בתנאי אור-חושך והן בתנאי חושך-חושך, החשובים ביותר לחקר שעון ביולוגי. בעזרת סכין סיבים אופטיים חותכים סיב באורך 17 מילימטרים.מוודאים שכל צד של הסיב האופטי חלק. הכנס את הסיב האופטי לתוך הטבעת הקרמית וקבע את הסיב האופטי לטבעת קרמית עם מתיל אתיל קטון מי חמצן. הקפדה על כך שמשטחי הסיב האופטי והטבעת הקרמית סמוכים.נקו את הסיב האופטי בעזרת צמר גפן ספוג ב-75% אתנול. ושמור אותו נקי עד שיהיה מוכן להחדרה. התחל את הליך ההזרקה על ידי העמסת חמישה מיקרוליטרים של AAV רקומביננטי לתוך מיקרו-מזרק.לאחר מכן, לאחר הרדמת עכבר בוגר באמצעות פרוטוקול מאושר מוסדי, בדוק אם יש עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר תגובת צביטה בבוהן. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי להסיר פרווה מראש העכבר. ואז הרכיב את ראש העכבר למנגנון סטריאוטקסי.לאחר ביצוע חתך בקרקפת, חשוף את הגולגולת. והתאם את המנגנון הסטריאוטקסי כך שברגמה ולמבדה יהיו באותו מישור אופקי. לאחר מכן השתמש במקלון צמר גפן ספוג במי חמצן 4% ומים, כדי להחליד את המוח.לאחר מכן יש צמר גפן נקי לניקוי וייבוש פני הגולגולת. בעזרת הזרוע הסטריאוטקסית, זהה את אתר הניתוח, 0.46 מילימטר אחורי ו-0.25 מילימטר לרוחב לברגמה. לאחר מכן בעזרת מקד

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הליך של הכנת פרוסות המכיל את עכבר מבוגר ההיפותלמוס גרעין suprachiasmatic (SCN), ודרך מהירה לתרבות רקמת SCN במצב תרבות organotypic, הם דיווחו. יתר על כן, במדידה של הגן oscillatory ביטוי חלבון שעון דינאמי באמצעות כתב הטכנולוגיה בלוציפראז מתואר.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

השעון הביולוגי מווסת כשליש של transcriptome ארבידופסיס, אך אחוז הגנים המזינים בחזרה מדידת זמן נותר עלום. כאן אנו להמחיש שיטה להעריך פנוטיפים יממה במהירות בכל קו מוטציה של ארבידופסיס באמצעות הדמיה זורחת של עיתונאי יממה הביע זמני ב פרוטופלאסט.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה כדי לקבוע סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב מוצג. שיטה זו משתמשת בתרבית של תאים כתב פלסמידים לבטא גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז תחת השליטה של האמרגן ג'ין תקופה 2 . זה ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים כדי להעריך את ההשפעות איבר ספציפי על שעון ביולוגי.

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

לוציפראז מקודדים גנטית הוא עיתונאי לא פולשנית הפופולרי של ביטוי גנים. שימוש לוציפראז האורך אוטומטית הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין) מאפשר הקלטה אורכית מתאי זוהרים תחת מגוון רחב של מצבים. הנה אנחנו מראים איך תנין עשוי לשמש בהקשר של מחקר השעון הביולוגי.

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

מחקר זה מציג אסטרטגיות מבוססות כימוגנטי ואור סגול כדי לאפשר הזזת פאזה צירקדית אמינה ביום.

השראת שינויי פאזה צירקדיים ביום באמצעות גישות כימוגנטיות וספקטרליות

חקור מעקב ביטוי גנים שעון היממה בגרעין הסופרכיאסמטי בעכברים חופשיים באמצעות ניטור פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת מדידות ברזולוציה גבוהה בתנאי אור-חושך וחושך-חושך.

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

גלה סרטונים נוספים