Name: הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: למד כיצד להקים תרבית עיקרית מרקמת סרקומה רכה שנגזרה מחולה לחקר פיזיולוגיית המחלה ותגובות לטיפול. שיטה זו מספקת מודל פרה-קליני אנושי לבדיקת תרופות ומנגנוני פעולה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות Gráinne טירני לסיוע העריכה.

STS תאים מבודדים בגלל גידול המוני בניתוח טוחנות מחולים עם STS. הפרוטוקול אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית, מתבצע על פי ההנחיות הקלינית טוב את הצהרת הלסינקי. כל המטופלים נתן הסכמה בכתב כדי לקחת חלק במחקר. דגימות כירורגי נותחו על ידי פתולוג מנוסה סרקומה, מעובד בתוך 3 שעות של ניתוח.
1. הגידול הדגימה איסוף ועיבוד:
<ol><li>איסוף דגימות הגידול בעזרת פתולוג סרקומה במיכל 100-מ ל שתן סטרילי עם 50 מ של DMEM גלוקוז נמוך בינוני אטום עם סרט פרפין.</li>
	<li>אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שעות לאחר כריתה הגידול.</li>
	<li>בצע את כל השלבים הבאים תחת כיסוי סטרילי תרביות רקמה.<ol>
<li>לעקר את מכסה המנוע עם 70% אתנול, ללבוש כפפות סטריליות.</li>
		<li>לעקר את הפינצטה inox פלדה עם 70% אתנול (שימוש גזה סטרילי).</li>
		<li>להסיר את הסרט פרפין מהגורם שתן וזורקים.</li>
		<li>רחץ החיצוני של המיכל שתן עם 70% אתנול.</li>
		<li>פתח את צלחת פטרי מרובע.</li>
		<li>פתח את מיכל שתן, העברת דגימות הגידול לתוך הפטרי ריבוע באמצעות את הפינצטה סטיריליים inox פלדה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את דגימות הגידול עם PBS פעמיים.</li>
	<li>פתח את אזמל כירורגי סטרילי.<ol>
<li>דק לגרוס את דגימות הגידול לחתיכות3 1-2 מ מ.</li>
		<li>לאסוף מטבע אחד של המדגם הכולל צינור 2-mL.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט trizol (רכש) אל הצינור ומקפיאים מיד ב-80 מעלות צלזיוס (לדוגמה ישמש בניתוח במורד הזרם עבור הערכת ביטוי גנים STS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף את שארית החומר הגידול מגורר דק בשפופרת 15-mL.<ol>
<li>להוסיף 4 מ של collagenase מסוג I פתרון (סוג collagenase הוא מומס הציבורית, על ריכוז של µg 4/mL).</li>
		<li>לדלל את collagenase מסוג I פתרון עם 4 מ"ל של מדיה תרבות גבוהה DMEM (הריכוז הסופי של סוג collagenase הוא 2 µg/mL).</li>
		<li>סגור את הצינור 15-mL, חותם עם הסרט פרפין.</li>
		<li>שמכניסים את נקז 15-mL ב שייקר מתגלגל באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים מלהיב למשך 15 דקות להפעיל את מערכת העיכול.</li>
		<li>לאחר 15 דקות לאחסן את הצינור ניעור מתגלגל תחת זע תנאים בטמפרטורת החדר למשך הלילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחרת היום שמכניסים את נקז 15-mL מתחת למכסה המנוע סטרילי.</li>
	<li>בעדינות לסנן התליה תא דרך מסנן סטרילי 100 מיקרומטר מחוברת לחלק העליון של צינור 50-mL.</li>
	<li>לשטוף את המסנן עם DMEM מדיה תרבות גבוהה עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
	<li>למחוק את המסנן סטרילי 100 מיקרומטר, לסגור את שפופרת 50-mL ואת צנטריפוגה ב 225 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך ברכבת התחתית.</li>
	<li>מחדש להשעות את התאים עם 1-2 מ ל DMEM גבוהה תרבות המדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. הערה: אמצעי האחסון תלוי כמות הדגימה הגידול מעובד.</li>
	<li>לספור את התאים עם תא Neubauer.<ol>
<li>לדלל את דוגמה 1:2 ב- trypan blue ולהשתמש µL 10 של הדילול לספור תאים.</li>
		<li>לספור לפחות פעמיים, לחשב את הממוצע של משכפל לדעת המספר הממוצע הכולל של התאים שנאספו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צלחת תאים בתרבות טפט רגיל-צפיפות של תאים/cm 80,0002. הערה: תמיד לכלול פקדים בניסויים. לבצע לפחות 3 משכפל טכני עבור כל תנאי. לבצע לפחות 2 משכפל ביולוגי. פרמקולוגיה פרה, ביטוי גנים, חלבונים ביטוי ניתוחים, ניסויים צריכה להתבצע עם מספר נמוך של תרבות קטעים בתוך 30-45 ימים של התא seeding כדי להימנע מאובדן סרטן התא פנוטיפים.</li>
	<li>הכנת הדוגמא cytological.<ol>
<li>לאסוף 100,000 בתאים µL 200 של מדיה תרבות גבוהה DMEM עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
		<li>פיפטה הפתרון (פיפטה µL 200) לתוך משפך חד פעמיות מאובזרים עם מסנן, רכוב עם זכוכית.</li>
		<li>פתח את cytocentrifuge והכנס את הדגימות.</li>
		<li>הפעל את cytocentrifuge ב g x 18.6 כעשרים דקות.</li>
		<li>למחוק את המשפך מצויד במסנן.</li>
		<li>לתקן את השקופיות אצטון 10 דקות ולאחריו כלורופורם במשך 5 דקות.</li>
		<li>לאחסן את השקופיות ב-20 ° C. הערה: להפשיר, מימה הדגימות לפני צביעת ולבצע ההכתמה ההוראות של היצרן. להכין משכפל טכנית לפחות 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. תרביות תאים STS:
<ol><li>לשנות מדיה פעם בשבוע (DMEM גבוהה תרבות מדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין).<ol>
<li>למחוק את המדיום תרבות באמצעות פיפטה µL 200-1, 000.</li>
		<li>הוסף חדש בינוני טריים באמצעות פיפטה µL 200-1, 000.</li>
		<li>תא המעבר:<ol>
<li>ניתוק התאים בעת המפגש נמצא במרחק של-90%: הערה: STS תא תרבות הגברה צריכה להתבצע אחת לשבוע על בסיס התנאים תרבות.</li>
			<li>למחוק בינוני, לשטוף עם PBS ולהוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין 1 x ב- PBS הערה: הנפח של טריפסין בשימוש תלוי כמות תאים בתרבית שהושג.</li>
			<li>דגירה תאים למשך 3-5 דקות ב 37 º C.</li>
			<li>איסוף תאים מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה µL 200-1, 000.</li>
			<li>Pipette התאים מנותקת לתוך צינור 15-mL ולהוסיף 4 מ"ל של מדיה תרבות גבוהה DMEM עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין לעצור את התגובה אנזימטיות.</li>
			<li>צנטריפוגה-g x 225 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>למחוק את תגובת שיקוע.</li>
			<li>מחדש להשעות בגדר תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיה תרבות גבוהה DMEM עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
			<li>זרע התאים צלחת תרבות חדשה או בקבוקון עם נפח סופי על פי הוראות היצרן. הערה: לא לפצל תאים יותר מ- 1:3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. במורד הזרם ניתוחים:
הערה: מגוון ניסויים שונים יכול להתבצע בעזרת המודל (ראו להלן). לכן, חשוב להחליט במהלך שלב העיצוב של המחקר ניתוחים אשר יבוצעו כך ניתן להכין מספר דוגמאות ומשוכפלת.
<ol><li>התפשטות מבחני כגון MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד</li>
	<li>מבחני אפופטוטיים להיפגע כגון מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז (TdT) ניק סוף תיוג assay (TUNEL)</li>
	<li>ניתוח Immunohistochemical</li>
	<li>ניתוח ביטוי גנטי</li>
	<li>ניתוח תספיג חלבון</li>
	<li>אליסה assay</li>
	<li>תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח</li>
	<li>
In vivo דגם xenograft</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+treatment+of+soft-tissue+sarcoma+gold+standard+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).</li>
<li>Fletcher, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+classification+of+soft+tissue+tumours+-+an+update+based+on+the+new+2013+WHO+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification.</a> Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).</li>
<li>De Vita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+classification%2C+treatment+options%2C+and+new+perspectives+in+the+management+of+adipocytic+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas.</a> Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).</li>
<li>Recine, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+role+of+trabectedin+in+the+treatment+of+intractable+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas.</a> Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).</li>
<li>Ducimetière, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+sarcoma+histotypes+and+molecular+subtypes+in+a+prospective+epidemiological+study+with+central+pathology+review+and+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing.</a> PLoS One. 6 (8), 20294(2011).</li>
<li>Nussbaum, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lanonc/article/PIIS1470-2045(16)30050-X/abstract">Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database.</a> Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).</li>
<li>The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+tissue+and+visceral+sarcomas%3A+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).</li>
<li>Paul, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Cell+in+Vitro%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Cancer Cell in Vitro: A Review.</a> Cancer Research. 22, 431-440 (1962).</li>
<li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).</li>
<li>Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+human+prostate+tissue+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development.</a> Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).</li>
<li>Vannucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+as+an+Active+Player+in+the+Development+of+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).</li>
<li>De Vita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Eribulin+in+a+Primary+Culture+of+Well-Differentiated%2FDedifferentiated+Adipocytic+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma.</a> Molecules. 3 (12), 1662(2016).</li>
<li>Failli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+culturing+human+colorectal+tumor+cells%3A+establishment+of+a+cell+culture+model+by+the+comparison+of+different+methodological+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches.</a> Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).</li>
<li>Steinstraesser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+primary+human+sarcoma+model+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice.</a> Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).</li>
<li>Raouf, A., Sun, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+to+culture+primary+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells.</a> Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).</li>
<li>Daigeler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+in+vitro+effects+of+doxorubicin+on+gene+expression+in+primary+human+liposarcoma+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures.</a> BMC Cancer. 29, 313(2008).</li>
<li>Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+publicly+available+sarcoma+cell+lines+for+use+in+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).</li>
<li>Liverani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+approaches+to+establish+and+characterize+primary+cultures%3A+an+ex+vivo.+3D+system+and+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model.</a> Biol Open. 15 (2), 309(2017).</li>
<li>De Vita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxofibrosarcoma+primary+cultures%3A+molecular+and+pharmacological+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile.</a> Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).</li>
<li>Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoma+in+2016%3A+Evolving+biological+understanding+and+treatment+of+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas.</a> Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).</li>
<li>Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+culture+of+primary+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective cell culture of primary breast carcinoma.</a> Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).</li>
<li>Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+primary+culture+of+human+ovarian+cancer+cells+to+chemotherapy%3A+In+vitro+individualized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy.</a> J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).</li>
<li>Ravi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+Tumorigenesis+of+a+Murine+Sarcoma+Cell+Line+in+the+Absence+of+DICER1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1.</a> Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).</li>
<li>Zhong, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+vegf+gene+knockdown+on+growth+of+the+murine+sarcoma+cell+line+MS-K%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K.</a> Cells. 16 (6), 625-638 (2011).</li>
<li>Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+Inhibits+Cell+Proliferation+and+Reduces+the+Motile+Potential+of+Murine+LM8+Osteosarcoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells.</a> Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).</li>
<li>Sugiyasu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radio-sensitization+of+the+murine+osteosarcoma+cell+line+LM8+with+parthenolide%2C+a+naturalinhibitor+of+NF-%CE%BAB%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB.</a> Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).</li>
<li>Daigeler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+in+vitro+effects+of+doxorubicin+on+gene+expression+in+primary+human+liposarcoma+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures.</a> BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

במודלים פרה מוגדרת היטב יש צורך להבהיר את הרקע מולקולרית של גידולים, לנבא פרוגנוזה ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לחולי סרטן. זה חשוב במיוחד עבור גידולים נדירים כגון STS של מי הטרוגניות גבוה במונחים של מורפולוגיה, התנהגות תוקפנית פוטנציאליים, ומחקרים קליניים אתגרים ההבנה שלנו של STS ביולוגיה וניהול החולה21. יתר על כן, סרקומה מסחרי תא מהשורות זמין מגביל פרה חקירות קבוצת גידולים mesenchymal18. Ex-vivo דגמים מייצגים ובכך משאב יקר ערך מחקר על STS. פיתחנו מודל אנושית לח...

סרקומות של רקמות רכות (STS) כוללים קשת של נגעים הטרוגנית של המקור mesenchymal חשבונאות 1% של גידולים מוצקים כל1,2, סיווג חדש ארגון הבריאות העולמי מזהה הנוכחות של יותר מ 50 תת שונים3. בקרב אלו, histotypes הנפוצות ביותר הן adipocyte סרקומה או liposarcoma leiomyosarcoma, והיוו 15% ו- 11% של כל הבוגרים STS, בהתאמה4,5. למרות STS יכולים לפתח בחלקים שונים של הגוף, הגפיים ואת מקבץ הם האתרים הנפוצים ביותר, המתרחשים 60% ו-20% מהמקרים, בהתאמה6.
אבן הפינה של הטיפול למחלה מקומית היא כריתה כירורגית רחבה, בעוד היתרונות של טיפול כימותרפי אדג'וונט ו neoadjuvant עדיין אינם ברורים והם נחשבים רק במקרים נבחרים7. בהגדרה גרורתי, טיפול כימותרפי סטנדרטי של טיפול אבל מראה תוצאות מוגבלות8. הבנה טובה יותר של הביולוגיה המולקולרית של STS יעזור לשפר את האבחנה המבדלת הנוכחי, למטב את הטיפולים, ולזהות יעדים חדשים לטיפול.
בהקשר זה, בוצע מחקר לתוך סרטן במשך שנים רבות באמצעות תא מונצחים קווים9. מודלים ניסיוניים אלה הם בדרך כלל תרבותי ב טפט סטנדרטי תומך או מושתל לתוך מכרסמים immunodeficient להקים ויוו xenograft מודלים10. שורות תאים מונצחים מייצגים חומר לניהול, קל-אל-חנות שבה ניתן לבצע מספר מספיק של מחקרים. הם, למעשה, לפחות יקר, בשימוש נרחב ביותר כלי לימודי פרה11.
עם זאת, תא-קו המבוסס על סרטן הדגמים גם יש כמה מגבלות, למשל ממושך תרבות במערכת חד שכבתי עם מספר גדל והולך של מעברים מעניקה פנוטיפי, סחף גנטי, יצירת תאים פחות סביר כדי לסכם הגידול מפתח תכונות. יתר על כן, תרביות תאים קו להיכשל לשחזר את האינטראקציה לתא ואת crosstalk מולקולת איתות לחקות את התנהגות ביולוגית של גידולים, לאפיין את microenvironment הגידול. נושאים אלה מהווים את הבסיס של הפער הקיים בין תוצאות קליניות12.
לאור האמור לעיל, הריבית בתרבויות העיקרי נגזר החולה גדל13. אכן, הכריתה של רקמות ממאירות ונורמלי מפחיתה את הסיכון לאבד סרטן התא פנוטיפ והטרוגניות, ובכך מציע חומר המוצא זה נציג נוסף של microenvironment הגידול. יתר על כן, השימוש של דגימות הגידול טריים שנקטפו חולים שעברו כריתה כירורגית מאפשרת לנו לחקור גידולים יחיד וכדי להשוות נגעים שונים מאותו חלק של הגוף של המטופל14. מהסיבות הנ ל, תרביות תאים רקמות-derived לספק חומר יקר ללמוד הגידול פתופסיולוגיה ו פרמקולוגיה15,16,17, בפרט STS אילו שורות תאים סרקומה זמינים מסחרית זה מוגבל18 אנחנו ובכך אופטימיזציה שיטה להקים נגזר החולה STS התא הראשי תרבות החל בניתוח נכרת גידול רקמות13,19,20. השיטה שלנו מורכב disaggregating הדגימה הגידול לחלקים קטנים רקמות ואחריו דיסוציאציה רקמות אנזימטי לילה כדי לקבל השעיה תא בודד. למחרת, עיכול אנזימטי מופסקת על-ידי הוספת מדיה תרבות טריים, ההשעיה שהושג מסונן כדי להסיר שברי רקמת, תא-אגרגטים, ואת החומר מטריקס עודף או פסולת. לבסוף, שבריר של תאים סרטניים מבודד הוא cytospinned על גבי זכוכית שקופיות, קבוע ומאוחסן לניתוח במורד הזרם, שמטרתם לאשר הקמת תרבות ראשי STS מאת cytomorphological, immunohistochemical והערכה cytogenetic מולקולרית (למשל דגים ניתוח של הגברה MDM2 מייצג את האבחנה המבדלת סטנדרטית של liposarcoma היטב הבדיל, את liposarcoma dedifferentiated) 4. התאים הנותרים הם נזרע בתרבות טפט רגיל עבור ג'ין ביטוי מחקרים פרופיל תרופתי. כל הניסויים מתבצעים באמצעות נמוך המעבר תרבויות הראשי כדי למנוע את מבחר subclones סרטן ספציפיים, נותחו על ידי פתולוג מנוסה סרקומה. לכן יצרנו אנושית לחלוטין STS לשעבר-vivo דגם13,19,20. זה רב תכליתי, קל ידית דגם יכול לייצג כלי שימושי עבור סוגים שונים של מחקר פרה, למשל כדי לזהות סמנים מולקולריים חדשים עבור האבחנה והפרוגנוזה או כדי להרוויח הבנה עמוקה יותר של הפעילות ואת מנגנוני פעולה של סמים חדשים ואיכותיים המשמשים את הניהול של STS.

<table><tbody><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה</td><td>EuroClone</td><td>ECB7501L</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180D</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד 4% תמיסה מימית,</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> בדרגה EM <td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין פניצילין</td><td>ג'יבקו</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט טריאזול</td><td>Ambion Life-Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>EuroClone</td><td>ECB3052D</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

סרקומות של רקמות רכות (STS) מייצגים קשת של ממאירות הטרוגנית עם האבחנה קשה, סיווג, ניהול. עד כה, זוהו יותר מ-50 סוגי היסטולוגית של אלו גידולים נדירים מוצק. לכן, בשל מגוון עצום שלהם שכיחות נמוכה, ההבנה שלנו של הביולוגיה של גידולים אלה הוא עדיין מוגבל. החולה-derived תרבויות מייצגים הפלטפורמה האידיאלית ללמוד פתופסיולוגיה STS ו פרמקולוגיה. לכן פיתחנו מודל פרה האנושי של STS החל מדגימות הגידול שנקטפו חולים שעברו כריתה כירורגית. תרביות תאים STS נגזר המטופל המתקבל דגימות כירורגי על ידי collagenase עיכול, מבודדת על ידי סינון. תאים היו נספרים, נזרע, השאירו למשך 14 ימים בתרבויות טפט רגיל, ואז שעובדו על-ידי ניתוח במורד הזרם. לפני ביצוע ניתוחים מולקולריים או תרופות, אושרה הקמת תרבויות העיקרי STS דרך ההערכה של תכונות cytomorphologic, כאשר היא זמינה, סמנים immunohistochemical. שיטה זו מייצגת כלי שימושי 1) ללמוד את ההיסטוריה הטבעית של ממאירות לקוי בחנו אלה ו 2) כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שונות במאמץ כדי ללמוד עוד אודות מנגנוני הפעולה שלהם.

תיכננו שיטה פשוטה כדי להשיג את הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה ולדווח כאן דוגמה של התוצאות המתקבלות על אחד ספציפי STS histotype13. הפרוטוקול שימש להקמת העיקרי תרבויות שונות histotypes STS כולל היטב הבדיל liposarcoma, dedifferentiated liposarcoma, myxoid liposarcoma, pleomorphic liposarcoma, myxofibrosarcoma, מובחן fibromatosis סרקומה, העיקר desmoid pleomorphic.
שיעור ההצלחה של הק...

פרוטוקול הבאים מתמקד הקמת תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה (STS). מודל זה יכול לעזור לנו להבין טוב יותר את רקע מולקולרי ופרופיל תרופתי של ממאירות נדירים אלה, שעשוי לייצג נקודת התחלה עבור מחקרי המשך שמטרתם לשפר את ניהול STS.

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

המטרה הכוללת של מודל פרה-קליני אנושי זה הנגזר מרקמת גידול שנכרתה בניתוח היא להשיג הקמת תרבית ראשונית של סרקומה של רקמות רכות שמקורן בחולה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הפתופיזיולוגיה של סרקומה של רקמות רכות והיא מייצגת כלי פרה-קליני חשוב לחיזוי תגובה לטיפול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במודל פרה-קליני אנושי לחלוטין.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרקומה של רקמות רכות מכיוון שניתן לבדוק את המודל הפרה-קליני הזה עם תרופות חדשניות קונבנציונליות כדי לחקור את פעילותן ומנגנון הפעולה שלהן. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סרקומה של רקמות רכות, ניתן ליישם אותה גם לחקר האינטראקציה בין תאי רקמה רכה של תאים סרטניים. אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל ההטרוגניות של רקמות הגידול ובבידוד תאי הגידול.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהבחירה הראשונית של תאי סרקומה של רקמות רכות ושלבי CD דורשים כמות של ניסיון לפני שניתן להשיג מיומנות. יש לקבל דגימות גידול במיכל שתן סטרילי של 100 מיליליטר עם 50 מיליליטר של מדיום גלוקוז נמוך DMEM אטום בסרט פרפין. ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לכל היותר לאחר כריתת הגידול.עקר את מכסה המנוע של תרבית הרקמה עם 70% אתנול ועיקר פינצטה INOX מפלדה עם 70% אתנול. הסר את סרט הפרפין ממיכל השתן והשליך. נקה את החלק החיצוני של מיכל השתן עם אתנול 70%.פתחו צלחת פטרי מרובעת, ואז פתחו את מיכל השתן והשתמשו בפינצטה הפלדה המעוקרת של INOX כדי להעביר את דגימות הגידול לתוך הצלחת. הוסף PBS ושטוף את דגימת הגידול פעמיים. לאחר הכביסה, גרוס דק את דגימת הגידול לחתיכות בגודל של מילימטר עד שניים.העבירו רבע מהדגימה הכוללת לצינור של שני מיליליטר. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מגיב TRIzol לצינור והקפיא מיד במינוס 80 מעלות צלזיוס. אוספים את שאר חומר הגידול הגרוס דק בשפופרת של 15 מיליליטר ומוסיפים ארבעה מיליליטר של תמיסת קולגנאז מסוג 1.לאחר מכן יש לדלל את תמיסת הקולגנאז מסוג אחד עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית, לסגור את הצינור ולאטום בניילון פרפין. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס על שייקר מתגלגל למשך 15 דקות להפעלת העיכול. לאחר 15 דקות, הניחו את הצינור עם השייקר המתגלגל בטמפרטורת החדר והשאירו אותו למשך הלילה.למחרת, סנן בעדינות את מתלה התאים דרך מסנן סטרילי של 100 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את המסנן במדיום תרבית וצנטריפוגה את המסנן ב -225 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצינור והשעו מחדש את התאים עם מיליליטר אחד עד שניים של מדיום תרבית.לאחר ביצוע ספירת תאים וחישוב מספר התא, צלחת התאים בתרבית חד-שכבתית סטנדרטית בצפיפות של 80,000 תאים לסנטימטר מרובע. להכנת דגימה ציטולוגית, התחל באיסוף 100,000 תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית. הכניסו את התמיסה למשפך חד פעמי המצויד בפילטר ומותקן במגלשת זכוכית.פתח את הציטוצנטריפוגה והכנס את הדגימות. לאחר ציטוצנטריפוגה, השליכו את המשפך המצויד במסנן. לאחר מכן תקן את השקופית באצטון למשך 10 דקות, ואחריה כלורופורם למשך חמש דקות.מעבר תאי STS כאשר המפגש הוא בסביבות 90% לאחר שטיפת יריעת התא עם PBS, הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של 1X טריפסין ב-PBS ודגירה במשך שלוש עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה של 200 עד 1,000 מיקרוליטר כדי לאסוף את התאים המנותקים ולהעביר לצינור של 15 מיליליטר. הוסף ארבעה מיליליטר מדיום כדי לעצור את התגובה האנזימטית.ואז צנטריפוגה ב 225 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום וזרעו את התאים לתוך צלחת תרבית חדשה או בקבוקון. תאי גידול בודדו מליפוסרקומה שהוסרה בניתוח מחולה בן 54.הכלאה פלואורסצנטית באתרה בוצעה כדי לזהות הגברה של MDM2 בדגימת רקמת המטופל. ניתוח ציטולוגי של הגברת MDM2 בתאי גידול מבודדים מאשר הקמת תרבית ראשונית שמקורה בחולה. שינויים מורפולוגיים מהבסיס נגרמו כאשר תרביות טופלו באיפוספמיד, אפירוביצין, איפוספמיד ואפירוביצין, טרבקטדין ואריבולין.שלושה שכפולים עצמאיים בוצעו עבור כל ניסוי כדאיות. התוצאות אישרו את רגישות התרביות לכימותרפיה. הטיפול הפעיל ביותר היה שילוב של Ifosfamide ו-Epirubicin, טיפול קו ראשון המשמש ב-ALT-DDLPS מתקדם או גרורתי.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 15-16 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לגרוס דק את דגימת הגידול. לאחר הליך זה, ניתן לבצע מגוון ניתוחים במורד הזרם, כולל פרופיל ביטוי גנים, ניתוח אימונוהיסטוכימי או בדיקת ציטוטוקסיות על מנת לענות על שאלות נוספות על ביולוגיה של סרקומה של רקמות רכות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום סרקומה של רקמות רכות לחקור את ההיסטוריה הטבעית של ממאירויות אלה שנחקרו בצורה גרועה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים תרבית ראשונית של סרקומה של רקמות רכות שמקורן במטופל. אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות ותרופות עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת כפפות ועבודה עם מכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.

establishment-primary-culture-patient-derived-soft-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד...

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

שיווי המשקל schwannomas (VSS) הם גידולים לא ממאירים ממוצא שוואן תא (SC), הקשורים עם מוטציות בגן המדכא גידולי NF2. אנו מדווחים על פרוטוקול לשחזור, יעיל לאנושי ראשוני VS תרבית תאים המאפשר מניפולציה ניסויית מולקולרית ותאית וניתוח ומשחזר את האופי הטרוגנית של מחלות בבני אדם.

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

מתואר פרוטוקול לחילוץ תאים אנושיים ראשוניים מגידול כירורגי במעי הגס ורקמות תקינות. לאחר מכן התאים המבודדים מתורבתים על מצעים אלסטיים רכים (הידרוג'לים פוליאקרילאמיד) המתפקדים על ידי חלבון מטריצה חוץ-תאי, ומשובצים במיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים. ציטומטריית מתיחה מבוצעת כדי להעריך מתחי התכווצות תאים.

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

הנוכחות של תאי גזע סרטניים (CSCS) ב סרקומות עצם נקשר לאחרונה בפתוגנזה שלהם. במאמר זה, אנו מציגים את הבידוד של CSCS מתרבויות תא ראשוניים המתקבלות ביופסיות אדם של אוסטאוסרקומה קונבנציונלי (OS) באמצעות היכולת של CSCS לגדול בתנאי nonadherent.

הקמת סרטן גזע תא תרבויות מן האדם הקונבנציונלי אוסטאוסרקומה

אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד של תאים מתחילים הגידול מחולה סרקומה האדם נגזר xenografts תלי על ידי מיון מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית, באמצעות אנטיגן לוקיציט אנושי-1 (HLA-1) כסמן שלילי, ועל אימות נוסף האפיון של התאים האלה HLA-1-שלילי גידול מתחיל.

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל העכבר של כריתת כירורגית לא הושלמה של סרקומה של רקמה רכה עבור בדיקות (ניאו) שדון טיפולים.

מודל עכבר של Insected רקמה רכה לחלוטין סרקומה עבור בדיקה (ניאו) שפיטה טיפולים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

מאמר זה מספק מדריך הדרגתי לביסוס תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן באמצעות שיטת תרבית explant ואפיון תאים אלה בהתבסס על הנחיות ICSCRT. התאים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיחשב כתאי גזע מזנכימליים ליישומים נוספים.

תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן

אורגנואידים סרטניים חוללו מהפכה בחקר הסרטן ובגישה לרפואה מותאמת אישית. הם מייצגים מודל גידול רלוונטי מבחינה קלינית המאפשר לחוקרים להישאר צעד אחד לפני הגידול במרפאה. פרוטוקול זה מבסס אורגנואידים סרטניים מדגימות טריות של רקמת גידול בלבלב וקסנוגרפטים שמקורם באדנוקרצינומה של הלבלב.

הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים מגידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

הפרוטוקול מתאר שיטה ליצירת מודל אורגנואיד של סרטן המעי הגס (CRC) שמקורו בחולה בתרבית משותפת עם לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) כדי לחקור את האינטראקציות והפוטנציאל הטיפולי שלהם. מודל זה מספק פלטפורמה פרה-קלינית לחקר תגובות חיסוניות במיקרו-סביבת הגידול ולניבוי היעילות של טיפול מבוסס TIL לטיפול מותאם אישית ב-CRC.

הקמת מערכת תרבית משותפת של אורגנואידים של גידול המעי הגס שמקורם בחולה ולימפוציטים חודרים לגידול (TILs)

למד כיצד להקים תרבית עיקרית מרקמת סרקומה רכה שנגזרה מחולה לחקר פיזיולוגיית המחלה ותגובות לטיפול. שיטה זו מספקת מודל פרה-קליני אנושי לבדיקת תרופות ומנגנוני פעולה.

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

גלה סרטונים נוספים