Name: העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוגנסיס עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: למדו נוירוג'נסיס עוברי במוח האחורי של עכברים באמצעות הכנת איברים שלמים וחתכים היסטולוגיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור תבניות של התפתחות עצבית במודל יונקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים Vasiliki Chantzara על ביצוע matings מתוזמן וצוות של יחידת המשאבים הביולוגיים-מכון עיניים של UCL עבור גידול העכבר. מחקר זה נתמך על ידי Wellcome אמון פרס החוקר 095623/Z/11/Z כדי CR.

כל העבודה בעלי חיים בוצע לפי משרד הפנים בריטניה והנחיות אתיות מקומיים.
1. סיכום השלבים והתזמון
<ol><li>בצע matings מתוזמן של עכברים בוגרים מתוך זן מתאים לענות על השאלה ביולוגיות. תחת חקירה כדי להשיג הריונות 9.5-e13.5 מתחלקים היום (ה); דורשת 12-15 ימים.</li>
	<li>לחלופין, להכין 5-ברומו-2'-deoxyuridine (BrdU) / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) פתרון לבצע הזרקה (פרוטוקול בסעיף 2); דורש ~ h 1 ביום שלפני או ביום של בידוד העובר, בהתאם לאורך הרצוי של עידו/BrdU תיוג.</li>
	<li>לבצע חיתוך בידוד, hindbrain העובר (פרוטוקול בסעיף 3); דורש ~ 10 min/העובר.</li>
	<li>לבצע תיוג (פרוטוקול סעיף 4); immunofluorescence wholemount דורש 3 ימים.</li>
	<li>סעיף באמצעות vibratome ולבצע צף immunofluorescence סעיף תיוג (פרוטוקול סעיף 4): דורש 2 ימים.</li>
	<li>סעיף באמצעות cryostat ולבצע immunofluorescence תיוג של cryosections (פרוטוקול בסעיף 5); דורש 2 ימים.</li>
</ol>2. להזריק את העכבר נקבה בהריון עם BrdU או אדו (אופציונלי)
<ol><li>להמיס BrdU או אדו פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS) ריכוזי של 10 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. התראה: BrdU ואדו הם רעילים; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>שוקל את העכבר בהריון ולחשב את עוצמת הקול של BrdU או אדו פתרון זה צריך להיות מנוהל על מנת להגיע 100 מ"ג/ק"ג BrdU או 5 מ"ג/ק"ג אדו.</li>
	<li>מזריקים BrdU או אדו פתרון דרך המסלול בקרום הבטן או 1 h או 1 יום לפני איסוף העוברים, בהתאם לאורך חובה תיוג. הערה: תיוג עבור 1 h מדמיין hindbrain תאים בשלב-S. תיוג עבור יום אחד מדמיין הוא צאצא. של hindbrain NPCs.</li>
</ol>3. ניתוח Hindbrains מ- e9.5 - e13.5 העכבר עוברי
<ol><li>המתת חסד עכבר נקבה בהריון-תוזמן באמצעות הליך אתית שאושרו בשלב הריון הדרושים (למשל, נקע בצוואר הרחם). באמצעות מספריים חדות, לחתוך חלל הצפק, בזהירות לסלק את הרחם. מקם את הרחם נכרת המכיל את העוברים לתוך צלחת פלסטיק 60 מ מ המכיל 20 מ"ל PBS קר כקרח. הערה: הטכניקה Aseptic אינה נדרשת.</li>
	<li>לבצע כל ניתוח נוסף באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. באמצעות שען מלקחיים מספר 5, דמעה על הקיר שריר הרחם כדי לחשוף את העוברים, שחרר כל העובר על-ידי ניתוק הטבור ולהסיר את שק החלמון.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר עם wide-משעמם פתיחה, להעביר כל העובר לתוך צלחת פלסטיק נקי עם PBS קר כקרח.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים שען מספר 55, סבר הראש (איור 1E).</li>
	<li>באופן אופציונלי, שומרים על חתיכה קטנה של רקמות (למשל, ¼ של שק חלמון או כ 2 מ מ קצה הזנב) בידוד דנ א גנומי, genotyping עוקבות.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים שען מספר 55, לסלק את הרקמה המכילה את hindbrain מקביל ל ומתחת מיד את neuroepithelium hindbrain כדי להפרידו מרקמות ופנים הקדמי (איור 1F).</li>
	<li>מקם את hindbrain ואת הצד הגבי סימטרית רקמות ראש למעלה ולזהות הנוזליםth 4, המכוסה על ידי שכבה רקמה דקה (צלחת גג). בזהירות לנקב את הצלחת גג באמצעות מלקחיים שען מספר 55 (איור 1 ג'י) ולהתקלף רקמות עודף משם עם מלקחיים, מעבר rostrally לאורך קו האמצע המוח האמצעי, ולאחר מכן הקליפה על hindbrain האחורי ועל חוט השדרה (איור 1 ג'י ); hindbrain צריך להיחשף עכשיו בהכנה ספר פתוח (איור 1 H).</li>
	<li>היכונו hindbrains wholemount immunolabeling (אפשרות 1).<ol>
<li>באמצעות שען מלקחיים מספר 55, בזהירות להקניט משם מזנכימה ראש הנותרים ואת כל קרומי המוח מחוברים לצד pial hindbrain באמצעות מלקחיים (איור 1I). הסר את המוח האמצעי ואת רקמת חוט השדרה (איור 1J) להשאיר רק את הרקמה hindbrain (איור 1 K). הערה: שלב זה של ההליך צריכה לא להיות מלווה e9.5 או e10.5, כי מנסה לעשות זאת סביר להניח ולפגיעה את neuroepithelium hindbrain; יתר על כן, הסרת קרומי המוח אינה חיונית, כי neuroepithelium hindbrain דליל מספיק בשלב זה כדי לאפשר חדירה יעיל של נוגדנים עבור immunolabeling. שלב זה צריך, עם זאת, לפעול לפיהם מ e11.5 ואילך, מאחדת את הרקמה של קרום המוח, כדי לשפר את הנוגדן לחדירה neuroepithelium hindbrain. ניתוח היא הקלה כאשר מבוצעת ב- PBS קר כקרח (שימוש, נקי PBS עבור כל hindbrain).</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו hindbrains vibratome ו- cryosectioning (אפשרות 2)<ol>
<li>בעזרת מלקחיים שען מספר 55, הסר את המוח האמצעי ואת רקמת חוט השדרה (איור 1J). הערה: אין צורך להסיר מזנכימה, קרומי המוח של hindbrains מיועד חלוקתה (כפי שמוצג באיור 1I).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר hindbrains צלחת פלסטיק עגול עם תחתית mL 2 צינורות באמצעות פיפטה של פסטר, תשאף כל PBS, תקן עבור 2 h ב 4° C עם עדין-עצבנות בפורמלין המופשרים טרי 4% w/v מומס PBS. התראה: פורמלדהיד הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>לשטוף hindbrains 3 x פעמים עם PBS. לאחסן ב 4 ° C ב- PBS אם immunolabeling להתחיל בתוך 2-3 ימים או להחליף PBS עם 50% methanol/50% PBS במשך 5 דקות לפני העברת 100% מתנול לאחסון ארוך ב-20מעלות צלזיוס.
</li>
</ol>4. Wholemount Immunofluorescence
<ol><li>אם נדרש, נוזלים hindbrains באופן סדרתי ומקטין דילולים של מתנול ב- PBS (למשל, 75% מתנול, 50% מתנול, 25% מתנול) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר ל- PBS. הערה: סדרה מדורגת של מתנול נדרש להחזיר נוזלים hindbrains בעדינות ולהבטיח שימור הרקמה הנכונה.</li>
	<li>Permeabilize hindbrains למשך 30 דקות ב 4 ° C ב- PBS המכיל 0.1% X-100 טריטון (PBT) עם עצבנות עדין.</li>
	<li>דגירה hindbrains עבור h 1 ב 4 ° C ב- PBT המכיל 10% סרום להשבית חום עז עם עצבנות עדין. הערה: להשתמש בסרום מן המינים מארח שגדלו הנוגדנים משני שם. עבור ראשי נוגדנים העולות עז, דגירה, סרום ללא חלבון לחסום, למשל 5% שור אלבומין PBS או חלופה המסחרי (ראה טבלה של חומרים). פעולה זו תקטין את שאינם ספציפיים מכתים נצפו לעתים קרובות באמצעות נוגדנים העיקרי העולות עז.</li>
	<li>דגירה hindbrains בין לילה ב 4 ° C ב- PBT המכיל 1% לא פעיל חום סרום נוגדנים ראשי עם עצבנות עדין (לדוגמה, ארנב אנטי-פוספו היסטון H3 [pHH3] מדולל 1:400). הערה: עבור ראשי נוגדנים העולות עז, השתמש PBT ללא סרום.</li>
	<li>לשטוף את hindbrains ב 4 ° C 5 x עם PBT עבור 1 h.</li>
	<li>דגירה hindbrains בין לילה ב 4 ° C ב- PBT המכיל המתאים fluorophore מצומדת משני נוגדנים (למשל, עז נגד ארנב אלקסה עבור חיל הים 488) ב- 1:200 ב- PBT המכוונים נגד נוגדנים העיקרי בשימוש. לשמור hindbrains בחושך מכאן על להגן על fluorophores photobleaching. הערה: נוגדנים העיקרי העולות עז, לשימוש שברי Fab עז נגד נוגדנים משניים כדי להפחית שאינם ספציפיים מכתים.</li>
	<li>לשטוף את hindbrains ב 4 ° C 5 x עם PBT עבור 1 h.</li>
	<li>Postfix את hindbrains בפורמלין 4% ב- PBS למשך 15 דקות ב RT לשימור לטווח ארוך של הנוגדן מחייב. בקצרה לשטוף פעמיים ב- PBS.</li>
	<li>מכסה זכוכית מיקרוסקופ שקופית עם שתי שכבות של איזולירבנד שחור, בלו כיכר קטנה מהקלטת בשכבות כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי להכיל hindbrain אחד.</li>
	<li>העברת כל hindbrain לתוך כיס עם פיפטה פסטר, להסיר עודפי נוזלים ולהוסיף ריאגנט antifade המתאים של הכיס לפני וכיסה אותו לאט לאט coverslip זכוכית כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת coverslip. לסגור את coverslip, ולהצמיד אותו לשקופית עם שכבה דקה של לק. לאחסן שקופיות ב 4 ° C בחושך עד ייבוא תמונות (פרוטוקול סעיף 7).</li>
</ol>5. Vibratome חלוקתה, צף סעיף Immunofluorescence
<ol><li>אם נדרש, נוזלים hindbrains של מתנול כפי שמתואר בשלב 4.1.</li>
	<li>להטביע hindbrains מותכת agarose w/v של 3%, המבושלות מים מזוקקים. הערה: אפשר agarose מותכת להתקרר כ 55 מעלות בקצרה לפני הטמעת כדי למנוע נזק חום hindbrain.</li>
	<li>חותכים hindbrain רוחבי מקטעים לעובי מיקרומטר 70 באמצעות של vibratome. העברת כל מקטע טרי חתוך באמצעות מברשת צבע לתוך אחד טוב של צלחת 24-ובכן המכיל PBS קר כקרח.</li>
	<li>תווית הסעיפים צף כמתואר בצעדים 4.2-4.7, אבל לשנות את השלבים כדלהלן: תשטוף הצפים סעיפים ב 4 ° C 3 x עם PBT עבור 15 דקות כל אחד, להקטין את זמן הדגירה של נוגדנים משניים 2 h, דגירה של נוגדנים משניים-RT.</li>
	<li>לחלופין, לאחר תיוג עם נוגדנים עבור אחרים epitopes כפי שמתואר בשלב 5.4, לזהות גרעינים אדו+ באמצעות להכש תיוג ערכת על פי הוראות היצרן. דגירה בסעיפים צף התגובה קוקטייל במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. תשטוף hindbrain סעיפים ב 4 ° C 3 x עם PBT למשך 15 דקות כל אחד.</li>
	<li>לחלופין, לאחר תיוג עבור אחרים epitopes כפי שמתואר בשלב 5.4, לאתר את הגרעינים BrdU+ כדלקמן.<ol>
<li>דגירה צף ובסעיף 2 חומצה הידרוכלורית N ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.</li>
		<li>דגירה צף ובסעיף 0.1 M נתרן בוראט מאגר pH 8.5 פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ב- RT בחושך כדי לנטרל את חומצת מלח.</li>
		<li>לשטוף צף ובסעיף 3 x בקצרה PBS ב 4 º C.</li>
		<li>לבצע תיוג עבור BrdU כפי שמתואר בשלב 5.4 immunofluorescence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הסעיפים צף למשך 2 דקות ב RT ב 10 µg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) ב- PBS כדי counterstain גרעין התא.</li>
	<li>Postfix הסעיפים צף בפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות ב- RT.</li>
	<li>רחץ מקטעים צף בקצרה ב- PBS. בזהירות להעביר מקטעים צף על שקופית זכוכית מיקרוסקופ שימוש במכחול. תנגבי PBS עודף סביב הסעיף באמצעות נייר סופג או רקמה.</li>
	<li>טעינת המקטעים באמצעות 80% גליצרול PBS ואת הכיסוי לאט עם coverslip זכוכית כדי למנוע השמנה בועות אוויר. לאחסן שקופיות ב 4 ° C בחושך עד ייבוא תמונות (שלב 7).</li>
</ol>6. cryostat חלוקתה, Cryosection Immunofluorescence תיוג
<ol><li>אם נדרש, נוזלים hindbrains של מתנול כפי שמתואר בשלב 4.1.</li>
	<li>דגירה hindbrains ב- 30% w/v סוכרוז ב- PBS כדי cryoprotect hindbrains להקפאה. הערה: Hindbrains הם מוכן קפוא כאשר הם טבענו לתחתית של הרכבת התחתית, אשר בדרך כלל לוקח ≤ 2 h עבור hindbrains e9.5-10.5 ו- h 3-6 עבור hindbrains e11.5-13.5.</li>
	<li>להטביע hindbrains בטמפרטורה חיתוך אופטי, מתחם (אוקטובר) ומקפיאים במהירות על ידי העברת תבניות המכילות hindbrains ב- OCT כדי איזופנטאן מקורר בין-40 ° C ל-50 מעלות צלזיוס על קרח יבש. הערה: ניתן לאחסן hindbrains קפואים, מוטבעים ב-20 ° C לטווח הקצר ולטווח הארוך-80 ° C עד חלוקתה.</li>
	<li>חותכים למקטעים hindbrain רוחבי בעובי 10 מיקרומטר באמצעות cryostat העברת שקופיות מיקרוסקופ electrostatically דבק. הערה: ניתן לאחסן Hindbrain cryosections ב-20 ° C לטווח הקצר ולטווח הארוך-80 ° C עד תיוג.</li>
	<li>דגירה שקופיות ב RT למשך 15 דקות לייבוש סעיפים על השקופיות. לשטוף cryosections עם PBS כדי להמיס OCT ומארק מחסום הידרופובי מסביב cryosections באמצעות עט PAP. חזור על שלבים 5.4-5.8.</li>
	<li>חזור על שלב 5.10 באמצעות בינוני פוליוויניל הרכבה על בסיס אלכוהול במקום גליצרול.</li>
</ol>7. ייבוא תמונות
<ol><li>דגימות באמצעות פלורסנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר, מצוידים עם עדשות מתאים שקופיות רכוב מדיה מימית ומסנני מתאים fluorophores משמש immunolabeling.</li>
	<li>כדי דמות את hindbrain שלם או מקטע hindbrain, השתמש עדשה של 10 x הגדלה (למשל, איור 2B); כדי להמחיש hindbrains אזורים על כימות, השתמש 40 X הגדלה (למשל, איור דו-ממדי) וכדי להמחיש תאים בודדים, השתמש עדשה עם 63 x הגדלה (למשל, איור 2C).</li>
</ol>8. שיטות אלטרנטיביות
<ol><li>בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל לייצר השעיה תא בודד עבור cytometry זרימה יישומים15.</li>
	<li>בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל לחלץ RNA לתא בודד המתלים עבור RT-qPCR (למשל, 16). הערה: ודא כל ראגנטים וציוד נשמרים וסטרילי, RNase-מתכווננים כדי למנוע השפלה של RNA.</li>
	<li>בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל כדי לבודד NPCs להפיץ אותם במבחנה כמו neurospheres לניתוח התנהגות NPC hindbrain17. הערה: ודא כל ראגנטים וציוד נשמרים סטרילי למניעת זיהום בקטריאלי/פטרייתי של תרבויות neurosphere.</li>
</ol>

<ol><li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li>
<li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF%2FLIF%2Fgp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li>
<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).</li>
<li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Genes+and+the+Hindbrain%3A+A+Study+in+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).</li>
<li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).</li>
<li>Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+mouse+hindbrain+as+a+qualitative+and+quantitative+model+for+studying+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.</a> Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).</li>
<li>Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+from+hindbrain+boundaries+regulates+neuronal+clustering+that+patterns+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis.</a> Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).</li>
<li>Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-9+controls+the+timing+of+neurogenesis+through+the+direct+inhibition+of+antagonistic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors.</a> Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).</li>
<li>Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgfbeta+signaling+regulates+temporal+neurogenesis+and+potency+of+neural+stem+cells+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS.</a> Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).</li>
<li>Jacob, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+acid+specifies+neuronal+identity+through+graded+expression+of+Ascl1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1.</a> Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).</li>
<li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).</li>
<li>Peretz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+of+hindbrain+boundaries+as+pools+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+regulated+by+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2.</a> BMC Biol. 14, 57(2016).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
<li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hutton, S. R., Pevny, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+levels+distinguish+between+neural+progenitor+populations+of+the+developing+dorsal+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon.</a> Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).</li>
<li>Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbr2+directs+conversion+of+radial+glia+into+basal+precursors+and+guides+neuronal+amplification+by+indirect+neurogenesis+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex.</a> Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nat Commun. 4, 2125(2013).</li>
<li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+macrophages+act+as+cellular+chaperones+for+vascular+anastomosis+downstream+of+VEGF-mediated+endothelial+tip+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction.</a> Blood. 116 (5), 829-840 (2010).</li>
<li>Kayam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Pax6+in+the+segmental+organization+of+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain.</a> Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).</li>
<li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li>
</ol>

אף אחד מחברי יש אינטרסים מתחרים או האינטרסים המתנגשים.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש hindbrain עובריים את העכבר כמודל ללמוד על מנגנוני נוירוג'נסיס התפתחותית. באמצעות מגוון של שיטות שונות immunolabeling, hindbrain NPCs ניתן לאבחן, המספר שלהם לכמת בסעיפים רקמות או לאורך איבר wholemounts. הקלות של דיסקציה של האנטומיה שטוח מבטיחה hindbrain יכול לדימות בהכנה 'ספר פתוח' ' כדי לאסוף מידע על דפוסי נוירוג'נסיס איבר רחב.
בהמשך נראה כי הקשורות מחזור התא NPC מיקום ומורפולוגיה NPC, ניתן בקלות לאבחן ב צף- או cryosections של hindbrain. שתי התנהגויות עלול לנצל כדי להגדיר אוכלוסיות חדשות קדמון, כמו בעבר בוצעה ב telencephalon בתרבית של20. לדוגמה, neuroepithelia Sox2+ מעוצב-מוקדם ו Pax6+ הפסגה רדיאלי עכשיו, דונלד נוכחים hindbrain21,22, אבל hindbrain חסרה אבות הבזליים Tbr2+ 3 .
ניתן להתאים כדי לבחון את אופן הפעולה של subpopulations NPC ספציפיים על-ידי תיוג פלורסנט הדמיה חיה ו/או מעקב אחר שושלת היוחסין ברקמות קבוע גם הפרוטוקול המתואר כאן. זו יכולה להיות מושגת, לדוגמה, על ידי לימוד hindbrains של עכברים נושאת את transgene Sox1-iCreERT2 טמוקסיפן-inducible ומן הכתב Rosa26tdTomato 23.
בנוסף להעשרת הידע נוירוג'נסיס מאתר, לומד את hindbrain עשוי להבהיר מנגנונים neurogenic בהרחבה רלוונטיים המשותפים בין המינים, מכיוון hindbrain אזור המוח מאוד שנשמרת צפוי להיות דומה יותר בין המינים חוליות מאשר הקדמי.
כפי hindbrain נוירוג'נסיס מתקיים על חלון זמן יחסית קצר יותר מאשר הקדמי נוירוג'נסיס23, חשוב לשקול הצורך השוואת שלמאחה מבוים עוברי. בהתאם לכך, הטיה ניסיוני הוא נמנע על ידי ספירת להקליט מספר זוגות somite העובר לפני בידוד hindbrain שלה. הרקמה hindbrain עצמה שביר ולא צריך מלקחיים ולכן יטופל בקפידה בעת הפרדת הרקמות hindbrain מזנכימה ראש, קרומי המוח; זוג 'תרגולים' ולכן ייתכן רצוי לפני ניתוח יקר עוברי מתבצע ניסיון. יתר על כן, hindbrains יועבר מהצינור אחד למשנהו באמצעות פיפטה פסטר נשא רחב ולא עם מלקחיים כדי למנוע נזק (הפתיחה של פיפטה הנקבעים על ידי חיתוך של הקצה עם מספריים נקי). לבסוף, נדירה יחסית, מידת השתלבות אדו/BrdU S-פאזי NPCs עלול להיות משתנה, במיוחד במהלך פולסים קצרים (כלומר, 1 h). כדי לשפר את תיוג, להבטיח כי עידו/BrdU התפרקה כראוי לפני טעינת הפתרון לתוך המזרק, להחדיר בזהירות לתוך חלל הצפק. זריקות המסכן, כגון אלה עשויים subcutaneously בטעות, לגרום לאבד או השמנה הפתרון אדו/BrdU ולמנוע אותו מלהיכנס את זרימת הדם.

במהלך התפתחות יונקים, לחלק NPCs חדרית (VZ), אזורי (SVZ) subventricular neuroepithelium מתרחבת כדי ליצור נוירונים חדשים בתהליך הנקרא 'נוירוג'נסיס'. הדור של נוירונים חדשים, מבשרי NPC שלהם נחקר בהרחבה הקדמי1, בעוד פחות ידוע על תהליך זה באזורים אחרים.
הקדמי הוא מקופל מסובכת ומורכבת מבנה, הוא למד בעיקר עם שיטות היסטולוגית לאחר חלוקתה רקמות, מה שהופך את ההבנה נוירוג'נסיס דפוסי מעבר כל האיבר מאתגר. בנוסף, מחקרים של הקדמי נוירוג'נסיס אינם בהכרח חזוי של התנהגות neurogenic באזורים אחרים במוח או בחוט השדרה. לדוגמה, אשר איתות רמזים עשוי להפיק תגובות שונות על-פני אזורים הנבדלים זה מזה CNS, כפי שנצפה במקרה של ciliary neurotrophic פקטור ו לוקמיה מעכבות פקטור, לקדם התחדשות עצמית של NPCs לרוחב קדושתו ganglionic, אבל נסיעה הבידול של חוט השדרה אבות2. יתר על כן, תת מחלקה של NPCs לאכלס הקדמי לפתח ולתרום באופן משמעותי הרחבה של קליפת המוח1 נעדרים hindbrain חוט השדרה3. . הפוך, זה מתקבל על הדעת כי חוט השדרה ואת hindbrain מכילים יחוברו NPC חלופית לא נוכח בקליפת.
Hindbrain העובר העכבר הוא האזור העתיק אבולוציונית של המוח יונקים ומייצר את המוח, גזע המוח. למרות שימור שלה על פני מינים, יחסית מעט מאוד ידוע על נוירוג'נסיס hindbrain, כולל תת NPC או תקנה שלהם. רוב המחקר hindbrain העכבר התמקדה התהליך של פילוח רקמות, מונע על ידי גנים Hox4ואת המתבנת של הנוירונים הפוסט-mitotic5. בנוסף, hindbrain שימש כמודל ללמוד את המנגנונים של אנגיוגנזה התפתחותי6.
בניגוד hindbrain העכבר, hindbrain דג זברה שימש בהרחבה לעקוב אחר NPC בידול והתקדמות שושלת היוחסין של אורגניזם מודל חוליות (למשל,7,8). הבחורה hindbrain ננקטה גם ללמוד נוירוג'נסיס במהלך הפיתוח חוליות (למשל,9,10). בדומה ה hindbrain דג זברה11, הבחורה hindbrain ניתן בשידור חי עם תמונה ללמוד התנהגות NPC ורגולציה לאורך זמן12. תצפית אורכית מקבילה על ידי הדמיה חיה אינה אפשרית כיום אורגניזמים יונקים, כי הם מפתחים ברחם. יתר על כן, ממוקד מניפולציה באמצעות טכניקות כגון אלקטרופורציה ניתן להחיל בקלות על עוברי דג זברה אל-אווירני עצמאי או אפרוח עוברי ב ovo (למשל,13), אבל טכניקות אלה הם גם יותר מאתגרת ב . פשוט תאכל.
למרות זאת, hindbrain העובר העכבר מתאימה להפליא כדי להגדיר את המנגנונים המולקולריים הסלולר המפקחים נוירוג'נסיס. ראשית, ניתוח של hindbrain העכבר, במקרים רבים, יספק מידע שהוא רלוונטי יותר להתפתחויות בני אדם מזה שהושג דרך לימוד חולייתנים התחתון. יתר על כן, מספר עצום של זנים מהונדסים העכבר זמינים כי יכול גם לשמש לגורל מיפוי NPCs מאתר או לשנות את מנגנוני הרגולציה אללים mutant מכוננת או מותנה של גנים הרלוונטיים. ולבסוף, לאחרונה הוכח כי microinjection של hindbrain חדרית אבות שמחוץ מאפשר לפחות בדיקה קצרה של hindbrain NPC קינטיקה14. עדיין, כיום, מעט מאוד ידוע על הארגון ייתכן ועל ההתנהגות של hindbrain NPCs בהקשר כל האיבר.
. הנה, נדגים שיטה פשוטה ומהירה לשימוש את hindbrain כמודל עוצמה לניתוח התנהגות NPC בתרבית של ההכנות wholemount ומקטעים רקמות. אנו מספקים נוסף פרוטוקולים להשתמש immunolabeling ללמוד פרמטרים שונים נוירוג'נסיס תהליך hindbrain דגימות נוספות ליישומים מולקולרית במורד הזרם כגון כמותיים רוורס טרנסקריפטאז (לרביעיית)-PCR.

<table><tbody><tr><td>צינור ריאגנט עם תחתית עגולה, 2.0 מ"ל (נעילה בטוחה)</td> <td>VWR</td><td>211-2120</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים מפלסטיק, 60 מ"מ</td><td>תרמו פישר</td><td>150288</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים,</td><td>תרמו פישר</td><td></td> 12 בארות <td>150628 זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>קופאן</td><td>200C</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>מלקחיים של Dumont Watchmaker, מס' 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של Dumont Watchmaker, מס' 55</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>29G מחט/מזרק</td><td>BD</td><td>BD Micro-Fine +1 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני נגד פוספו-היסטון H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>עז, דילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני נגד BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>עכברוש, דילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני Anti-Ki67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>עכבר, דילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני נגד RC2</td><td>מחקרים התפתחותיים עכבר היברידומה בנק</td><td>RC2</td><td>(IgM), דילול 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-מצומד עז אנטי ארנב נוגדן משני</td><td>תרמו פישר</td><td>A11029</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-מצומד עז אנטי ארנב נוגדן משני</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11037</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-מצומד עז אנטי עכבר IgM נוגדן משני</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21042</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-מצומד עז אנטי עכבר נוגדן משני</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-מצומד עז אנטי חולדה נוגדן משני</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11007</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>שימוש ב-10 &mu; גרם למ"ל</td></tr><tr><td>5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)</td><td>Sigma</td><td>900584</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-2&acute;-deoxyuridine (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 ערכת הדמיה</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10086</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים מומת בחום</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DAKO ללא חלבון בלוק סרום</td><td>Agilent</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>נתרן טטרבוראט</td><td>סיגמא</td><td>B9876</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S0389</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>חוסם נוזלים עט Super PAP</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Antifade Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>S-2828</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10337700</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Millipore</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Scigen</td><td>4583</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>תרמו פישר</td><td>10675112</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>תרמו פישר</td><td>10316380</td><td>זמין גם מספקים מסחריים אחרים</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td>631-0912</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>מדחום</td><td>VWR</td><td>620-0858</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו, Leica MZ16</td><td>Leica</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי&nbsp; LSM710</td><td>Zeiss</td><td>לא ישים</td><td></td></tr></tbody></table>

העכבר hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

העכבר עובר הקדמי היא מערכת הנפוצות ביותר ללמוד נוירוג'נסיס יונקים במהלך הפיתוח. עם זאת, neuroepithelium הקדמי מאוד מקופל אינה לבצע ניתוח wholemount לבחון דפוסי נוירוג'נסיס איבר רחב. יתר על כן, הגדרת המנגנון של הקדמי נוירוג'נסיס אינה בהכרח חזוי של נוירוג'נסיס בחלקים אחרים של המוח; לדוגמה, בשל נוכחותם של תתי סוגים ספציפיים הקדמי קדמון. העכבר hindbrain מספק מודל אלטרנטיבי ללמוד נוירוג'נסיס עובריים זה לבצע ניתוח wholemount, כמו גם רקמות מקטעים כדי לבחון את התפלגות ייתכן וההתנהגות של אבות עצבית. יתר על כן, זה הוא בקלות גזור עבור יישומים אחרים במורד הזרם, כגון ניתוח בידוד או ביולוגיה מולקולרית של התא. כפי hindbrain העכבר ניתן לנתח בקלות במספר העצום של כתב היוחסין תא וללחצים בעכבר מוטנט שהפכו זמינים, הוא מציע מודל חזק לימוד מנגנונים תאית ומולקולרית נוירוג'נסיס התפתחותית ב מידע יונקים . אורגניזם. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לשימוש hindbrain העובר את העכבר עבור ניתוח בתרבית של קדמון עצבית בהתנהגות התא (NPC) ב wholemount ההכנות ומקטעים רקמות.

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות ניתן להשיג כשלמדתי נוירוג'נסיס ב hindbrain עובריים העכבר דרך ניתוח סעיף wholemount ורקמות.
אנו מראים את immunolabeling wholemount של hindbrain microdissected עם נוגדן עבור pHH3 סמן mitotic מדמיין חלוקת NPCs ב VZ (איור 2B – D). אנחנו מראים pHH3+ NPCs בהגדלה כדי להדגיש שלבים שונים של מיטוזה (איור 2C). לנו יש מאויר זה תיוג בשיטה זו מתאים שיבוצע על פני מספר שלבים רצופים של פיתוח hindbrain לבחון את מהלך הזמן NPC מיטוזה באיבר זה (איור דו-ממדי).
אנחנו מראים כי הדמיה immunolabeled רוחבי vibratome חלקים hindbrain 1 h לאחר ההזרקה אדו, מדמיין את הכיוון המחשוף של mitotic NPCs (איור 3B), התבנית ההעברה גרעיני pseudostratified, interkinetic של רכיבה על אופניים אבות18 (איור 3B, D), המבנה VZ הכולל (איור 3B – D). שימו לב כי pHH3 mitotic+ NPCs נמצאים רק על פני השטח חדרית, לא יותר basally (איור 3C), אשר ניגודים הדפוס חטיבת הבזליים של NPCs מחויב יותר הקדמי19.
אנחנו גם מדגימים איך רכיבה על אופניים NPCs ואת צאצאיהן הבדיל ניתן שכותרתו עם BrdU או EdU כדי להעריך את התקדמות שושלת היוחסין NPC (איור 4). Immunolabeling של cryosections רוחבי של hindbrain העכבר 1 יום לאחר ההזרקה BrdU עבור BrdU ו Ki67מדגים המספר ובמיקום של טיולי אופניים NPCs neuroepithelium (איור 4A, B), לפיה המספר חידוש עצמי NPCs יכולה להיות מוגדרת על-ידי חישוב אחוז Ki67+ BrdU+ תאים בין כל התאים BrdU+ (איור 4A, ג).
לבסוף, אנו מראים דוגמה immunolabeling סעיפים vibratome hindbrain עבור RC2, אנטיגן של חוט הלהט ביניים עצבית ספציפית nestin, לדמיין NPC endfeet (איור 5B) ותהליכים (איור 5C). קטעים Vibratome, במקום cryosections דק, לאפשר תצפית משופרת של NPCs מסועף מאוד וגם המבנה הכללי של neuroepithelial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> איור 1 : המפתח נכנס ניתוח hindbrain מעוּבּר העכבר e11.5. (A – D) תיאור סכמטי של hindbrain microdissection. (א) הרקמה ראש סימטרית יוסר על ידי ניתוק לאורך הקווים המנוקדים אדום. (B) הצלחת גג פירסינג, אז נקרע משם הן rostral והן סימטרית הכיוונים לאורך הקו האמצעי (קווים אדומים אנכי) ולאחר מכן רוחבית כדי לחשוף את neuroepithelium hindbrain. (ג) neuroepithelium זה לחטט הרחק קרומי המוח לאחר הוספת המלקחיים שבין שני המבנים, רקמות המוח האמצעי חוט השדרה מוסרות באמצעות ניתוק הרקמה עם המלקחיים לאורך הקווים המנוקדים אדום. (ד) הליך זה מניב hindbrain שעברו שיטוח. (E–K) לכידת תמונה של השלבים העיקריים בהליך hindbrain microdissection. (E) העובר הוא ערף באמצעות ניתוק לאורך הקו המנוקד. (F) hindbrain את החדרth 4, המוקפים צלחת הגג, הן טוחנות ואת הופרדו הראש באמצעות ניתוק לאורך הקווים המקווקווים. (G) הנוזליםth 4 הוא orientated כלפי מעלה לפני חור קטן היא מנוקבת על המשקולת גג (כוכבית). החור מורחב על ידי פילינג הרקמה בקפידה גם rostrally וגם הקליפה לאורך הקו האמצעי (חיצים) לחשוף את hindbrain. Hindbrain הוא ממוקם בצד pial למטה, משמאל שמתקפל לתוך הכנת ספר פתוח (H; שחור ראש החץ מצביע על רקמה עצבית hindbrain). אם hindbrain נדרשת עבור wholemount immunolabeling, קרום pial תוסר מסען בעדינות את neuroepithelium hindbrain של הממברנות של קרום המוח שמסביב באמצעות מלקחיים (אני). עודף המוח האמצעי (mb) וחוט השדרה (sc) רקמה היא שהוסר (קווים מנוקדים ב J) כדי לבודד את hindbrain (K). סרגל קנה מידה: מיקרומטר 500 עבור (E), 300 מיקרומטר עבור ( KF – ). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> איור 2 : Wholemount immunolabeling יכול לשמש כדי לכמת NPC mitoses על פני hindbrain. (א) מפרטים טכניים הממחישות en פנים הדמיה של NPCs mitotic לשכבת hindbrain חדרית. V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. (B) סריקה אריח קונאפוקלית z ערימת hindbrain e10.5 בעקבות wholemount immunolabeling עבור mitotic סמן pHH3 (אדום). התיבה הלבנה מציינת את האזור מוצג בהגדלה גבוהה יותר בלוח השני (D). (ג) קדם "אנאפאזה" (ראש חץ לבן) ודמויות mitotic "אנאפאזה" (ראש חץ שחור) הם ניתן להבחנה בתוך קבוצה הכוללת כמובן mitotic NPCs. (D) הזמן של wholemount pHH3 תיוג של e9.5-13.5. גודל ברים: 500 מיקרומטר (B); מיקרומטר 20 ב (ג); 100 מיקרומטר (D). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> איור 3 : NPCs רכיבה על אופניים באזור נבטי שלהם ב hindbrain rostral. (א) מפרטים טכניים המתארים את המיקום של mitotic (ירוק) ו- S-פאזי (אדום) NPCs על פני חדרית hindbrain, באזור periventricular, בהתאמה. חתך וירטואלי דרך hindbrain מוצג בהגדלה גבוהה יותר בצד הימין. החץ השחור מציין את כיוון העברת צאצאי NPC זה סוגר את הדפדפן את מחזור התא לעבר אזור בידול. (B) מחסנית z קונאפוקלית של מקטע hindbrain e11.0 צף מעוּבּר קיבל ה 1 אדו הדופק; immunolabeling pHH3, עידו שימש כדי להמחיש mitotic (ירוק) ו- NPCs S-פאזי (אדום), בהתאמה. Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. האזור שצוין על-ידי תיבה לבנה מוצג בהגדלה גבוהה יותר ב- שיבוץ; חיצים מציינים מישור המחשוף NPC ב "אנאפאזה", ביחס השטח חדרית. (ג) ערוץ יחיד הצגת pHH3 immunolabeling בלבד. Mitotic NPCs מסומנים באמצעות חץ ציאן; העדר חטיבות הבזליים מציינים Δ. (D) ערוץ יחיד הצגת אדו תיוג בלבד. אדו+ NPCs לאמץ התפלגות pseudostratified עקב ההגירה גרעיני interkinetic שלהם. המרחק NPCs להעביר מהמשטח חדרית ניתן למדוד, כמצוין בקו הכתום מייצג. גודל ברים: 100 מיקרומטר ב (B -D); 10 מיקרומטר בשיבוץ (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> איור 4 : שילוב BrdU עם Ki67 תיוג כדי לקבוע hindbrain NPC התחדשות עצמית הקיבולת. (א) z קונאפוקלית ערימת cryosection hindbrain e10.5 לאחר תיוג Ki67 (ירוק), BrdU (אדום) בעקבות יום 1 BrdU דופק. תאי זוגית-חיובי באזור חדרית הם NPCs שילבו BrdU והוא עדיין עוברים דרך מחזור התא, כמצוין על-ידי תיוג Ki67. היחס של התווית על-ידי שני תאים בין מכלל האוכלוסייה BrdU+ מייצג את אחוז עצמי המתחדש NPCs. (B, C) יחיד ערוצי הצגת Ki67 (B), BrdU (ג) immunolabeling בלבד. תא BrdU+ חסר Ki67, ולכן סביר להניח ביצע את מחזור התא מציינים לצורת ראש חץ ציאן (A,C). Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> איור 5 : Nestin immunolabeling מדמיין תהליכי NPC, endfeet. (A – C) Immunofluorescence עבור RC2, אשר מזהה את epitope על חוט הלהט ביניים עצבית nestin, מדגים NPC מורפולוגיה לרוחב neuroepithelium hindbrain. (א) מחסנית z קונאפוקלית של מקטע צף מ hindbrain e11.5 בעקבות RC2 immunolabeling; התחומים מוצגים בהגדלה גבוהה יותר ב (ב', ב'; אזור הפסגה/חדרית) ו- (C, ג '; הבזליים אזור). Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. (B, C) Z קונאפוקלית ערימות של התחומים ב- (א); מוצגים קטעים אופטי יחיד (ב', סי '), בהתאמה. Endfoot הפסגה NPC מעוגן על פני חדרית מסומן על ידי חץ (ב'). NPC fasciculated ותהליכי יחיד מסומנים באמצעות ראשי חץ שחור ולבן ב (סי '), בהתאמה. גודל ברים: 100 מיקרומטר, (א); מיקרומטר 25 (ב, ג). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

מאמר זה מדגים כיצד hindbrain עובריים העכבר יכול לשמש כמודל לומד נוירוג'נסיס התפתחותית כל האיבר והן ההכנות בסעיף רקמות.

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר ניתוח איבר שלם והיסטולוגי של המוח האחורי העוברי של העכבר במהלך ההתפתחות. שיטה זו מאפשרת לחקור התפתחויות על נוירוגנזה במוח האחורי של אורגניזם מודל של יונקים. המוח האחורי של העכבר המתפתח הוא מודל מצוין לחקר הפעילות של פרוגנזה עצבית בשל הארכיטקטורה השטוחה שלו המאפשרת התבוננות בדפוסי נוירוגנזה על פני האיבר כולו.התחל הליך זה בהמתת חסד של עכברה בהריון מתוזמן באמצעות הליך מאושר אתית בשלב ההריון הנדרש. בעזרת מספריים חדים חותכים את חלל הצפק וכורתים בזהירות את הרחם. הנח את הרחם הכרות המכיל את העוברים בכלי פלסטיק בגודל 60 מילימטר המכיל 20 מיליליטר PBS קר כקרח.בצע את כל הנתיחה הנוספת באמצעות מיקרוסקופ חיתוך. בעזרת מלקחיים מספר חמש, קרעו את דופן שריר הרחם כדי לחשוף את העוברים. שחרר כל עובר על ידי ניתוק חבל הטבור והסר את שק החלמון.לאחר העברת כל עובר לכלי פלסטיק נקי עם PBS קר כקרח, השתמש במלקחיים מספר 55 של Watchmaker כדי לחתוך את הראש. לחלופין, שמור על פיסת רקמה קטנה לבידוד DNA גנומי וגנוטיפ לאחר מכן. באמצעות מלקחיים מספר 55 של Watchmaker, כרתו את הרקמה המכילה את המוח האחורי במקביל ומיד מתחת לאפיתל הנוירולוגי של המוח האחורי כדי להפריד אותו מרקמת הפנים והמוח הקדמי.מקם את רקמת המוח האחורי וראש הזנב, הצד הגבי כלפי מעלה וזהה את החדר הרביעי המכוסה בשכבת רקמה דקה המכונה לוחית הגג. חוררים בזהירות את לוחית הגג באמצעות מלקחיים מספר 55 של השען ומקלפים רקמות עודפות בעזרת מלקחיים, נעים לאורך קו האמצע מעל המוח האמצעי ולאחר מכן בזנב מעל המוח האחורי וחוט השדרה. כעת יש לחשוף את המוח האחורי בהכנה לספר פתוח.כדי להכין את המוח האחורי לתיוג חיסוני שלם, השתמש במלקחיים מספר 55 של שען כדי להקניט בזהירות את הראש הנותר של המזנכימה וכל קרומי המוח המחוברים לצד הקליפה של המוח האחורי. הסר את רקמת המוח התיכון וחוט השדרה כדי להשאיר רק את רקמת המוח האחורי. כדי להכין את המוח האחורי לחתך ויברטום וקריו, השתמש במלקחיים מספר 55 של Watchmaker כדי להסיר את רקמת המוח התיכון וחוט השדרה.העבירו את המוח האחורי מכלי הפלסטיק לצינורות עגולים של שני מיליליטר בעזרת פיפטה של פסטר. לאחר שאיבת כל ה-PBS, קבע את המוח האחורי למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה במשקל 4% מופשר טרי לנפח פורמלדהיד מומס ב-PBS. לבסוף, שטפו את המוח האחורי שלוש פעמים עם PBS.במידת הצורך, החזר לחות למוח האחורי בהפחתה סדרתית של אשליות של מתנול ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בכל ריכוז. לאחר מכן, העבר למוח האחורי ל-PBS. לחדור את המוח האחורי למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ב-PBS המכיל PBT עם תסיסה עדינה.לאחר מכן דגרו על המוח האחורי למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס ב-PBT המכיל סרום עיזים מושבת בחום של 10%. לאחר מכן, דגרו על המוח האחורי למשך הלילה כמו קודם ב-PBT המכיל 1% סרום מומת בחום ונוגדנים ראשוניים. למחרת, שטפו את המוח האחורי בארבע מעלות צלזיוס עם PBT למשך שעה כל אחד.לאחר השטיפה, דגרו את המוח האחורי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ב-PBT המכילים את הנוגדנים המשניים המצומדים המתאימים לפלואורופור המכוונים כנגד הנוגדנים העיקריים בהם נעשה שימוש. שמור את המוח האחורי בחושך מנקודה זו והלאה כדי להגן על הפלואורופורים מפני פוטוהלבנה. לאחר שטיפה כמו קודם עם PBT, יש לתקן את המוח האחורי בפורמלדהיד 4% ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לשימור ארוך טווח של קשירת הנוגדנים.בינתיים, כסו שקופית מיקרוסקופ זכוכית בשתי שכבות של סרט חשמלי שחור והוציאו ריבוע קטן מהסרט השכבתי כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי להחזיק את המוח האחורי. לאחר שטיפה קצרה של המוח האחורי פעמיים ב-PBS, העבירו אותו לכיס בעזרת פיפטה פסטר. הסר את עודפי הנוזלים והוסף לכיס מגיב מתאים נגד דהייה.לאחר מכן כסו לאט את המוח האחורי בכיסוי זכוכית כדי למנוע לכידת בועות אוויר מתחת לכיסוי. אטום את הכיסוי והצמד אותו לשקופית בשכבה דקה של לק. אחסן את השקופית בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לקבלת התמונה.הטמיעו מוחות אחוריים באגרוז מותך במשקל של 3% לנפח שהוכן במים מזוקקים. Cut מעביר קטעי מוח אחורי לעובי של 70 מיקרון באמצעות ויברטום. מעבירים כל חלק חתוך טרי בעזרת מברשת צבע לבאר אחת של צלחת 24 באר המכילה PBS קר כקרח.לאחר תיוג החלקים הצפים כמפורט בפרוטוקול הטקסט, שטפו אותם לזמן קצר ב-PBS. העבירו בזהירות חלקים צפים לשקופית מיקרוסקופ זכוכית בעזרת מברשת. נגב את עודפי ה-PBS סביב החלק באמצעות נייר סופגים או טישו.לא הסעיפים המשתמשים ב-80% גליצרול ב-PBS. וכסו אותם לאט עם כיסוי זכוכית כדי למנוע לכידת בועות אוויר. אחסן את השקופית בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לקבלת התמונה.דגרו על המוח האחורי ב-30% משקל לנפח סוכרוז ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס כדי להגן על המוח האחורי לפני ההקפאה. טבלו את המוח האחורי בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטית או OCT. לאחר מכן, הקפיאו אותם במהירות על ידי העברת התבניות המכילות את הגשמים האחוריים לאיזופנטן שהתקרר בין 40 ל-50 מעלות צלזיוס על קרח יבש.לאחר מכן, חתוך את חלקי המוח האחורי העוברים לעובי של 10 מיקרון באמצעות קריוסטט. העבירו את חלקי המוח האחורי לשקופיות מיקרוסקופ דביקות אלקטרוסטטית. דגרו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לייבוש החלקים למגלשות.לאחר מכן שטפו את חלקי הקריו עם PBS כדי להמיס את ה-OCT. סמנו מחסום הידרופובי סביב קטעי קריו באמצעות עט PAP. צלם את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר אפי-פלואורסצנטי או קונפוקלי המצויד בעדשות המתאימות לשקופיות המותקנות על מדיה מימית וכן מסננים אופטיים המתאימים לפלואורופורים המשמשים לתיוג חיסוני.כדי לצלם חלק שלם של המוח האחורי או של המוח האחורי, השתמש בעדשה להגדלה פי 10. כדי לדמיין אזורים במוח האחורי לצורך כימות השתמש בהגדלה פי 40. וכדי לדמיין תאים בודדים, השתמש בעדשה עם הגדלה פי 63.מוצגות כאן תוצאות מייצגות ממוחות אחוריים בעלי תווית חיסונית שלמה כדי לצפות בתאי אב עצביים מתחלקים באזור החדר. תמונות אלו התקבלו על ידי שימוש בסמן המיטוטי פוספו היסטון H3 בשלבי התפתחות עוקבים. קטעי ויברטום רוחביים סומנו לאחר פעימה של שעה של EdU כדי להדגיש תאי אב עצביים במוח האחורי העוברים נדידה גרעינית בין-קינטית, כמו גם תאים חיוביים לפוספו-היסטון H3 מיטוטיים על פני החדר.ניתן לקבוע את השיעור הכולל של תאי אב עצביים המתחדשים מעצמם על ידי חישוב אחוז התאים החיוביים הכפולים של Ki67 BrdU בצהוב בין כל התאים החיוביים ל-BrdU באדום וצהוב בקטעי קריו רוחביים של המוח האחורי מעוברים יום לאחר מתן BrdU. קטעי ויברטום במוח האחורי יכולים להיות מסומנים גם במערכת חיסון עם נוגדן לחלבון נימה ביניים נסטין הידוע גם בשם RC-2 כדי לדמיין את קצות תאי האב העצבי ובליטות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח תכשיר שטוח או קטעי רקמה רוחביים של המוח האחורי.לאחר השליטה, ניתן לנתח עד 10 מוחות אחוריים תוך פחות משעה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש ב-PBS קר כקרח אם מכירים תחילה את המיקרו-דיסקציה של המוח האחורי מכיוון שהדבר מקל על ההפרדה מקרומי המוח, בנוסף להבטחת שימור הרקמות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זרימה ציטומטרית על תרחיפי תאים בודדים של המוח האחורי כדי להפריד אבות עצביים מסוגי תאים אחרים.ביסוס טכניקה זו סלל את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית לחקור מנגנונים של נוירוגנזה של יונקים על ידי שימוש במוח האחורי כחלופה למודלים המקובלים של חוט השדרה והמוח הקדמי. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נוירוגנזה של מוח אחורי של יונקים, אך ניתן ליישם אותה גם על בעלי חוליות מתפתחים אחרים בהתחשב במידת הדמיון המבני והמולקולרי בין המינים. טכניקה זו עשויה לסייע בגילוי מנגנונים חדשים השולטים בנוירוגנזה ולעזור לקבוע אם אלה שזוהו במקומות אחרים בציר מסוכמים בחלק זה של מוח החולייתנים.

the-mouse-hindbrain-as-a-model-for-studying-embryonic-neurogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה לייצר פרוסות organotypic מן המוח התיכון E12.5 העוברי Murine מתואר. תרבויות פרוסה organotypic ניתן להשתמש כדי לבחון את התנהגות של נוירונים דופאמינרגיים או נוירונים המוח התיכון הגחון.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

סרטון זה מציג שיטה ליצירת מבשרי אינטרנוירונים קורטיקליים מתאי גזע עובריים של עכברים. הפרוטוקול כולל גידול תאי גזע במדיה המכילה מעכבי מולקולות קטנות ספציפיות, המאפשרים התרבות תאי גזע וצבירה לגופי עובר (EBs). לאחר מכן, EBs מנותקים עם אנזימים ומצופים על בארות צלחת תרבית מצופים חלבוני הידבקות כדי לקדם את התמיינותם למבשרי אינטרנוירון קליפת המוח.

יצירת מבשרי אינטרנוירון קורטיקליים מתאי גזע עובריים של עכברים

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

שיטות למניפולציה והניתוח של neurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר NF-κB תלוי מתוארות. פרוטוקול מפורט מוצג לבדיקה משוננת gyrus תלוי התנהגותי (שמכונה במבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי) לחקירת תוצאה קוגניטיבית בעכברים. טכניקה זו צריכה גם לעזור לאפשר חקירות בהגדרות ניסיוניות אחרות.

שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של הצינור העצבי, אבל להעביר להגיע למטרות מתאימות. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) הם מודל שימושי ללמוד נדידת נוירונים. פרוטוקול זה מתאר את wholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר עכבר כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את נדידת FBM.

עכבר המוח האחורי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר הגירת Branchiomotor Neuron פנים

מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למדו נוירוג'נסיס עוברי במוח האחורי של עכברים באמצעות הכנת איברים שלמים וחתכים היסטולוגיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור תבניות של התפתחות עצבית במודל יונקים.

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

גלה סרטונים נוספים