הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין באופן שחזורי דגימת רקמה להדמיית ספקטרומטריית מסה פפטידית. שיטה זו מאפשרת למשתמשים מתחילים בספקטרומטריית מסה לפתח תהליכי עבודה משלהם של ספקטרומטריית מסה מבלי לעבור קביעות אמפיריות ארוכות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת לשחזור מאוד, פשוטה ליישום ומשתמשת במתודולוגיות חסכוניות.

להכנת השקופיות המצופות ניטרוצלולוזה, פיפטה 40 מיקרוליטר של ניטרוצלולוזה נוזלית על קצה אחד של שקופית מיקרוסקופ תחמוצת הבדיל המוליך. בעזרת שקופית מיקרוסקופ זכוכית רגילה, גרור את הניטרוצלולוזה תחת מתח פנים על פני השקופית כדי ליצור ציפוי אחיד של סרט דק. הניחו לניטרוצלולוז להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 20 שניות, ולאחר מכן אחסנו עד הצורך בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, צור תאי אדים מותאמים אישית על ידי חיתוך פיסת נייר סופג עבה גדולה מספיק כדי להתאים לחצי התחתון של צלחת פטרי פלסטיק רגילה. חותכים את הנייר כדי להשאיר רצועה מלבנית במרכז בגודל זהה לשקופית מיקרוסקופ. השאירו מספיק עודפים כדי שהנייר ישמור על מיקומו בצלחת הפטרי.

עבור רקמת FFPE, צף הרכיב את החלקים על שקופיות ה-ITO המצופות מראש של ניטרוצלולוז כמתואר בפרוטוקול הטקסט. טבלו את השקופיות בקסילן טרי כדי להסיר שאריות פרפין למשך שתי דקות. שטפו את הדגימות המפורקות על ידי טבילת השקופיות בסדרת ממס מדורגת המורכבת מנפח של 70% לתמיסת מי אתנול בנפח, ואחריה 100% אתנול, למשך 30 שניות.

לאחר מכן, טבלו את המגלשות בנוזל של קרנוי למשך שתי דקות. לבסוף, טבלו את המגלשות לסדרה של 100% אתנול, מים טהורים במיוחד ו-100% אתנול שוב, למשך 30 שניות. טען את שקופיות הדגימה לתוך קופסת שקופיות מפלסטיק שממולאת עד למעלה ב-20 מילי-מולרי טריס HCO.

אטמו את הקופסה, והניחו אותה באמבט מים המכיל 500 מיליליטר מים, מה שמאפשר לקופסה לגעת בתחתית האמבטיה. לאחר מכן מחממים את הקופסה למשך 15 דקות בחום של 120 מעלות צלזיוס בסיר לחץ, שיכול להשיג לחץ הפעלה של 70 קילופסקל. הסר את השקופיות, הניח להן להתקרר ותן להן להתייבש בטמפרטורת הסביבה למשך 15 דקות.

לאחר ההידרוליזה, צפו את הדגימות ב-10 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין במים טהורים במיוחד על ידי פיפטינג תחילה של 10 מיקרוליטר מהתמיסה על קצה קטע הרקמה. לאחר מכן, בעזרת אותו קצה פיפטה, גרור את הטיפה על פני כל שטח הרקמה תחת מתח פנים. לאחר שאפשרו לדגימות להתייבש בטמפרטורת הסביבה, הרכיבו אותן בתוך החלק העליון של תא האדים שנבנה בעבר עם סרט חיטוי משני קצוות השקופית.

פיפטה בזהירות 600 מיקרוליטר של תמיסה המכילה נפח אחד לאחד לתערובת נפח של 100% אצטוניטריל ו-50 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט על אצבע הנייר הסופגת בחלק התחתון של צלחת הפטרי, עד שהאצבע נראית רטובה באופן שווה. פיפטינג חשוב ביותר מכיוון שפיפטינג שגוי יביא לדה-לוקליזציה של המטריצה והאנלואידים של פני השטח שלך, מה שיהרוס את המידע המרחבי הכלול בדגימה שלך. הנח את החצי העליון של תא האדים על החצי התחתון, וודא שאצבע הנייר ושקופית הדגימה מיושרות בצורה מושלמת, ואטום את החדר סביב קו המשווה שלו עם סרט פרפין.

השאירו את הדגימה למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר עיכול מלא. לאחר העיכול, השאר את שקופית הדגימה על איזון מיקרואנליטי בן חמש ספרות. התקן את השקופית על אצבע הקירור של מכשיר הסובלימציה, ואבטח אותה עם סרט נחושת באותו אופן כמתואר עבור תא האדים.

מניחים 300 מיליגרם של מטריצת CHCA בצלחת פטרי מזכוכית בתחתית החדר ומורחים אותה באופן שווה ליצירת שכבה דקה של גבישי מטריצה. הרכיבו את הסובלימטור. ואבטח את שני החצאים בעזרת מהדק הפרסה.

תלו את היחידה המורכבת 15 עד 20 סנטימטרים מעל אמבט חול, שחומם מראש ל -220 מעלות צלזיוס, על ידי הנחתו בטבעת מתכת המחוברת למעמד רטורט. חבר את החדר למקור הוואקום, הפעל את הוואקום ואפשר לו להתייצב לכ-25 מיליטור למשך חמש דקות. אורזים את אצבע הקירור למעלה עם קרח, ומוסיפים 50 מיליליטר מים.

הניחו למנגנון להתייצב חמש דקות נוספות לפני שתמשיכו. הורד את החדר על פני המעמד, וודא שהחול יוצר קשר לחלוטין עם תחתית החדר. השאירו אותו למשך 45 דקות ליצירת ציפוי אידיאלי של 0.22 מיליגרם לסנטימטר מרובע.

לאחר 45 דקות, הסר את החדר מאמבט החול על ידי הרמת טבעת המתכת, ואוורר את החדר. לאחר הסובלימציה, התקן את שקופית הדגימה בתוך החלק העליון של תא האדים שנבנה בעבר, כמו קודם. פיפטה בזהירות 600 מיקרוליטר של תמיסה המכילה נפח אחד לאחד לתערובת נפח של אצטוניטריל וחומצה טריפלואורואצטית במים על נייר הספיגה בחלק התחתון של צלחת הפטרי כדי להבטיח ציפוי אחיד.

לאחר מכן, הרכיבו את החדר, וודאו שלשונית הנייר ושקופית המיקרוסקופ מיושרים בצורה מושלמת. השאירו את החדר בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. סרוק את השקופית בסורק שטוח כדי ליצור תמונה דיגיטלית.

טען את הדגימה לספקטרומטר המסה, ולאחר מכן נתח באמצעות פלטפורמת התוכנה המתאימה. לבסוף, נתח את הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצגת כאן דגימת רקמה מעובדת כהלכה שצולמה ב-50 מיקרון ומראה מבנה מאקרו טוב והבדל ברור בין חומר לבן לחומר אפור.

דגימות שהושוו בהצלחה יראו התמיינות ברורה במיקומי רקמות שונים. כאן, יש אזור ברור של ויסות מוגבר של הפפטיד המיוצג על ידי יחס מסה למטען של 1,085 באזור החומר הלבן, כפי שמיוצג על ידי אזורים לבנים. לעומת זאת, מדגם זה שהוכן באופן שגוי מראה רמה בקנה מידה גדול של דה-לוקליזציה.

דפוסי המולקולות הקיימים על פני שלושת הפאנלים מדגימים בבירור כי אין הגדרה ברורה בין אזורים ביולוגיים או הבדלים בשפע המולקולות המוצגות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג ממש טוב כיצד להכין דגימות משלך לניתוח הדמיית פפטידים. עם הליך נכון, ניתן לבצע שיטה זו תוך שמונה שעות במשך יומיים, מה שמאפשר שלב עיכול בן לילה.

בעת הכנת מתודולוגיה זו, חשוב להקפיד בכל שלב. כל נזק פיזי שיקרה לרקמה יהרוס את המידע המרחבי הכלול בדגימה שלך. היה לנו את הרעיון למתודולוגיה הזו כשהתחלנו לראשונה את חקירות החלל שלנו ב-IMS והבנו שאין מתודולוגיות סופיות אחרות שפורסמו.

עם שינויים קטנים, ניתן ליישם את המתודולוגיה שלנו לניתוח חלבונים, פפטידים, ליפידים ומולקולות קטנות אחרות. לאחר הליך זה, ניתן ליישם טכניקות היסטולוגיות אחרות כגון אימונופלואורסצנציה וצביעה של המטוקסילין ואאוזין על הדגימה שלך על מנת לקבל נקודת התייחסות לנתוני ספקטרומטריית המסה של ההדמיה שלך. כאשר עובדים עם כימיקלים שעלולים להתפוצץ, כגון ניטרוצלולוז נוזלי, חשוב לשמור על נהלי הבטיחות הנכונים.

צמצום נפחי העבודה וסילוק הפסולת שלך באופן מיידי הוא חשוב ביותר.