וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

שיטה זו יכולה לקבוע הן את טיטר ה-AV המטוהר והן את הלא-מטוהר ולהעריך את היכולת של AAV AAP לקדם הרכבה של סרוטיפ-קסיס AV קוגנטי והטרולוגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה פשוטה וזולה הנמנעת מהחסרונות של שיטות טיטרציה אחרות של AAV. למרות ששיטה זו שימשה בדרך כלל לכימות וקטור AAV, ניתן ליישם אותה גם כדי לענות על שאלות בסיסיות שונות על ביולוגיה של AAV כפי שמוצג בפרוטוקול זה.

ביום האפס, לאחר תרבית תאי HEK 293 למפגש של 90%, הכינו את מגיב הטרנספקציה על ידי ערבוב הפלסמידים ב-96 מיקרוליטר של PBS ללא סידן או מגנזיום בצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר. כפי שמצוין בטבלה זו, הכמות הכוללת של DNA היא שני מיקרוגרם לבאר. הוסף ארבעה מיקרוליטר של תמיסת PEI לתערובת ה-DNA של הפלסמיד PBS.

הנפח הסופי הוא כ -100 מיקרוליטר או 5% נפח של מדיום התרבות. מערבל את הצינורות לזמן קצר ודוגר את תערובת ה- DNA PEI בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, סובב לזמן קצר את הצינורות במיקרו צנטריפוגה כדי לאסוף את הנוזל לתחתית.

והוסף את תערובת ה- DNA PEI טיפה למדיום התרבות בכל באר של צלחת התרבות HEK 293. לאחר מכן ערבבו בעדינות את הצלחות והחזירו אותן לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. טרנספקציה של תא HEK 293 היא מרכיב קריטי בפרוטוקול זה לייצור וירוסים עם טיטר גבוה.

יש להשתמש בתאים בריאים בעלי מספר מעבר נמוך ולהקפיד לא לשבש את החד-שכבתי של התאים. בימים הראשון והשני, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, התבונן בתאים שעברו טרנספטציה עם פלסמיד PCMVGFP כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה. ביום החמישי, פיפטה את התאים ואת המדיום המכיל וירוס למעלה ולמטה או השתמש במגרד תאים כדי לגרד את כל התאים.

לאחר מכן, העבירו את המתלה לצינורות חרוטיים מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי לשחזר את החלקיקים הנגיפיים, יש להפשיר במהירות את הצינורות הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, מערבל את הצינורות במרץ למשך דקה אחת כדי למקסם את ההתאוששות של AAV מהתאים. גלולה את פסולת התא על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 3, 700 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט מכל צינור לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים עם מכסי בורג לבדיקת כתם הנקודות.

כדי לטפל בדגימות עם אנדונוקלאז Serratia marcescens, הכינו ריאגנטים לערבב A ולערבב B. הוסף 10 מיקרוליטר מכל מגיב לכל צינור דגימה. מערבל את הדגימות למשך חמש שניות וסובב אותן לזמן קצר כדי לאסוף את הנוזל לתחתית הצינורות.

לאחר מכן דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר סיבוב קצר של הדגימות, בצע טיפול בפרוטאינאז K על ידי הכנת מגיב תערובת C והוספת 180 מיקרוליטר לכל צינור. לאחר מכן לאחר מערבולת וסיבוב קצר של הצינורות שוב, דגרו אותם בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר שהדגימות חזרו לטמפרטורת החדר, הוסיפו 200 מיקרוליטר של פנול-כלורופורם ומערבלו את הצינורות למשך דקה אחת. לאחר מכן סובב את הדגימות במיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של 16, 100 פעמים G וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפחות. העבירו 320 מיקרוליטר מהשכבה המימית או 80% מנפח הנוזל המימי לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטנדרטי חדש.

שלב העברה זה חשוב ביותר מכיוון שיש לקחת את אותו נפח מהדגימה כדי לשמור על דיוק לכימות AAV. יש להקפיד להימנע מהשלב האורגני תוך הסרת השכבה המימית. הכן את מגיב התערובת D והוסף 833 מיקרוליטר לכל צינור דגימה.

לאחר מערבולת הצינורות, דגרו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ושטפו את הצינורות פעם אחת על מגבת נייר נקייה. פיפטה כ-500 מיקרוליטר של אתנול 70% לתוך כל צינור ומערבלת את הצינורות למשך חמש שניות.

לאחר סיבוב הדגימות שוב, שפכו את הסופרנטנט וכתמו את הצינורות פעם אחת על מגבת נייר נקייה. לאחר מכן יבש את הכדורים ב-65 מעלות צלזיוס לפני השעיית אותם מחדש במאגר TE. כדי לבצע את בדיקת כתם הנקודות, הכן תקני DNA פלסמיד על ידי דילול DNA פלסמיד גנום וקטורי AAV ל-10 ננוגרם למיקרוליטר במים או במאגר Tris-HCL.

העבירו כמות של 25 מיקרוליטר של ה-DNA המדולל של הפלסמיד לצינור טרי והפכו אותו לליניארי עם אנזים הגבלה מתאים בנפח תגובה של 50 מיקרוליטר למשך שעה. הוסף 450 מיקרוליטר מים או TE לצינור המכיל את תקן ה-DNA של הפלסמיד המעוכל וערבב היטב. לאחר מכן העבירו 70 מיקרוליטר מתערובת זו לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר עם 1,330 מיקרוליטר מים או TE כדי ליצור תקן פלסמיד מדולל.

כדי להגדיר את מנגנון כתם הנקודות, בעזרת מספריים, חותכים את קרום הספיגה לגודל מתאים למספר הדגימות והתקנים. משרים את הממברנה במים למשך 10 דקות לפני שמניחים אותה על מנגנון כתם הנקודות. לאחר מכן, כסו את הבארות שאינן בשימוש.

הוסף מים לבארות שאליהן יוטענו הדגימות. החל ואקום, משוך את המים דרך הבארות, בדוק אם יש שגיאות ואז הדק מחדש את הברגים. בדוק שוב במידת הצורך.

החל 400 מיקרוליטר מכל תקן DNA פלסמיד מדולל על כל באר והפעל ארבעה נתיבים של דילולים סטנדרטיים. השתמש בשתי מכסות נפרדות של התקציר הסטנדרטי וטען כל אחת בשכפול. לאחר מכן יש למרוח 200 מיקרוליטר לבאר של כל דגימת DNA נגיפית.

הפעל ואקום עדין כדי למשוך את תמיסות ה-DNA דרך הבארות. לאחר מכן לאחר שכל הבארות התרוקנו, שחרר את הוואקום על ידי כוונון השסתום התלת-כיווני. הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסת אלקליין X אחת לכל באר.

לאחר מכן המתן חמש דקות לפני החלת הוואקום מחדש כדי לרוקן את הבארות. החל מחדש את הוואקום ופרק את מנגנון כתמי הנקודות. לאחר מכן הסר את הממברנה ושטוף אותה עם שני X SSC.

הנח את הממברנה על מגבת נייר נקייה כשהצד הקשור ל-DNA פונה כלפי מעלה כדי להסיר את המאגר העודף. השתמש בקישור צולב UV מתאים כדי להצליב UV את ה-DNA המוכתם לממברנה. הממברנה מוכנה כעת להכלאה.

הניחו את הממברנה בבקבוק הכלאה כשהצד הקשור ל-DNA כלפי מעלה. שוטפים את הממברנה עם חמישה עד 10 מיליליטר של מאגר הכלאה מחומם מראש וזורקים את המאגר. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של מאגר הכלאה שחומם מראש והכניסו את הבקבוק לתנור הכלאה מסתובב המוגדר ל-65 מעלות צלזיוס.

סובב את הבקבוק למשך חמש דקות לפחות. הוסף במהירות את ה-DNA של הזרע המפורק ואת הבדיקה הרדיואקטיבית למאגר ההכלאה בבקבוק ונער אותו למשך 10 שניות לערבוב. מחזירים את הבקבוק לתנור של 65 מעלות צלזיוס ומדגרים אותו בסיבוב בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות.

לאחר השלמת ההכלאה, הפסק את הסיבוב. הסר את בקבוק ההכלאה ולאחר מכן שפך את תמיסת הבדיקה הרדיואקטיבית לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם מכסה אטם תקע חסין דליפות. כדי לשטוף את הממברנה, הוסף 20 עד 30 מיקרוליטר של מאגר כביסה מחומם מראש לבקבוק ההכלאה וסובב אותו למשך חמש דקות.

חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות. לאחר הכביסה השלישית, הסר את הממברנה מבקבוק ההכלאה, ובעזרת מגבות נייר, הסר את המאגר העודף מהקרום. לאחר מכן הניחו את הממברנה במחזיק נייר פלסטיק שקוף.

בעזרת מונה גייגר, בדוק את האותות הרדיואקטיביים על הממברנה. לאחר חשיפת מסך הדמיית הזרחן שנמחק לממברנה, סרוק את המסך באמצעות מערכת סריקת תמונת זרחן וקבל את הנתונים על עוצמת האות של כל נקודה. בצע ניתוח נתונים על פי פרוטוקול הטקסט.

כתם נקודה כמותי זה עבור טיטרציה וקטורית AAV 2G9 כולל שתי קבוצות של תקנים ושלוש כמויות שונות של תכשיר וקטור AAV, כולל 0.3, 0.1 ו-0.03 מיקרוליטר בשכפול. הסכומים שייבדקו על הכתם נקבעים באופן אמפירי או על סמך בדיקה ראשונית. נקבע על ידי אינטרפולציה כי ל-0.3, 0.1 ו-0.03 מיקרוליטר של וקטור AAV 2G9 היה בממוצע טיטר של 5.16, 0.27 ננוגרם מיקרוליטר שווה ערך.

כל שילובי הסרוטיפ הקוגנטיים וההטרולוגיים האפשריים של חלבוני VP3 cas-pid ו-AAP מ-AAV5, AAV9 ו-AAV נחש הוערכו להרכבת קפסיד על ידי בדיקת כתם נקודה כמותית. תוצאות הגרף הזה מראות ש-AAV5 VP3 מורכב ללא קשר לשאלה אם AAP סופק בטרנס. בנוסף, AAP5 ו-AAP9 יכולים לקדם הרכבת קפסיד AAV9 VP3, אם כי AAP5 מתפקד בצורה פחות יעילה מ-AAP9.

לא AAP5 ולא AAP9 מציגים אסיפה המקדמת פעילות על נחש AAV VP3, ונחש AAP רק מקדם הרכבה של נחש AAV VP3. ניתוח כתמי נקודות יושם כדי להעריך את פעילות הנוקלאז של שלושה נוקלאזות זמינות מסחרית בתנאים לא אופטימליים המכילים זיהומים שמקורם בתא ובתרבית. אנזים A נמצא לא פעיל כמו שני האנזימים האחרים, מה שמראה שבחירת הנוקלאז יכולה להשפיע באופן משמעותי על קריאת בדיקת כתם הנקודות.

טכניקה זו פשוטה לכימות וקטור AAV ומועילה בהערכת תפקידו של AAP בקידום הרכבה של קפסידים AAV שמקורם בסרוטיפים קוגנטיים והטרולוגיים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום אם היא מבוצעת כראוי לאחר קבלת דגימות בדיקה בניסויי תרבית תאים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לזרוק בזהירות את נפח הנוזל הנכון כדי להבטיח דיוק כמותי.

לאחר פיתוחו, היישום של מבחן כתם הנקודות הכמותי לחקר AAP סלל את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של AAV להבין עוד יותר את המנגנון של הרכבת קפסיד AAV. אנא אל תשכח שעבודה עם תאים אנושיים, חומרים ויראליים, פנול-כלורופורם וחומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר. ויש צורך בשימוש במעילי מעבדה, כפפות ומשקפי מגן כדי להגביל את החשיפה.

יש לטפל בחומרים אלה רק באזורים מאושרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות כתמי נקודות לכימות AAV, להקים מנגנון כתמי נקודות, לקבוע טיטר AAV ולהחיל את ההליך לחקר ביולוגיה של AAV. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות כמו מבחני התמרה וקטורית AAV בתאי תרבית כדי לענות על שאלות נוספות, כגון הטיטר הפונקציונלי של וקטור בהשוואה לטיטר החלקיקים הפיזיקלי שנקבע על ידי בדיקת כתמי נקודות.