ופשוט נמוכים Assay למדידת Ambulation במודלים של העכבר של ניוון
29 בדצמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר מערכת גמישה, בעלות נמוכה למדידת העכבר ambulation ב assay פעילות שדה פתוח. אנו מראים כי וזמינותו 6 דקות ambulation מבוסס על מערכת זו מזהה ירידה בהיקף התנועה הרצונית בעכברים mdx , במדויק מבדיל שיפור חילוץ שרירים ספציפיים של חיות אלו.
המטרה הכוללת של בדיקה זו היא למדוד אמבולציה מרצון במודלים של עכברים של ניוון שרירים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ניוון השרירים לגבי התקדמות חולשת השרירים במודלים של ניוון שרירים בעכברים, ויעילותם של טיפולים פוטנציאליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מדידה לא פולשנית וניתנת לשחזור של פעילות בעלי חיים שניתן להתאים בקלות למסגרות מחקר רבות ושונות.
בחדר שקט עם בקרת טמפרטורה בשעה קבועה ביום, הנח מצלמה על רשת תיל מעל תא הפעילות כדי לאפשר הקלטה על פני הזירה המלאה ונקה את החדר עם חומר חיטוי. מיד לפני הקלטת הפעילות, אפשר לעכבר לאחוז במוט המוט של מד כוח דיגיטלי ולמשוך בעדינות לאחור עד לשחרור מוט המוט. רשום את מתח השיא בניוטון עבור כל ניסוי.
עם דקה אחת של מנוחה בין ניסיונות. מיד לאחר בדיקת חוזק האחיזה, הנח את העכבר בתא והתחל את הקלטת הווידאו, מה שמאפשר לעכבר לחקור בחופשיות. לאחר שש דקות עצרו את ההקלטה והחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.
למעקב אחר ניתוח נתוני הווידאו, פתח תחילה את ההקלטה בתוכנת עריכת הווידאו המתאימה, והגדר את המהירות לפעמיים. ייצא את הסרטון שהושמד בפורמט קובץ mp4 לניתוח מעקב, ופתח את הסרטון בתוכנית ניתוח הווידאו המתאימה. כדי להגדיר את הכיול להקלטת הווידאו, השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו לאורך צד אחד של החדר.
לחץ לחיצה ימנית על הקו, בחר כיול מידה והזן את הגודל האמיתי של צד החדר בסנטימטרים. כדי להתחיל במעקב אוטומטי למחצה אחר מיקום העכבר, לחץ על סמן ההזזה. החל מהפריים הראשוני בסרטון, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הנקודה שיש לעקוב אחריה.
נקודת המעקב תסומן בעיגול כחול. השתמש/י בחץ ימינה במקלדת כדי לקדם את המסגרת. נקודת המעקב צריכה לנוע אוטומטית על סמך מיקום בסיס הזנב.
אם מיקום המעקב אינו מיושר לנקודת העניין במסגרת נתונה, יישר ידנית את העיגול הכחול למיקום המעקב. לאחר מעקב אחר הסרטון כולו, שמור את הסרטון ואת שכבת-העל של המעקב ובחר ייצוא לגיליון אלקטרוני כדי לייצא את נתוני המיקום של המעקב. בהתאם לתוצאות שדווחו מבדיקות דומות, עכברי mdx אפס דיסטרופין שאותגרו עם פרוטוקול פעילות גופנית מיד לפני הבדיקה, מפגינים פחות תנועה רצונית באופן משמעותי במבחן שדה פתוח של שש דקות, מאשר חיות בר.
ואכן, לאחר מאמץ קל של אתגר כוח אחיזה, עכברי ה-mdx נשארו בדרך כלל דוממים בדקות הראשונות של פרוטוקול האמבולציה, עם עלייה צנועה בתנועה בדקות ארבע עד חמש. עם זאת, כאשר משווים חיות מסוג בר ו-mdx ללא אתגר פעילות גופנית, לא מתגלים הבדלים במרחק הנסיעה. לא ניתן להבחין בין עכברי Mdx טרנסגניים לביטוי אוטרופין לבין חיות בר ללא הבדלים משמעותיים במרחק הכולל שנסע, או בכל אחת מנקודות הזמן המצטברות שנצפו.
כדי לקבוע את ההשפעה של הפחתת קצב הדגימה, נמדד המרחק הכולל שנסע מדקה אחת של וידאו בקצב פריימים מלא, והושווה למדידות המרחק שנגזרו מגרסאות שנדגמו למטה של מערך הנתונים. הפחתת קצב הפריימים בחצי הפחיתה את המרחק הנמדד ב-5% מהמרחק המקורי שחושב. הדיוק של המרחק הנמדד יורד בחדות לאחר נקודה זו, אם כי אפילו מערכי נתונים מושמדים מאוד עדיין מתקרבים לנתיב החיה, מה שמדגיש את החשיבות של התחשבות בקצב הפריימים ועיבוד האותות בהערכת פעילות בעלי החיים, ומדגים שניתן לשמור על רזולוציה מרחבית גבוהה בנתוני וידאו שנדגמו.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקליט ולנתח אמבולציה של עכבר בסביבת שדה פתוח. לאחר שליטה, ניתן להשלים ניתוח זה תוך 15 עד 30 דקות אם הוא מבוצע כראוי. בדיקה זולה ולא פולשנית זו מאפשרת לחוקרים לבחון פעילות מוטורית במודלים של עכברים של ניוון שרירים, ויכולה לשמש כצעד ראשון אינפורמטיבי למדידות תפקודיות נוספות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מערכת גמישה וזולה למדידת ניידות של עכברים בבדיקת פעילות בשטח פתוח (open field activity assay). השיטה מספקת מדידה לא פולשנית וניתנת לשחזור של פעילות בעלי חיים, אשר ניתנת להתאמה למסגרות מחקר שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחקר על דיסטרופיה שרירית
- ניתוח התנהגותי
רקע
- הבדיקה מודדת הליכה רצונית במודלים של עכברים עם דיסטרופיה של השרירים.
- היא נותנת מענה לשאלות מפתח הנוגעות להתקדמות חולשת השרירים.
- הטכניקה נועדה להעריך את היעילות של טיפולים פוטנציאליים.
- ההקלטה מתבצעת בסביבה מבוקרת כדי להבטיח עקביות.
מטרת המחקר
- למדידת תנועה רצונית בעכברי mdx.
- להערכת ההשפעה של התערבויות ספציפיות לשריר.
- לספק תובנות לגבי התקדמות הדיסקלפיה השרירית (muscular dystrophy).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במצלמה הממוקמת מעל תא הפעילות לצורך הקלטה.
- ניקוי התא בחומר חיטוי לפני הניסויים.
- מתן אפשרות לעכבר להיאחז במוט כדי למדוד את שיא המתיחות.
- הקלטת פעילות במהלך בדיקה של הליכה למשך 6 דקות.
תוצאות עיקריות
- המערכת מזהה ירידה בתנועה רצונית בעכברי mdx.
- היא מבדילה באופן מדויק בין שיפורים הנובעים מהצלה (rescue) ספציפית לשריר.
- התוצאות ניתנות לשחזור לאורך ניסויים שונים.
- השיטה ניתנת להתאמה למגוון הגדרות מחקר.
מסקנות
- בדיקה זו יעילה לחקר דיסטרופיה שרירית בעכברים.
- היא מספקת נתונים בעלי ערך על היעילות של טיפולים פוטנציאליים.
- הגישה גמישה וניתן להשתמש בה בסביבות מחקר מגוונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
מדידת הליכה רצונית במודלים של עכברים מספקת מדד תרגומי לתפקוד המוטורי בדיסטרופיה שרירית, באופן האנלוגי ישירות למדדים קליניים כגון מבחן הליכה של 6 דקות. בדיקה זו, המבוססת על וידאו ובעלות נמוכה, מאפשרת הערכה הדירה ולא פולשנית של התקדמות המחלה ותגובה טיפולית במחקרים פרה-קליניים. באמצעות זיהוי גרעונות בפעילות בעכברי mdx חסרי דיסטרופין והשגה של שיפור באמצעות ביטוי אוטרופין, השיטה תומכת בתיקוף של מטרות טיפוליות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות למערכת השרירים והעצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי כימות הליכה רצונית כמדד תפקודי לעוצמת השרירים במודלים של דיסטרופיה.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קורלציה הדירה בין גנוטיפ לפנוטיפ בעכברי mdx לעומת קבוצות של סוג בר (wild-type) וקבוצות שעברו תיקון גנטי.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין התערבויות יעילות (למשל, טרנסגן utrophin) המנורמלות את רמות הפעילות לרמה של סוג בר.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות בהמשך התהליך, תוך שימוש במדדי הליכה סטנדרטיים בשטח פתוח (open-field).
- שחזוריות: אספקת פלטים כמותיים המבוססים על מרחק וזמן, המאפשרים סטנדרטיזציה של הבדיקה בין מעבדות שונות.
- יכולת הרחבה: שימוש בתוכנה חינמית ובקוד פתוח ובחומרה נגישה, כדי לאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה במסגרות מחקר מגוונות ללא צורך בציוד ייעודי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה ליקויים בניידות הרלוונטיים למטופל, ומספק רצף תרגומי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר האם ההשפעות שנצפו נובעות מהצלה ספציפית לשריר לעומת שינויים לא ספציפיים בפעילות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני go/no-go על ידי מתאם בין התאוששות הניידות לבין מעורבות המטרה ומודולציה של המסלול.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, ומספקת גשר תפקודי בין מנגנונים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות במודלים של דיסטרופיה שרירית.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות לשינויים מדידים בתנועה רצונית.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה באמצעות מעקב מבוסס וידאו הניתן לשחזור, המייצר נקודות קצה כמותיות של הליכה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת זרמי נתונים מיקומיים וזמניים המאפשרים לצוותים להשוות פעילות מוטורית בין גנוטיפים, טיפולים ונקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שיקוף של הערכות הליכה קליניות, ובכך מקל על התאמת ביומרקרים ומודלים ניבויים.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת יכולת נמוכת עלות וניתנת לשימוש חוזר לבדיקות הליכה, המפחיתה את התלות במכוני ליבה מיוחדים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במבחני תפקוד מוטורי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מעקב בקוד פתוח ותנאים סביבתיים מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי ביטול הצורך במערכות מעקב תנועה יקרות, תוך שמירה על איכות הנתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון, בהתבסס על הצלה פונקציונלית של פנוטיפים של הליכה במודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בהקלטת וידאו ובתוכנות מעקב בקוד פתוח (למשל, יישור ידני פריים אחר פריים).
- תלוי בציוד דימות סטנדרטי ובקרים סביבתיים עקביים (תאורה, טמפרטורה, שעה ביום).
- מחייב הקפדה על פרוטוקול אחיד בין צוותים כדי להבטיח הדירות בין אתרים ומבצעים שונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור גדלי תאים שונים, זני עכברים ורמות פעילות שונות.
- כולל פשרות בין קצב הפריימים לבין דיוק המדידה, שכן דגימה מופחתת (downsampling) מפחיתה את הדיוק בחישוב המרחק.
