כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי
12 בפברואר 2018
הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את הרמות המוחלטות של מיקרו-רנ"א פלזמה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת של שעתוק הפוך. שיטה זו יכולה לעזור להעריך את כמות המיקרו-רנ"א בפלזמה, גם אם רמת הביטוי שלהם נמוכה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשוות את הנתונים הנמדדים לאחרים ממחקרים או מעבדות שונות.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על דגימות ממינים אחרים מכיוון שניתן ליצור עקומה סטנדרטית על ידי שימוש ב-RNA הסינתטי או בנוקלאוטיד. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחקר תרגומי כדי לחקור סמנים ביולוגיים בטיחותיים מבטיחים. ראשית, הפשירו את דגימות הפלזמה הקפואות שהתקבלו מווריד הירך של קופי Cynomolgus על הקרח.
העבירו את מגיב הליזיס בכלורופורם על קרח לצינון לפני מיצוי RNA. לאחר מכן, הוסף 1,000 מיקרוליטר של מגיב ליזיס ל -200 מיקרוליטר של הדגימה. ומערבולת למשך דקה אחת כדי להבטיח ערבוב נכון.
לאחר מכן הוסף לדגימה חמישה מיקרוליטרים של חמישה מיקרו-RNA סינתטי ננו-מולרי Caenorhabditis elegans ו-200 מיקרוליטר כלורופורם. מערבל את הדגימה למשך דקה אחת כדי לערבב כמו שצריך. לאחר מכן, הניחו את הדגימה על קרח למשך שתיים-שלוש דקות.
לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-12,000 גרם, למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו בזהירות 650 מיקרוליטר מהשלב המימי למיקרו-צינור חדש. לאחר מכן, הוסף 975 מיקרוליטר אתנול לשלב המימי ופיפטה מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב מלא.
העבירו את הדגימה לעמודה ולמתאם המתאימים ולאחר מכן יבשו בוואקום במשך שלוש דקות באמצעות סעפות ואקום. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר אתנול לעמוד וייבשו בוואקום למשך דקה אחת. לאחר ייבוש בוואקום, הוסף 800 מיקרוליטר של RWT Buffer לעמודה ושוב, יבש בוואקום למשך שתי דקות.
לאחר מכן הוסף 800 מיקרוליטר של RPE Buffer לעמוד וייבש בוואקום במשך שתי דקות. הוסף את מאגר ה-RPE פעמיים, ולאחר מכן ייבוש בוואקום. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר אתנול לעמודה.
לאחר הוספת אתנול, יש לייבש בוואקום למשך דקה. לאחר מכן, העבירו את העמוד במיקרו-צינור חדש וצנטריפוגה זהה ב -12, 000 גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את העמוד למיקרו-צינור חדש והוסיפו אליו 50 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
תן לעמוד בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות ואז צנטריפוגה בחום של 8, 000 גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לבסוף, אחסן את הנוזל במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין ריכוז אוליגונוקלאוטיד RNA סינתטי המתאים למיקרו-RNA המטרה, יש לדלל את תמיסת המלאי פי 10 כדי להשיג פתרון עבודה עם הריכוז הגבוה ביותר כדי לשרטט את העקומות הסטנדרטיות.
לאחר מכן, כדי ליצור מאגר מולטיפלקס של פריימרים לשעתוק הפוך, ערבבו נפחים שווים של פריימרים בעלי 20 חוזק עבור מיקרו-רנ"א מטרה. לאחר מכן, הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוך. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת תגובת שעתוק הפוך לחמישה מיקרוליטרים של דגימת RNA.
מערבבים את השניים על ידי פיפטינג מספר פעמים. לאחר מכן, דגרו את התערובת על קרח למשך חמש דקות. לאחר הנחת הדגימה ב-Thermocycler, התחל את המחזור.
לאחר סיום התוכנית, אחסן את הדגימה המתומללת הפוכה במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להוות את מאגר פריימר בדיקת המולטיפלקס, הוסף נפחים שווים של חמישה מיקרוליטרים של פריימרים לבדיקה המתאימים למיקרו-רנ"א יעד לתוך הצינור המכיל מאגר Tris-EDTA בנפח סופי של 1,000 מיקרוליטר. לאחר מכן, הרכיבו את תערובת תגובת ההגברה המוקדמת.
לאחר סיום תערובת התגובה, העבירו 22.5 מיקרוליטר של תערובת תגובה להגברה מוקדמת לשני נקודה חמישה מיקרוליטרים של דגימה מתומללת הפוכה. לאחר מכן, פיפטה כדי לערבב היטב את הדגימה ואת ערבוב מאסטר ההגברה מראש ולדגור על קרח למשך חמש דקות ולאחר מכן להשאיר את צינורות ה-PCR ב-Thermocycler ולהתחיל בריצה. לאחר סיום התוכנית, העבירו את כל הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לאחר הפשרת הדגימות המוגברות מראש או הלא מוגברות מראש, יש לדלל אותן פי חמישה במים סטריליים. כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית, בצע דילול סדרתי פי 10 של הדגימות שמקורן באוליגונוקלאוטידים של RNA סינתטי. לאחר מכן, הרכיבו את תערובת תגובת ה-PCR הכמותית בשפופרת שנשמרה על קרח.
לאחר מכן הוסף 18 מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR הכמותית ללוחות התגובה האופטיים המהירים של 96 בארות. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר מהדגימות המדוללות לבארות. לאחר איטום הצלחת בסרט דבק, צנטריפוגה קצרה את הדגימה ב -500 גרם למשך 15 שניות.
לאחר מכן התחל את תוכנית Thermocycler בזמן אמת. השתמש בתוכנת SDS גרסה 2.4 המתפקדת עם המחזורי התרמי המתאים בזמן אמת כדי לחשב את מספר העותק הגולמי של כל דגימה. לאחר מכן חשב את מספר העותק המוחלט ממספר העותק הגולמי באמצעות תוכנת Excel.
יעילות ההגברה של miR-122, miR-192 ו-miR-133a נותחה על ידי שרטוט עקומות סטנדרטיות, מה שמסביר את הקשר בין ריכוז הלוג לעומת מחזור הכימות עבור הדגימות הלא מוגברות מראש. העקומות הסטנדרטיות עבור miR-122, miR-192 ו-miR-133a מראות קשר ליניארי בין מחזורי הכימות וריכוז הלוג של הדגימות. לאחר מכן, יעילות ההגברה של miR-1, miR-499a ו-miR-206 נותחה על ידי התוויית עקומות סטנדרטיות עבור דגימות מוגברות מראש.
כדי לנתח את יעילות ההגברה, השיפוע חושב באמצעות רגרסיה ליניארית. השיפוע בעקומה סטנדרטית A מראה היעדר אמפליקונים ספציפיים בריכוז של 1,000 עותקים למיקרוליטר עבור miR-499a ו-miR-206. עם זאת, האמפליקונים הלא ספציפיים התקבלו ב-1,000 עותקים למיקרוליטר עבור miR-1.
כאן, דגימות miR-206 לא מוגברות מראש ומוגברות מראש שימשו בשכפולים כדי לגזור את עלילות ההגברה. ערכי מחזור הכימות עבור miR-206 לא מוגבר מראש ומוגבר מראש הוערכו ב-39.9, פלוס או מינוס נקודה תשע ו-27.0, פלוס או מינוס שתי נקודות שתיים, בהתאמה, המייצגים ערכים כמעט דומים בין הכפילויות כפי שמוצג בתרשים. לאחר מכן, מיקרו-רנ"א פלזמה שהתקבלו מקופי Cynomolgus עברו פרופיל כדי לחשב את הערכים המוחלטים שלהם.
תרשימי הנקודות, המתקבלים מפרופיל microRNA המייצגים את רמות הביטוי שלהם, מראים כי miR-122, miR-133a ו-miR-192 ניתנים לזיהוי ללא הגברה מוקדמת. ואילו miR-1, miR-206 ו-miR-499a ידרשו הגברה מוקדמת עקב רמות ביטוי נמוכות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למדוד את הרמות המוחלטות של מיקרו-רנ"א פלזמה, באמצעות RT-qPCR.
והגברה מוקדמת; זה שימושי כדי לשפר את הזיהוי עם כמויות קטנות של מיקרו-רנ"א.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
דו"ח זה מתאר פרוטוקול למדידת הרמות המוחלטות של microRNAs בפלסמה באמצעות quantitative real-time reverse transcription PCR. שיטה זו מאפשרת את הערכת ה-microRNAs בפלסמה גם ברמות ביטוי נמוכות, ובכך היא מקלה על ביצוע השוואות בין מחקרים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח (Neuroscience)
- מחקר ביומרקרים
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- ל-microRNAs בפלזמה יש תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים שונים.
- הבנת הרמות שלהם יכולה לסייע בזיהוי של ביומרקרים לבטיחות.
- ניתן להפיק עקומות סטנדרט לצורך ניתוח השוואתי.
- ניתן להחיל טכניקה זו על דגימות ממינים שונים.
מטרת המחקר
- למדידת רמות מוחלטות של microRNAs בפלזמה.
- לאפשר הערכה איכותנית של נתונים בין מחקרים שונים.
- לספק תובנות למחקר תרגומי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- PCR כמותי בזמן אמת עם שעתוק הפוך (Quantitative real-time reverse transcription PCR).
- ניתן להשתמש בטכניקות של קדם-הגברה (Pre-amplification).
- הפשרה של דגימות פלסמה קפואות מקופים מסוג Cynomolgus Monkeys.
- שימוש ב-RNA סינתטי ליצירת עקומת סטנדרט.
תוצאות עיקריות
- מדידה יעילה של רמות ביטוי נמוכות של microRNAs בפלזמה.
- הקלה בהשוואת תוצאות בין מעבדות שונות.
- זיהוי פוטנציאלי של סממנים ביולוגיים לבטיחות עבור מחקרים תרגומיים.
- היתכנות יישום על דגימות ממינים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה משפר את ההבנה של רמות microRNA בפלסמה.
- הוא תומך בפיתוח של שיטות סטנדרטיות להשוואה.
- הוא פותח נתיבים למחקר נוסף בזיהוי ביומרקרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מוחלט של microRNAs בפלזמה מאפשר השוואה בין מחקרים ותומך בתיקוף של סממנים ביולוגיים בהערכת בטיחות פרה-קלינית. שיטה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי אספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של מטרות בעלות שפע נמוך במינים שאינם קליניים. היא נותנת מענה לפער מרכזי במחקר תרגומי, שבו כימות יחסי מגביל את אינטגרציית הנתונים בין מעבדות ומינים שונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת השערות של סמני בטיחות מבוססי miRNA באמצעות כימות מוחלט בפלזמה של קוף cynomolgus.
- ערך תפעולי: משתמש ב-cel-miR-238 סינתטי כביקורת חיצונית לנורמליזציה ולהערכת איכות בין סדרות של דגימות.
- ערך ניבוי: הגברה מקדימה (Pre-amplification) מרחיבה את סף הגילוי ל-102 copies/µL, ובכך מאפשרת מדידה של miRNAs בעלי ביטוי נמוך כגון miR-1, miR-206 ו-miR-499a.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: RT-qPCR מבוסס גשים (probes) עם פריימרים וגשים ספציפיים ל-miRNA מאפשר זיהוי ספציפי ומרובה-מטרות (multiplexed) של miRNA בפלזמה.
- שחזוריות: שונות טכנית המוערכת בפחות מפי 3 תומכת בהשוואות אמינות לאורך זמן ובין מעבדות שונות.
- מדרגתיות: עקומות סטנדרט מ-RNA oligonucleotides סינתטיים מאפשרות כימות מוחלט בטווחים של ריכוזים לצורך תיקוף פגיעות (hit validation).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: כימות מוחלט בקפיים מסוג cynomolgus תומך בהסבר (extrapolation) למחקרי סממני בטיחות בבני אדם.
- תיקוף סממנים ביולוגים: miRNAs הניתנים לגילוי (miR-122, miR-133a, miR-192) ללא הגברה מוקדמת מהווים מועמדים חזקים לסריקת בטיחות מוקדמת.
- הפחתת סיכונים: זרימת עבודה הכוללת הגברה מוקדמת מאפשרת גילוי של miRNAs בריכוז נמוך, ובכך מפחיתה את מספר התוצאות השליליות השגויות בפאנלים של סממנים ביולוגים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף מהשלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת מיפוי כמותי של miRNA, המנחה את בחירת המטרה ואת הסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ביולוגיה של הגילוי: כימות מוחלט תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתוני מספר עותקים לתיקוף מטרות miRNA.
- סריקה: LLOQ של 102 copies/µL מאפשר זיהוי המוכן לסריקה של miRNA בפלזמה, הן בריכוזים גבוהים והן בריכוזים נמוכים.
- אנליטיקה: יצירת עקומת סטנדרט וכימות מבוסס Cq מאפשרים השוואה סטטיסטית של רמות miRNA בין קבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: שימוש בפלזמה של קוף cynomolgus ובביקורות סינתטיות תומך בתרגום של סממנים ביולוגיים בין מינים.
- שימוש חוזר בארגון: הפרוטוקול מגדיר זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לכימות miRNA בפלזמה באמצעות RT-qPCR עם אפשרות להגברה מקדימה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: כימות מוחלט מפחית עמימות מכניסטית במחקרי סמנים ביולוגיים של miRNA.
- ערך תפעולי: זרימת עבודה סטנדרטית של מיצוי RNA ו-qPCR מבטיחה הדירות בין אתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בהתבסס על אותי בטיחות כמותיים של miRNA במודלים פרה-קליניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעוד ותעדוף של סממנים ביולוגיים של miRNA מותאם סיכון באמצעות ספי hyaluronic של מספר עותקים מוחלט.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-RNA, RT-qPCR וטכניקות של קדם-הגברה (pre-amplification).
- תלוי בגישה לטרמוסייקלר (thermocycler), סעפת ואקום ותוכנת SDS לניתוח נתונים.
- נדרש סטנדרטיזציה של נפח הפלזמה (200 µL EDTA) ובקרת חיצונית (cel-miR-238) לצורך עקביות בין מחקרים.
- שלב קדם-הגברה הכרחי עבור miRNAs עם Cq > 35 כדי למנוע תוצאות שגויות שליליות.
- מוגבל ל-miRNAs עם הגברה ניתנת לגילוי; miR-208a ו-miR-208b לא היו ניתנים לגילוי אפילו לאחר קדם-הגברה.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
RNA Extraction
3:43
cDNA Synthesis
4:55
Pre-amplification
6:02
Quantitative Real-time PCR
7:05
Data Analysis
7:27
Results: Use of Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR with or without Pre-amplification to Measure the Absolute Levels of Plasma micro-RNAs
9:54
Conclusion
