קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca^{2 +} גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

המטרה הכוללת של בדיקה מבוססת תאים זו היא לזהות ולאפיין מולקולות המסוגלות לעורר או לעכב גיוס סידן תוך-תאי בתיווך קולטן חלבון G. שיטה זו יכולה להיות מבחן רב ערך לגילוי תרופות קולטן מצומד לחלבון G מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לסנן מולקולות המשנות גופי סידן תוך-תאיים בתיווך קולטנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לזהות מולקולות בעלות תכונות אגוניסטיות או אנטגוניסטיות באותה בדיקה.

בדיקה זו עשויה לסייע בגילוי מועמדים לתרופות חדשות הפועלות על קולטנים מצומדים לחלבון G, ומבטיחות מטרות טיפוליות הממלאות תפקיד במחלות אנושיות רבות. ביום מעבר התאים, מצפים כל באר של צלחת פוליסטירן שחורה עם קירות 96 עם תחתית שקופה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת ג'לטין של 0.1% ודוגרים על הצלחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בזמן שהג'לטין מתמצק, השתמש בתמיסת טריפסין EDTA כדי להרים את התאים המעניינים מתחתית בקבוק התרבית שלהם, ולהשעות מחדש את התאים במצע גידול טרי בצינור חרוטי של 50 מיליליטר לאחר ניתוקם.

לאחר הספירה, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה במדיום גידול טרי לריכוז של 10 פעמים 10 עד 5 תאים ברי קיימא למיליליטר. כשהצלחות מוכנות, השליכו את כל תמיסת הג'לטין העודפת וייבשו את הצלחות על רקמת מעבדה. לאחר מכן שטפו את הבארות ב-200 מיקרוליטר PBS והחליפו את הכביסה ב-200 מיקרוליטר תאים לבאר לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

למחרת בבוקר, הקש על הצלחת כדי להשליך את מצע הגידול מהבארות ולייבש את הצלחת הפוכה על מגבת נייר. לאחר מכן סמן את התאים בכל באר עם 100 מיקרוליטר של תמיסת צבע טעינה לבאר ודגר את הצלחת למשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בזמן שהתאים דוגרים, הוסף 75 מיקרוליטר של CXCL12 לכל באר לצלחת הכימוקין ו-50 מיקרוליטר מהתרכובת המעניינת לכל באר של צלחת התרכובת.

לאחר מכן, הפעל את יחידת הקירור יותר של קורא לוחות הקרינה ואחריו את קורא הלוחות עצמו. לאחר שאפשרת למערכת מספר דקות לפעול, פתח את תוכנת קורא הלוחות. כדי להגדיר את פרוטוקול הבדיקה, תחת לשונית ההגדרות בחר מצב קריאה ואת אורכי הגל המתאימים לעירור ולפליטה עבור צבע הטעינה.

בחר את התערובת עם לשונית נוזל ההעברה לערבוב אוטומטי של התרכובות בצלחת התרכובת. בלשונית נוזל ההעברה, הגדר 20 מיקרוליטר מכל באר מלוח התרכובת שיועבר ללוחית המדידה ומקם את קצות הפיפטה ב-20 מיקרוליטר מתחת לפני הנוזל. הגדר את מהירות השאיפה ל -50 מיקרוליטר לשנייה ואת מהירות החלוקה ל -25 מיקרוליטר לשנייה ולחץ לקרוא עם נוזל העברה.

במהלך המרווח הראשון, בחר 60 קריאות עם זמן מרווח קריאה של שנייה אחת עם 10 קריאות לרישום לפני חלוקת התרכובות ללוחית המדידה ו-50 קריאות שיושלמו לאחר מכן. הגדר את המרווח השני עם זמן מרווח קריאה של 30 שניות ו-18 קריאות. בחר שלוש שטיפות קצה לפרוטוקול, הגדר כל שלב כביסה כך שיכלול את נוזל הכביסה המתאים, מחזור כביסה אחד, מהירות משאבה מהירה וחמש פעימות לכל כביסה.

השתמש בפונקציית ההשהיה של פיפטור כדי לכלול את השהיית הפיפטור של 300 שניות והשתמש בהגדרת התערובת עם נוזל ההעברה כדי לאפשר ערבוב אוטומטי של תמיסת CXCL12 בתוך צלחת הכימוקין. בלשונית נוזל ההעברה שלאחר מכן, הגדר 25 מיקרוליטר מכל באר של לוחית הכימוקין להעברה ללוחית המדידה ומקם את הקצוות 20 מיקרוליטר מתחת לפני השטח של הנוזל. הגדר את מהירות השאיפה ל-50 מיקרוליטר לשנייה ואת מהירות החלוקה ל-25 מיקרוליטר לשנייה.

השתמש בלחצן הקריאה עם נוזל ההעברה כדי להגדיר את המרווח הראשון כך שיכלול 145 קריאות עם זמן מרווח קריאה של שנייה אחת. הגדר את מרווח הזמן השני לזמן מרווח קריאה של שש שניות ו-20 קריאות. בחר שלושה מחזורי קצה כביסה נוספים.

לאחר מכן לחץ על הגדר tagטמפרטורת והגדר את טמפרטורת המכשיר ל-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה של צבע הטעינה, השליכו את המאגר מלוח המדידה וייבשו את הצלחת על רקמת מעבדה. שטפו את התאים עם 150 מיקרוליטר לכל באר של מאגר בדיקה, והחליפו את המאגר ב-80 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לאחר שתי דקות.

הנח את לוחית המדידה במצב הקריאה, את לוחית המורכבת במיקום המקור השני, את לוחית הכימוקין במיקום המקור השלישי וקופסת קצות שחורים במיקום המקור אחד. סגור את המכשיר ולחץ על בדיקת אות פרוטוקול כדי לקבוע את יחידות האור היחסיות ברקע ואת שונות הקרינה על פני הצלחת. בחר אות בדיקה בחלון המוקפץ.

אם מתקבלים ערכי רקע של 8,000 עד 10,000 יחידות אור יחסיות, בחר עדכן ולחץ על שמור כדי לשמור את הפרוטוקול הראשי. לאחר מכן לחץ על Run כדי להתחיל את הבדיקה. בגרף זה ניתן לראות עלייה תלוית מינון בקרינה המתואמת עם העלייה התלויה במינון בשחרור הסידן.

רמות הולכות וגדלות של פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי CXCL12 מאפשרות יצירת עקומת תגובת מינון המבוססת על ההבדל בין התגובה המינימלית למקסימלית על פני קו הבסיס בין המדידה הראשונה לאחר הוספת הכימוקין למדידה הסופית בפרוטוקול. CXCL12 לא עורר תגובה פלואורסצנטית הקשורה לסידן אפילו בריכוז גבוה כאשר נעשה שימוש בתאים חסרי קולטן הכימוקין הפונקציונלי המקביל CXCR4 המדגים את ספציפיות הקולטן של המדידה המעוררת CXCL12. יישום מרכזי לבדיקה מבוססת תאים זו הוא זיהוי מולקולות קטנות שלאחר הדגירה המוקדמת, המינון מעכב באופן תלוי את ניוד הסידן המושרה על ידי CXCL12 בתאים בהשוואה לתרכובות בקרה לא פעילות שאינן מעכבות את התגובה.

כדי לקבוע את העוצמה המעכבת של מולקולות קטנות, ניתן ליצור עקומת תגובת מינון עבור המולקולות המעכבות באמצעות רגרסיה לא ליניארית. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור קולטנים אחרים המחוברים לחלבון G ללא אופטימיזציה נוספת או מינימלית בלבד, כמו גם בניסוי זה בו נצפתה עלייה תלוית מינון בפלואורסצנטיות כאשר קולטן כימוקין אחר, CCR5, מגורה עם אגוניסט הכימוקין הטבעי שלו CCL5. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור קולטנים רבים אחרים המצומדים לחלבון G המאותתים באמצעות ניוד יוני סידן תוך תאיים עם הפעלת הקולטן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ניתן להשתמש בבדיקה התאית הזו כדי לזהות אגוניסטים ואנטגוניסטים של קולטן הכימוקין CXCL4.