הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד

המטרה הכוללת של שילוב RNA-FISH מתהווה עם צביעת אמינו של חלבונים סמויים נגיפיים היא לדמיין שעתוק פעיל יחד עם היווצרות מפעל שעתוק נגיפי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הגנטיקה, ביולוגיה של התא, וירולוגיה ווירולוגיה של ביולוגיה של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במודל מיני כרומוזום ויראלי הניתן להשראה כדי לחקור את הפרטים המולקולריים מאחורי שינויים אדריכליים גנומיים.

אוספים תאים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים למשך שתי דקות בכוח משיכה של 200 וולט. שטפו את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DEPC PBS סטרילי.

לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-1.2 מיליליטר של DEPC PBS. הנח את הכיסוי מחליק לתחתית צלחת עם שש בארות. פיפטה 200 מיקרוליטר מתערובת התא DEPC PBS על כל החלקת כיסוי.

לאחר שהתאים התייצבו במשך שתי דקות, שאפו עודף DEPC PBS, והשאירו רק שכבה דקה של תאים. הוסף בזהירות מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע לכל החלקת כיסוי. אפשר לתאים לתקן למשך 10 דקות.

שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם DEPC PBS. לאחר הכביסה, הוסף בזהירות מיליליטר אחד של גליצין DEPC PBS לריכוז סופי של גליצין של 100 מילימולר לכל החלקת כיסוי. הניחו לתאים להרוות במשך חמש דקות.

הוסיפו 1.5 מיליליטר של DEPC PBS והניחו על שייקר למשך חמש דקות, ונערו בחוזקה אך בעדינות ביד למשך דקה. שאפו את עודף ה-DEPC PBS והיזהרו לא לשבש את התאים. הוסף בזהירות מיליליטר אחד של תמיסה חדירה לכל החלקת כיסוי.

אפשר לתאים לחלחל למשך 15 דקות. הוסף 1.5 מיליליטר של DEPC PBS. הניחו את התאים על שייקר למשך חמש דקות, ונערו בחוזקה אך בעדינות ביד למשך דקה.

שאפו את עודף ה-DEPC PBS והיזהרו לא לשבש את התאים. סמן את שקופיות המיקרוסקופ, והרטיב מגבת נייר ואז רפד את תחתית מיכל פלסטיק הניתן לאטום במגבת. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הנוגדנים העיקרית והכפילו את המתכון לכל החלקת כיסוי קיימת.

הנח 30 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית על כל שקופית מיקרוסקופ מסומנת. ודא שריכוז הנוגדנים העיקרי נכון על ידי החזקת פינת החלקה של המכסה ולחיצה עדינה עליה. בנוסף, ניתן להשתמש בפינת הרקמה כדי לנדף עודף לחות.

לאחר מכן הנח את פתק הכיסוי על שקופיות המיקרוסקופ המסומנות והקפיד לא להכניס בועות. מכסים את החלק החיצוני של המיכל בניילון. העבירו את המיכל לאינקובטור המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

במהלך הדגירה, הכינו את הריאגנטים הדרושים. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם DEPC PBS בצלחת של שש בארות למשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, שטפו את התאים עם מאגר שטיפת FISH שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחד.

ושמור את החלקת הכיסוי במאגר הכביסה של FISH עד שהנוגדן המשני, תערובת בדיקה אינטרונית הוכנה. לאחר מכן, נקו את שקופיות הזכוכית לדגירת נוגדנים ראשונית להכלאה עם מי סבון. לאחר שהם יבשים, נקו אותם עם אתנול ורקמת מעבדה.

הנח 40 מיקרוליטר של הנוגדן המשני ובדיקת אינטרון FISH עם תמיסה על כל שקופית זכוכית. הנח את החלקות הכיסוי עם התאים על השקופיות כשצד התאים פונה כלפי מטה על גבי המאגר. והיזהרו לא להכניס בועות.

הניחו את השקופיות למיכל פלסטיק עם מגבת נייר לחה בתחתית. עטפו את מיכל הפלסטיק בניילון ראשון, ולאחר מכן בנייר אלומיניום. ודגרו את המיכל עם המגלשות.

לאחר הדגירה, החלק בזהירות את החלקת הכיסוי מקצה מגלשת הזכוכית והנח אותה בחזרה לצלחות בנות שש בארות, עם הפנים כלפי מעלה. שוטפים את התאים עם מאגר שטיפת FISH שלוש פעמים בצלחת של שש בארות למשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם SSC כפול.

הוסף DAPI בריכוז אחד עד 1000 לתוך ה-SSC הכפול ואפשר לתמיסה לשבת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את התאים פעמיים עם SSC כפול. נקה את שקופיות הזכוכית המשמשות להכלאה והוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה על שקופיות הזכוכית.

הנח את החלקות הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על תמיסת ההרכבה. בעזרת רקמת מעבדה, הסר בעדינות את תמיסת ההרכבה העודפת, והקפיד לא למעוך את התאים. בעזרת לק, מרחי שכבה מספקת סביב קצה החלקות הכיסוי והניחי ללק להתייבש.

הדגימה מוכנה כעת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תאי BCBL-1 נצבעו עבור LANA ו-K-Rta RNA כדי לבחון היכן נמצאים אפיזומים נגיפיים מתעתקים באופן פעיל ואת ההטרוגניות של התגובה לגירוי הרפס הקשור לסרקומה של קפוסי, או גירוי הפעלה מחדש של KSHV. הקרינה הייחודית של K-Rta באזורים התואמים באופן הדוק את התפלגות האפיזומים הנגיפיים היא עדות לשעתוק פעיל המתרחש קרוב לגנום KSHV.

באותה דגימה ניתן לראות תאים המציגים פלואורסצנטיות K-Rta חלשה ומפוזרת בהרבה שאינה חופפת באופן משמעותי ל-LANA, מה שממחיש את השונות הניכרת ואת מידת התגובה לגירויים להפעלה מחדש בתוך אוכלוסיית תאים. לאחר מכן, נבדקה היעילות של סנכרון תימידין על ידי הדמיה של ביטוי החלבון הנגיפי שהראה בבירור שתאים מסונכרנים הגיבו יותר לגירויים להפעלה מחדש מאשר האוכלוסייה הלא מסונכרנת. צביעת DAPI יכולה לשרת מספר פונקציות, דוגמה זו מראה בבירור שיש שלושה תאים נפרדים במקום אחד.

מיקרוסקופיה תלת מימדית לצד טכניקה זו חשפה מבני RNA PII דמויי טבעת שנראו עם גנומים של KSHV המנוקדים בפריפריה. עם פיתוחו, הכרומוזום המיני ויראלי יספק כלים ייחודיים לחוקרים לחקור את הארגון הזמני המיוחד של ביטוי גנים ואת הרגרסיה של גרעין התא.