גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון
12 בדצמבר 2017
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לגלות Zika וירוס מסוים אבחון פפטידים באמצעות microarray פפטיד בצפיפות גבוהה. פרוטוקול זה יכול להתאים readly למחלות זיהומיות מתעוררים אחרים.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות פפטידים ספציפיים לנגיף הזיקה לשימוש בבדיקת אבחון לאיתור נוגדנים לנגיף הזיקה. זה קריטי, מכיוון שהנגיף נעלם מהדם תוך כ-10 ימים, בעוד הנוגדנים נשארים שנים. שיטה זו מאפשרת לנו לזהות אנטיגנים ואפיטופים תוך שימוש במיקרו-מערך של כל פרוטאום הזיקה כדי לזהות פפטידים הלוכדים נוגדנים IgM או IgG בדגימת סרום מאדם נגוע.
היתרון העיקרי בזיהוי נוגדנים מוקדמים, IgM, ונוגדנים מאוחרים יותר, IgG, הוא לספק לרופא ציר זמן של הזיהום. וזה חשוב במיוחד אצל נשים בהריון. בעוד שפרוטוקול זה מספק תובנה לגבי הגורם לזיהום בנגיף הזיקה, ניתן ליישם אותו על פתוגנים אחרים, באמצעות מיקרו-מערך ספציפי לאותו פתוגן אם רצף החלבון שלו ידוע.
טפל בשקופית הזכוכית בקצוות באמצעות כפפות נטולות אבקה. מידות מגלשת הזכוכית הן 75.4 מילימטרים על 25.0 מילימטרים ועובי 1 מילימטר. הנח את השקופית במגש הדגירה כשמשטח המיקרו-מערך פונה כלפי מעלה.
מלא את מחזיקי השקופיות הריקים בשקופיות ריקות כדי למנוע את שבירת שקופית המיקרו-מערך. הנח את הצד המבריק של האיטום כלפי מטה על המשטח המודפס במיקרו-מערך. כדי להבטיח מיקום טוב, חפפו את חורי הברגים של החותם ואת לוחית הבסיס.
הנח את החלק העליון של המגש על האיטום כדי ליצור תא מיקרו-מערך. אבטח את השקופית במגש על ידי הידוק שווה של ברגי האגודל בזה אחר זה ביד בתבנית מתחלפת. התחל מהפינה השמאלית העליונה והמשך לימין התחתון.
הנח את המכסה על מגש הדגירה. טיפול זהיר במיקרו-מערך חיוני כדי למנוע שריטות של משטח המיקרו-מערך. פתרונות מתווספים לפינת תא המיקרו-מערך ולאחר מכן מוסרים ממנה.
ייבוש המיקרו-מערך חשוב גם כדי לספק תמונת סריקה טובה. דגרו את המיקרו-מערך עם 2,000 מיקרוליטר של מאגר סטנדרטי לכל מיקרו-מערך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי ב-140 סל"ד. הסר את המאגר הסטנדרטי על ידי שאיבה עם פיפטה מפינת תא המיקרו-מערך, ולאחר מכן חסום את המיקרו-מערך עם מאגר חוסם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי ב-140 סל"ד.
הסר את המאגר החוסם על ידי שאיבה מפינת תא המיקרו-מערך בעזרת פיפטה. הוסף נוגדן משני מצומד IgM פלואורוכרום אנטי אנושי מדולל 1:5, 000 במאגר הצביעה למיקרו-מערך. לאחר מכן דגרו את המיקרו-מערך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך על שייקר מסלולי ב-140 סל"ד.
השתמש בפיפטה כדי להסיר את הנוגדן המשני על ידי שאיבה מפינת תא המיקרו-מערך. שטפו את המיקרו-מערך למשך דקה אחת עם 2000 מיקרוליטר עם חיץ סטנדרטי לכל מיקרו-מערך בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי ב-140 סל"ד. הסר את המאגר הסטנדרטי בטכניקה המודגמת וחזור על הכביסה פעמיים.
לאחר מכן, טבלו את השקופית פעמיים לתוך 200 מיליליטר של מאגר טבילה טרי. יבש את המיקרו-מערך בזהירות במשך כדקה על ידי שאיבת עודפי נוזלים בזהירות רבה מהחלק העליון לתחתית המגלשה מבלי לגעת במשטח המגלשה. נתח את השקופית בקורא סורק מיקרו-מערך כפי שמודגם בהמשך סרטון זה.
השבת את דגימת הסרום בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 RCF למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שמור את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש.
לאחר מכן דגרו את המיקרו-מערך עם מאגר הצביעה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי ב-140 סל"ד. הסר את מאגר הצביעה על ידי שאיבה מפינת תא המיקרו-מערך בעזרת פיפטה. יש לדלל את דגימת הסרום ואת מאגר הצביעה החל מדילול של 1:1,000.
דגרו את הדגימה המדוללת עם המיקרו-מערך למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי ב-140 סל"ד. הסר את דגימת הסרום המדוללת בטכניקה המודגמת. לאחר מכן שטפו את המיקרו-מערך שלוש פעמים כמו קודם.
יש לדלל את הנוגדן המשני במאגר הצביעה. השתמש בנוגדנים מצומדים IgM פלואורוכרום אנטי אנושי או נוגדן מצומד IgG פלואורוכרום אנטי אנושי בדילול של 1:5,000 במאגר צביעה. לאחר מכן מערבבים את הנוגדן המסומן בביקורת בדילול של 1:1000 במאגר צביעה עם הנוגדן המשני המדולל.
דגירה עם המיקרו-מערך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך ועל שייקר מסלולי ב-140 סל"ד. הסר את תערובת הנוגדנים המשניים והמסומנים המדוללים על ידי שאיבה מפינת תא המיקרו-מערך בעזרת פיפטה. לאחר מכן שטפו את המיקרו-מערך שלוש פעמים עם מאגר סטנדרטי.
כל שטיפה היא למשך דקה אחת על שייקר אורביטלי ב-140 סל"ד. לבסוף, הסר את מאגר הכביסה מתא המיקרו-מערך כמו קודם. כדי לבצע סריקת מיקרו-מערך, טבלו את השקופית פעמיים לתוך 200 מיליליטר של מאגר טבילה טרי.
יבש את המיקרו-מערך למשך כדקה על ידי שאיבה בזהירות רבה מהחלק העליון לתחתית המגלשה מבלי לגעת במשטח המגלשה. סרוק את המיקרו-מערך בהתאם להוראות הסורק. הנח את השקופית על הסורק כשהמשטח המודפס פונה כלפי מעלה.
צור פרויקט חדש ובחר את אזור הסריקה. הגדר פרמטרים של סורק ברזולוציה של 21 מיקרון, עוצמה של 7.0 עבור ערוצי 700 ו-800 ננומטר, איכות סריקה של מדיום והיסט של 0.8. רכוש ושמור את תמונת ציור הסריקה כפורמט קובץ TIF בגווני אפור של 16 סיביות.
כדי לנתח את הנתונים, פתח את התמונה הגולמית. לאחר מכן פתח את קובץ רשת המערך. יישר את רשת המערך לתמונת הסריקה באמצעות מקשי החצים של העכבר או המקלדת של המחשב.
בחר כימות בחירה בתוכנה הספציפית, שיוצרת קובץ קריאה המכיל את עוצמת האות עבור כל נקודה, ערך הרקע ורצף הפפטידים המתאים. לבסוף, אחסן את המיקרו-מערך אטום בחושך בארבע מעלות צלזיוס תחת חנקן נטול חמצן או גז ארגון. מוצגת כאן תמונת הקרינה הגולמית של צביעת המיקרו-מערך ב-IgG אנטי-אנושי לאחר דגירה עם דגימת סרום ספציפית של נגיף הזיקה מדוללת 1:250.
פפטידי בקרת HA ממסגרים את המיקרו-מערך. פפטידים שמגיבים חזק ל-IgG מוצגים בחלונית הזום. באופן דומה, מוצגת כאן תמונה פלואורסצנטית גולמית של צביעת המיקרו-מערך ב-IgM אנטי-אנושי לאחר דגירה עם דגימת סרום ספציפית של נגיף הזיקה מדוללת 1:250.
שוב, פפטידי הבקרה של HA ממסגרים את המיקרו-מערך. פפטידים שמגיבים חזק ל-IgM מוצגים בחלונית הזום. מוצג כאן רצף קונצנזוס מייצג של אפיטופ נגיף זיקה המגיב עם IgM בפפטידים של דגימת הסרום המארח.
פפטידים מרצף הקונצנזוס של האפיטופ מודגשים באדום, והפפטיד בעל עוצמת הקרינה הגבוהה ביותר מסומן בהדגשה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעבד מיקרו-מערך פפטידים בצפיפות גבוהה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בזהירות במיקרו-מערך כדי למנוע שריטות של משטח המיקרו-מערך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA או בדיקת קשירת תהודה פלזמון על פני השטח כדי לקבוע אם הפפטידים שזוהו נקשרים באופן ספציפי לנוגדנים לנגיף הזיקה ולא לנוגדנים אחרים של Flavivirus. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האבחון לגילוי פפטידים אבחנתיים באמצעות דגימות סרום ורוק.
אל תשכח שעבודה עם גורמים זיהומיים כמו נגיף זיקה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון השבתת חום של דגימת הסרום ועבודה במתקני בטיחות ביולוגית ברמה 2 בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לזיהוי פפטידים ספציפיים לנגיף Zika באמצעות מערך פפטידים (peptide microarray) בצפיפות גבוהה. ניתן להתאימו למחלות זיהומיות מתהפערות אחרות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחלות זיהומיות
- בדיקות אבחנתיות
- מיקרו-מערכים של פפטידים
רקע
- נוגדנים לוירס זיקה נשמרים למשך זמן רב יותר מאשר הוירס עצמו.
- נוגדני IgM מעידים על זיהום מוקדם, בעוד שנוגדני IgG מעידים על שלבים מאוחרים יותר.
- הבנת ציר הזמן של הזיהום היא קריטית, במיוחד עבור נשים בהריון.
- ניתן להתאים שיטה זו עבור פתוגנים אחרים בעלי רצפי חלבון ידועים.
מטרת המחקר
- זיהוי פפטידים ספציפיים לנגיף זיקה לשימוש באבחון.
- שיפור הגילוי של נוגדנים לנגיף זיקה בדגימות סרום.
- אספקת ציר זמן של הזיהום עבור קלינิกאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במערך זעיר (microarray) המכיל את כל הפרוטואום של נגיף הזיקה.
- זיהוי פפטידים הלוכדים נוגדני IgM ו-IgG.
- ניתוח דגימות סרום מאנשים נגועים.
- התאמת הפרוטוקול עבור פתוגנים אחרים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של פפטידים ספציפיים לוירוס Zika.
- הדגמה של יכולת ההסתגלות של השיטה למחלות זיהומיות אחרות.
- אספקת ציר זמן לזיהום בוירוס Zika באמצעות גילוי נוגדנים.
מסקנות
- פרוטוקול זה יעיל לאבחון זיהומים בנגיף זיקה.
- הוא מספק תובנות לגבי התגובה החיסונית לנגיף זיקה.
- ניתן להחיל את השיטה על פתוגנים אחרים, ובכך לשפר את יכולות האבחון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי אפיתופים ספציפיים לנתיב פתוגני הוא קריטי לפיתוח אמצעי אבחון סרולוגיים עם חלונות זיהוי מורחבים מעבר לשלב הוירמיה. גישה זו מאפשרת הבחנה בין שלבי זיהום באמצעות פרופילי IgM/IgG, ובכך תומכת בקבלת החלטות קליניות באוכלוסיות רגישות. השיטה מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה לגילוי אפיתופים, הישמה על איומים זיהומיים מתהווים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של אפיתופים ליניאריים על פני כל הפרוטאומה הויראלית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי שיטתי של פפטידים המגיבים ל-IgM ו-IgG.
- ערך ניבוי: מסייע במיון הפורטפוליו על ידי זיהוי מטרות אבחנתיות עם תגובה מתמדת של נוגדנים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מועמדים פפטידיים מתוקתקים לצורך פיתוח בדיקות אבחוניות בהמשך התהליך.
- שחזוריות: עושה שימוש בהדפסה כפולה ובשטיפה סטנדרטית כדי להבטיח זיהוי עקבי של האות.
- מדרגיות: מאפשר סריקה של למעלה מ-3,000 פפטידים לשקופית עבור מיפוי Epitope בתפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מזהה אפיטופים המוכרים בסרום אנושי, ובכך מבטיח את הרלוונטיות הקלינית של המטרות הגולויות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לשלב התיקוף על ידי אספקת פפטידים המתאימים לאישור באמצעות ELISA או SPR.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות go/no-go המבוססות על ספציפיות האפיטופ וקינטיקה של איזוטיפ הנוגדנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לפיתוח הבדיקה, ובכך היא מאפשרת תכנון של אבחון המונחה על ידי האפיטופ.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות סריקה של רחבי הפרוטאום לאיתור אזורים המגיבים לנוגדנים.
- סריקה: מספקת קריאות פלואורסצנציה כמותיות לבחירה ותיעדוף של פגיעות (hits).
- אנליטיקה: מייצרת נתוני עוצמת אות המאפשרים השוואה בין קישור IgM ל-IgG על פני פפטידים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתיקוף פרה-קליני באמצעות אינטראקציות מאושרות בין פפטידים לנוגדנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למיפוי מהיר של אפיתופים כנגד פתוגנים חדשים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות מיפוי אפיתופים ישיר מדגימות קליניות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות החלפות בופר סטנדרטיות ובקרות סביבתיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי התמקדות בפיתוח אפיתופים רלוונטיים מבחינה קלינית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף מותאם סיכונים של מועמדים לאבחון על בסיס התמדת הנוגדנים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במערכי מיקרו-מערכים (microarray), גילוי פלואורסצנציה ותוכנות לניתוח נתונים.
- תלוי בסורק מערכי מיקרו-מערכים, שייקר מסלול (orbital shaker) ומכשור לטיפול בנוזלים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולים של עיבוד סרום, אינקובציה ושטיפה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על פתוגנים בעלי גדלי פרוטאום שונים או קינטיקה שונה של נוגדנים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות בטיפול בשקופיות ובקרות סביבתיות ליציבות הפלואורסצנציה.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Installing the ZIKV High-density Peptide Microarray Slide in a Specific Incubation Tray
2:38
Background Interation Detection: Staining the Microarray with Secondary Antibodies
4:59
Exposure of the Microarray to Host Serum
6:08
Staining with Secondary Antibodies and Labeled Control Antibodies
7:12
Microarray Scanning, Anaysis, and Storage
9:10
Results: Peptide Microarray Scanned Images and Representative Zika Virus Epitope Consensus Sequence Reacting with IgM on the Host Serum Sample
10:11
Conclusion
