פרוטוקול ניסיוני לזיהוי תפקוד מיטוכונדריאלי בהפטוציטים שנחשפו לחומרי הדברה אורגנוכלורין
16 בספטמבר 2020
הבנת ההשפעה של חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) על תפקוד המיטוכונדריאלי בהפטוציטים חשוב לחקור את המנגנון של OCPs גורם להפרעות מטבוליות. נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי פונקציית המיטוכונדריה הכבד.
זה מסר שמתקשר לענות על שאלת מפתח שיש לך גם פונקציה של שדה כגון רמת ATP ואת שיעורי צריכת החמצן. החדש או הישן בעמוד אחד, טכניקה זו היא שזה קל לבצע וזה הרבה להערכה מיוחדת של תפקוד המיטוכונדריאלי הסלולר. כדי להתחיל את הניסוי הזה, זרע 20, 000 תאי HepG2 בצלחת פטרי בתחתית זכוכית.
הוסף בטא-hexachlorcyclohexane או B-HCH באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים CO2 במשך 24 שעות. הכן פתרון בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי אחד על ידי הוספת DMSO נטול מים למדיום תרבות התאים של DMEM. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד למנה של פתרון זה לתאים במנות פטרי תחתון זכוכית.
ותגרה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי מהתאים. מוסיפים מיליליטר אחד למנה של טרי מוכן ב 37 מעלות צלזיוס DMEM תאים בינוני.
כדי לזהות פלואורסצנטיות ירוקה במיטוכונדריה, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי. כדי להעריך את רמות ATP הסלולר, זרע ל 20, 000 תאי HepG2 בשש צלחות גם. מוסיפים בטא-HCH ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לתאים בכל באר. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהמשיך עם איסוף על טבעי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 100 מאגר זיהוי ATP microliters לצלחת.
הוסף 100 מיקרוליטרים של תא שנאסף על-טבעי לצלחת באר 96 בטמפרטורת החדר והמשיך לזהות ATP סלולרי על ידי מד זוהר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. להערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי, לגדל תאי HepG2 בשש צלחות גם עם תוספת של בטא HCH, כפי שתואר קודם לכן. לאסוף את התאים על ידי עיכול אותם עם 0.5 מיליליטר 0.25% EDTA במשך דקה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
הוסף DMEM מיליליטר אחד כדי לעצור את העיכול ולהעביר את התאים המתעכלים לצינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. לדלל את גלולת התא עם 0.5 מיליליטר של תאים בינוני ו 0.5 מיליליטר JC1 מיטוכונדריאלי קרום צבע פוטנציאלי.
ודגירה במשך 20 דקות ב37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 600 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את גלולת התא על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר צנטריפוגה גלולה שטף, להסיר את supernatant.
ולהשעות מחדש את גלולה ב 0.5 מיליליטר של חיץ צביעה JC1. נתח את התאים המוכתמים JC1 באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לזהות פלואורסצנטיות ירוקה ואדום. כאשר מונומר JC1 מזוהה, להגדיר את אור העירור ל 490 ננומטר ואת אור הפליטה ל 530 ננומטר.
כאשר פולימר JC1 מזוהה, להגדיר את אור העירור ל 525 ננומטר ואת אור הפליטה ל 590 ננומטר. כדי לנתח את קצב צריכת החמצן, זרע תאי HepG2 בצלחת תרבות תאים 96 היטב בצפיפות של 4, 500 תאים לכל 100 microliters ל הבאר. לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ודא כי התאים בכל באר מכוסים בינוני.
לפני הפעלת תוכנת זיהוי תווים אופטי (OCR) , טען את המיקרו-פלטה עם המחסנית ואת לוחית תא התרבות לתוך מנתח שטף חוץ-תאי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פתח את תוכנת זיהוי תווים אופטי (OCR) ובתפריט הנפתח של האפליקציות, בחר בערכת בדיקת הלחץ של ה-mito של התא ולחץ על לחצן אפליקציית 'התחל'. לאחר מכן, לחץ על כפתור בדיקת הלחץ לרוץ.
כאשר מופיע מסך בדיקת הלחץ של התא, הזן את מספר התאים שזורעים ל הבאר בתיבה מספר זריעת תאים ואת זיהוי תווים אופטי (OCR) הממוצע בתיבה ממוצעת של זיהוי תווים אופטי (OCR) של תאים בזלתיים. הזן את ריכוז העבודה הסופי עבור כל רהגנט ולאחר מכן להזריק את reagents. לחץ על הכפתור הבא.
כאשר מסך פרטי הקבוצה מופיע, הקצה קבוצה ל בארות שלא הוקצו על-ידי בחירת צבע ומתן שם. לאחר מכן לחץ על הבאר המתאימה. לחץ על הכפתור הבא ובמסך פריסת הזרקת מבחן הלחץ שמופיע, לחץ על להתחיל להפעיל את בדיקת הלחץ על המנתח.
לאחר הריצה שהושלמה, בצע את ההנחיות בתוכנה ולאחר מכן הסר ומחק את המחסנית ואת לוח התא. העוצמה הממוצעת של כתמי פלואורסצנט ירוק מיטוכונדריאלי ירד בתאי HepG2 חשופים בטא HCH. זה מראה כי יש ירידה במספר המיטוכונדריה וגידול המיטוכונדריה פגום עולה בקנה אחד עם הגידול בריכוז חומרי הדברה.
יתר על כן, רמות ATP בתאי HepG2 ירדו עם ריכוזים מוגברים של חשיפה בטא HCH, מראה את הפונקציה ירדה של המיטוכונדריה בתאים אלה. לאחר כתמי JC1 עבור פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי, או MMP, ציטומטר זרימה הראה פלואורסצנטיות JC1 ירוק אדום גבוה בתאי HepG2 שלמים. זאת בשל נוכחותם של אגרגטים אדומים פלואורסצנטיים JC1, שהם סימן של MMP גבוה.
בתאים שטופלו בבטא-HCH, פלואורסצנטיות JC1 ירוקה אדומה ירדה עקב נוכחות של מונומרים ירוקים פלואורסצנטיים JC1, סימן של MMP נמוך. לבסוף, שיעור צריכת החמצן ירד גם עם הריכוזים המוגברים של חשיפה בטא HCH, עוד יותר מראה כי הדברה זו פוגעת בתפקוד המיטוכונדריאלי תקין. נו, טוב, לנסות להליך זה, זה חשוב אם כי, לזכור לראות את התאים המתאימים כדי לבדוק את זה.
לאחר התפתחותו, זה בהחלט סולל דרך למחקרים בתחום התפקוד הבסיסי לחקור אורגניזמים רלוונטיים בתפקיד הרפואי הקשור אליו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לזהות כמות או איכות, קיבולת, עכשיו חבר או פוטנציאל תחת פונקציית גיליון זרבובית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה חוקר את ההשפעה של חומרי הדברה אורגנוכלוריים (OCP) על התפקוד המיטוכונדריאלי בתאי כבד, אשר חיוני להבנת ההפרעות המטבוליות הקשורות לחשיפה ל-OCP. המאמר מתאר שיטות להערכת התפקוד המיטוכונדריאלי בכבד.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה תאית
- טוקסיקולוגיה
רקע
- חומרי הדברה אורגנוכלוריים ידועים כמשפיעים על תהליכים מטבוליים.
- התפקוד המיטוכונדריאלי חיוני למטבוליזם האנרגיה התאייתי.
- הבנת ההשפעות הללו יכולה לסייע בהתמודדות עם הפרעות מטבוליות.
- תאי HepG2 משמשים כמודל לחקר תפקוד הכבד.
מטרת המחקר
- לחקור כיצד OCP משפיעים על התפקוד המיטוכונדריאלי בתאי כבד.
- לספק מתודולוגיה להערכת הפעילות המיטוכונדריאלית.
- לתרום להבנת הפרעות מטבוליות הנגרמות על ידי רעלים סביבתיים.
שיטות ששימשו
- זריעת תאי HepG2 בצלחות פטרי עם תחתית זכוכית.
- דגירה של תאים עם בטא-הקסאכלורציקלוהקסאן (B-HCH).
- שימוש בחלחלת פלואורסצנטית ירוקה מיטוכונדריאלית להערכת התפקוד.
- מדידת רמות ATP ושיעורי צריכת חמצן.
תוצאות עיקריות
- המחקר מספק מתודולוגיה ברורה להערכת התפקוד המיטוכונדריאלי.
- התוצאות מצביעות על השפעות משמעותיות של OCP על הפעילות המיטוכונדריאלית.
- הממצאים תורמים להבנת הפרעות מטבוליות.
- מוכיחים את התועלת של תאי HepG2 במחקרים טוקסיקולוגיים.
מסקנות
- לחומרי הדברה אורגנוכלוריים הסביבתיים יש השפעה מדידה על התפקוד המיטוכונדריאלי.
- הבנת ההשפעות הללו חיונית להתמודדות עם בריאות מטבולית.
- השיטות המתוארות ניתנות ליישום במחקרים נוספים על רעלים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial function in hepatocytes exposed to environmental toxins provides early mechanistic insights into metabolic disorder risk. Quantitative readouts such as ATP levels, oxygen consumption rate, and membrane potential enable predictive de-risking of compound-induced mitochondrial liability. This supports target validation and lead identification by clarifying organ-specific toxicological pathways relevant to drug safety profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking pesticide exposure to mitochondrial dysfunction in a human liver model.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of bioenergetic parameters in HepG2 cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that impair mitochondrial respiration and energy production.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated hepatocyte systems for downstream screening by establishing baseline mitochondrial health.
- Operational Value: Standardizes assay readouts including fluorescence intensity, ATP luminescence, JC-1 ratio, and OCR for reproducible compound evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse across toxicology studies due to standardized seeding, exposure, and detection protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling OCP-induced mitochondrial damage in hepatocytes.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation using consistent functional endpoints.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying mitochondrial impairment across concentration ranges.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative mitochondrial readouts that inform early go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring ATP, OCR, and MMP as functional outputs of mitochondrial health.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible quantification of mitochondrial function in toxin-exposed hepatocytes.
- Analytics: Generates comparable datasets via luminometric ATP detection, flow cytometric JC-1 analysis, and extracellular flux OCR measurements.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using HepG2 cells as a translational model for liver-specific mitochondrial toxicity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for assessing mitochondrial liability across compound libraries and environmental toxin panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial toxicity assessment.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined probe concentrations, incubation times, and instrument settings.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional data on bioenergetic disruption.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative mitochondrial functional thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and extracellular flux analysis.
- Dependent on instrumentation including confocal microscopes, luminometers, flow cytometers, and Seahorse analyzers.
- Necessitates cross-team standardization of cell seeding density, exposure duration, and reagent preparation.
- Involves adaptation considerations when applying protocols to primary hepatocytes or alternative cell lines.
- Limited by the need for specialized reagents such as JC-1 dye and mitochondrial green fluorescent probes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Mitochondrial Fluorescence Intensity and Cellular ATP Detection
2:45
Mitochondrial Membrane Potential Measurements
4:39
Oxygen Consumption Rate (OCR) Measurements
6:22
Results: Evaluation of Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to β-HCH
7:43
Conclusion
