פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

המטרה הכוללת של ריצוף 16S rRNA-Amplicon בעל תפוקה גבוהה היא לאפיין את הרכב המיקרוביום העולמי החל מדגימות צואה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הרכב החיידקים הגלובלי הקשורים לתחומי עניין רבים כגון חילוף חומרים, עיכול ודלקת מעיים ודלקת מערכתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מפקד של קהילות מיקרוביאליות אירוביות ואנאירוביות הקיימות בדגימת הצואה כולל אותם חיידקים שקשה לתרבת.

שיטה זו יכולה לטפל בו זמנית במספר רב של דגימות צואה הודות לקו משאבות עיבוד מהיר ללא מעי גס והיא הביאה לריצוף 16S rRNA-Amplicon חזק וניתן לשחזור. עבור פרוטוקול זה, יש דגימות צואה קפואות בגודל של מחק עיפרון. יש לאחסן את הדגימות בשני צינורות מיליליטר עם הקצה הקצוץ של ספוגית האיסוף.

כלול בקרות שליליות המורכבות ממקלונים ללא צואה ובקרות כפילויות פנימיות וכלול כפילויות לדוגמה מהצואה המקורית לדוגמה כדי לשמש כבקרה פנימית. התחל בהפשרת תמיסות המיצוי והדילול בטמפרטורת החדר יחד עם דגימות הצואה ודגימות הבקרה. לאחר ההפשרה, הוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי לכל צינור דגימה וערבבו את הצואה לתמיסה באמצעות מערבולת.

הציגו בקרות שליליות של מאגר בלבד בשלב זה. לאחר מכן, מחממים את הדגימות למשך 10 דקות באמבט מים רותחים. לאחר הדגירה במים רותחים, הוסיפו 250 מיקרוליטר תמיסת דילול לכל דגימה ומערבלו את הדגימות לערבוב.

לאחר מכן אחסן את צינורות הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לבצע PCR. הגדר את ה-PCR בתחנת עבודה לפני PCR שנוקה ממזהמי DNA פוטנציאליים כמו תבניות ואמפליקונים. סמנו את הפריימרים לפי הברקוד שלהם ודללו אותם במים מזוקקים כפולים לריכוז של 50 מיקרומולר.

אחסן את מלאי הפריימר המדולל במינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר אותם לחלוטין לפני השימוש. עבור כל דגימה, הכינו צלחת של 96 בארות ל -32 תגובות בשלוש עותקים. לאחר ההתחממות לטמפרטורת החדר, יש לדלל את הכמות של הפריימר הקדמי ו-32 הפריימרים ההפוכים לחמישה מיקרו-מולר עבור ה-PCR.

לאחר מכן הכינו מספיק תערובת PCR בסיסית ל-100 תגובות. שלב 100 מיקרוליטר של חמישה פריימר מיקרומולר קדימה עם מיליליטר אחד של תערובת מאסטר 2X PCR ו-400 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. מערבל את התערובת הזו ולאחר מכן טען 15 מיקרוליטר מתערובת זו לכל אחת מ-96 הבארות.

לאחר מכן, ערכות עומס של שלוש בארות כל אחת עם מיקרוליטר אחד של חמישה פריימר הפוך מיקרו-מולרי. לפיכך, טען את כל 32 האינדקס ההפוך השונה לתוך הצלחת. לאחר מכן לכל צלחת היטב, הוסף ארבעה מיקרוליטרים מדגימת ה- DNA שחולצה.

זה נעשה על ספסל נקי. כעת הפעל את ה-PCR עם דנטורציה ראשונית של שלוש דקות ואחריה 35 מחזורים עם דקה אחת של דנטורציה וכריעה ב-55 מעלות צלזיוס ודקה אחת של הארכה. סיימו עם הארכה אחרונה של 10 דקות.

לאחר השלמת התגובה, עבוד בשולחן עבודה ייעודי לאחר PCR. שם, שלב כל סט של מוצרי PCR משולשים לצינור יחיד עבור 60 מיקרוליטר לדגימה. לאחר מכן הפעל ארבעה מיקרוליטר מכל דגימה על ג'ל אגרוז מוכתם באתידיום ברומיד.

האמפליקונים החיוביים יופיעו בין 375 ל-425 זוגות בסיסים. הבקרות השליליות מוצגות ומעובדות יחד עם Amplicons החיוביים של המחקר. לכמת את ריכוזי ה-DNA של תוצרי התגובה החיובית בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן שלב 500 ננוגרם של DNA מכל אחד מהמוצרים לצינור יחיד. מערבל את התערובת הזו ואז נגמר 200 מיקרוליטר על ג'ל של 1% כמו קודם. כעת חלץ את הרצועות מהג'ל בין 375 ל -425 זוגות בסיסים.

לאחר מכן, הכן את הספרייה לרצף. מדוד את הריכוז באמצעות ערכת זיהוי DNA דו-גדילית רגישה במיוחד בהתאם להוראות היצרן ואחריה שימוש בערכת הפרדה וניתוח רגישה ביותר. לאחר מכן יש לדלל את הספרייה לשבעה פיקומולר ולשלב אותה ארבע לאחת עם ספריית בקרה.

כעת, כשהדגימה מוכנה לריצוף, העבר אותה למכונת הריצוף. השיטה המתוארת להכנת ספרייה מדגימות צואה שימשה לניתוח המיקרוביום של חולים מאושפזים עם חשד לשלשול זיהומי. במקביל, דגימות צואה עברו גם תרבית מסורתית במעבדה למיקרוביולוגיה.

דגימות צואה ממבוגרים בריאים רוצפו להשוואה. נכללו מספר דגימות ביקורת שליליות, PCR ללא תבנית, PCR על ספוגיות נקיות וסטריליות בתמיסת מיצוי ודילול ו-PCR על תמיסות מיצוי ודילול מעורבות. לכל אחד מהם היו פחות מ-118 קריאות בסך הכל שהיו בעיקר טקסונים של מיקופלזמה.

דגימות סטנדרטיות היו בממוצע יותר מ-10,000 קריאות ללא זיהוי של מיקופלזמה לאחר בקרת איכות. עקביות הדגימות והשונות נמדדו באמצעות 16 דגימות צואה שהוכנו עם שני פריימרים מקודדים שונים כדי לבנות שתי ספריות שונות מכל דגימה. מחצית מהדגימות היו חיוביות לקמפילובקטר סלמונלה או שיגלה בטכניקת גידול מסורתית.

באמצעות תוצאות ריצוף 16S, תרשים שטח ברמת הפילו מראה עקביות בין ספריות שנעשו מאותן דגימות ללא תלות בתוצאות התרבות המסורתיות. מתוך מאגר זה של 16 דגימות זוגיות, ניתוח הקואורדינטות העיקרי גילה כי זוגות המדגם מיושרים באופן הדוק וכי לדגימות התרבית החיוביות היה ערך PC1 שונה באופן משמעותי מדגימות התרבית השליליות. ניתוח נוסף של הדגימות גילה כי רמות גבוהות של פרוטאובקטריה נמצאו רק בחולים המאושפזים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעבד בו זמנית מספר רב של דגימות צואה באמצעות מיצוי DNA נטול מעי גס ו-PCR כדי ליצור ספריות ריצוף ברקוד של המשתנה המיקרוביאלי אזור V4. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בסביבה מסודרת ונקייה במיוחד בעת הכנת הספריות. אל תשכח שעבודה עם דגימות צואה אנושיות מסוכנת ויש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.