זיהוי של OTX1 ו- OTX2 כמו שני סמנים מולקולריים אפשריים עבור קרצינומה Sinonasal ואת חוש הריח נוירובלסטומה
28 בפברואר 2019
גנים Homeobox גנים הם גנים תקינה קשורה לעיתים קרובות עם גידולים האורגניזמים למבוגרים. . חקרנו שלהם ביטוי השוואתית מאת immunohistochemical וניתוח בזמן אמת PCR, mucosae האף נורמלי, דלקתיות, sinonasal neoplasms על מנת להשתמש בהם בתור מטרות אפשריות האבחון והטיפול.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות סמנים מולקולריים שימושיים עבור קרצינומות sinonasal ו neuroblastomas חוש הריח בצורה פשוטה ויעילה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום נוירובלסטומה חוש הריח וקרצינומה sinonasal, כגון זיהוי של סמנים מולקולריים להפלות תת סוג הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להשיג את התוצאה בתוך פחות משש שעות, או בתוך יום עבור הדו"ח של בית החולים.
הדגמת ההליך של מיצוי RNA ו PCR בזמן אמת יהיה ד"ר ג'ורג'יה Millefanti, דוקטורנט מהמעבדה שלי. ולהדגים את ההליך של אימונוהיסטוכימיה יהיה ג'ובאני מיכאלוני, גם דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את ההליך, לאסוף ולחלק את כל דגימות FFPE האנושיות לקבוצות משנה שונות, על פי סיווג ארגון ארגון האו"ם של גידולים בראש ובצוואר.
מחממים את הדגימות בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, rehydrate שלושה חלקים עבים מיקרומטר FFPE על ידי שטיפת אותם בקצרה קסילן במשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-100%95%85% וב-75% אלכוהול באופן סדרתי במשך חמש דקות כל שטיפה.
שוטפים את המגלשות במשך חמש דקות במים מזוקקים. לאחר מכן, לחסום את הפעילות אנדוגניים על ידי הצבת השקופיות 3% מי חמצן מיימת במשך 12 דקות. לאחר מכן, לבצע אנטיגן אחזור על ידי טיפול שקופיות עם חיץ ציטראט 10 מילימולר, microwaving במשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות, לשטוף את החלקים במאגר TBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.2% מטריטון X, והדוגים אותם בן לילה בארבע מעלות צלזיוס, עם נוגדן OTX2 אנטי-אנושי עז, מדולל ביחס של 1 עד 100. למחרת, מוסיפים נוגדן משני נגד עיזים ארנב biotinylated, מדולל ב 1 עד 200, ו דגירה את החלקים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לטפל בדגימות עם קומפלקס פרוקסידזה ABC. לאחר מכן, לפתח את החיסרון באמצעות diaminobenzene טטרהידרוכלוריד, ונגד כתם הגרעינים עם hematoxylin האריס. לאחר מכן, לייבש את החלקים בסולם אלכוהול חצי סהר, ולהבהיר אותם בחומר ניקוי ממוצא טורפין.
לאחר מכן, תן את המקטעים בשקופית עם מדיום הרכבה. לאחר מיצוי RNA ותעתיק הפוך, בצע ניתוח PCR כמותי בזמן אמת עם טכנולוגיה מבוססת בדיקה ו- cycler תרמי. הכן את תערובת תגובת PCR באמצעות 12.5 מיקרוליטרים של תערובת ראשית מבוססת בדיקה, 1.25 מיקרוליטרים של כל גשושיות OTX1, OTX2 ו- ACTB, 50 ננוגרם של CDNA ומים ללא גרעין עד 25 מיקרוליטרים של נפח כולל.
בצע את כל התגובות ב- triplicate באמצעות גן ACTB כשליטה אנדוגנית כדי לנרמל את רמות ביטוי הגנים. לאחר מכן, צנטריפוגה הצלחת ב 1109 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות. לאחר מכן אחסן את הצלחת מוגנת מפני אור בארבע מעלות צלזיוס, עד הניסוי.
כדי לבצע PCR בזמן אמת, מקם את הדגימות במחשב. לאחר מכן, הגדר את פרופיל האופניים התרמיים עם מחזור התחלה חם ראשוני של 50 מעלות צלזיוס לשתי דקות, ו-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ומחזור אחרון ב-60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לניתוח רמת ביטוי גנים, לנרמל את רמות ביטוי הגן באמצעות שיטת סף מחזור השוואתי באמצעות גן ACTB כשליטה אנדוגנית.
הערך את רמות ביטוי הגנים באמצעות שיטת סף המחזור ההשוואתי והתוות את התוצאות. לאחר מכן, לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של התלמיד, בהתחשב בתוצאות מובהקות סטטיסטית עם p
ביטוי גרעיני עבור OTX1 נמצא בכל דגימות אדנוקרצינומה שאינן סוג מעיים, בעוד אימונואקטיביות מועטה או נעדרת הודגשה אדנוקרצינומות סוג המעי. אימונואקטיביות אינטנסיבית הייתה נוכחת בכל נוירובלסטומות חוש הריח. בין כל קרצינומות נוירו-אנדוקריניות מובחנות היטב, ביטוי OTX מגוון בעוצמה ובאחוז התאים החיוביים.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע כל שלב וצעד של מיצוי RNA בתנאים סטריליים באמצעות גם ציוד סטרילי. במקביל להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח רנטגן, בדיקה אנדוסקופית של חלל האף, סריקת CT, דימות תהודה מגנטית וביופסיה, על מנת לאשר את התוצאות שהתקבלו מהטכניקה שלנו. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האונקולוגיה לחקור מחלה זו במודלים של תאים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לזהות סמנים מולקולריים להפלות תת סוגים של גידול באמצעות immunohistochemistry ו PCR בזמן אמת. אל תשכח כי עבודה עם רייגנטים אלה, מכשור, ודגימות יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון DPI תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הביטוי של גנים ממשפחת ה-homeobox בריריות אף תקינות ודלקתיות, וכן בגידולי מערכת הסינוסים והאף. המטרה היא לזהות מטרות אבחנתיות וטיפוליות פוטנציאליות עבור קרצינומות של מערכת הסינוסים והאף ואורוולטורי נוירובלסטומות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- גנים מהמשפחה Homeobox הם גנים רגולטוריים הקשורים להתפתחות גידולים סרטניים.
- קרצינומות סינונזאליות ונוירובלסטומות אולפקטוריות הן מאתגרות לאבחון.
- זיהוי סמנים מולקולריים יכול לסייע בהבחנה בין תתי-סוגים של גידולים.
- אימונוהיסטוכימיה ו-real-time PCR הן טכניקות מפתח המשמשות במחקר זה.
מטרת המחקר
- זיהוי סמנים מולקולריים עבור קרצינומות סינו-נזאליות ונוירובלסטומות של מערכת הריח.
- פיתוח שיטות אבחנה יעילות עבור גידולים אלו.
- העמקת ההבנה של הביולוגיה של הגידול ושיפור תוצאות הטיפול במטופלים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימות רקמה.
- Real-time PCR לניתוח ביטוי גנים.
- סיווג דגימות בהתאם להנחיות ה-WHO.
- שיתוף פעולה עם דוקטורנטים לצורך הדגמות פרוצדורליות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי ביטויים של גנים ספציפיים ממשפחת ה-homeobox בדגימות גידולים.
- הדגמה של תוצאות מהירות שניתן להשיג בתוך יום אחד.
- פוטנציאל לשיפור הדיוק האבחנתי בגידולים סינו-נזאליים.
- ביסוס מסגרת למחקרים עתידיים בתחום זה.
מסקנות
- גנים מסוג Homeobox עשויים לשמש כסממנים ביולוגיים בעלי ערך עבור גידולי מערכת הסינוסים והאף.
- השיטות שפותחו יכולות לייעל את תהליכי האבחון.
- נדרש מחקר נוסף כדי לתקף ממצאים אלו במסגרות קליניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
זיהוי סממנים מולקולריים מהימנים עבור תתי-סוגים של גידולי מערכות הסינוסים והאף תומך בביטחון אבחנתי מוקדם ומאפשר אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות במסלולי מחקר אונקולוגיים. ביטוי דיפרנציאלי של OTX1 ו-OTX2 מספק בסיס מכניסטי להבחנה בין היסטולוגיות של גידולים, ובכך מסייע בבחירת מודלים פרה-קליניים ובתכנון ניסויים המונחים על ידי סממנים ביולוגיים. גישה זו מגבירה את הביטחון הניבוי במחקרים טרנסלציונליים על ידי קישור חתימות מולקולריות לסיווגים פתולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: דפוסי ביטוי של OTX1 ו-OTX2 מאפשרים בחינה של היפותזות לגבי תתי-סוגים של גידולים בקרצינומות סינו-נזאליות.
- ערך תפעולי: אימונוהיסטוכימיה ו-qPCR מספקים תיקוף אורתוגונלי לנוכחות המטרה בדגימות FFPE.
- ערך ניבוי: ביטוי דיפרנציאלי של סמנים תומך בסטרטפיקציה של מודלים של גידולים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: זרימות עבודה סטנדרטיות של IHC ו-qPCR מבוסס גש- probes מאפשרות זיהוי הדיר ב-OTX1 ו-OTX2 בדגימות רקמה.
- פלט כמותי: ערכי Ct מנורמלים באמצעות ACTB כבקרה אנדוגנית מספקים רמות ביטוי גנים מדידות לצורך ניתוח השוואתי.
- قابליות להרחבה: תגובות בשלוש חזרות ופרוטוקולי מחזור תרמי תומכים בסינון בקיבולת בינונית של פאנלים של גידולים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ביטוי של OTX2 בנוירובלסטומות אולפקטוריות ושל OTX1 באדנוקרצינומות לא-מעייות תואם את הביולוגיה הספציפית של הגידול.
- המשכיות תרגומית: פרופילי ביטוי של סמנים מקשרים בין ממצאי הגילוי לוולידציה פרה-קלינית במודלים ספציפיים לתת-סוגים.
- קידום מותאם סיכון: סטרטיפיקציה מולקולרית מכוונת החלטות המשך (go/no-go) בפיתוח פרה-קליני בהתבסס על נוכחות המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם תיקוף המטרה וזיהוי סממנים ביולוגיים (biomarkers) קודמים לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization) ולבדיקת יעילות פרה-קלינית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור ביטוי של גן OTX להיסטולוגיות ספציפיות של גידולי מערכת הסינוסים והאף.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות פרוטוקולים הדירות של צביעת IHC ונרמול qPCR.
- אנליטיקה: שיטת Comparative Ct מייצרת נתונים כמותיים להשוואת ביטוי של OTX1 ו-OTX2 בין תתי-סוגים של גידולים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין סמנים מולקולריים לסיווגים פתולוגיים לצורך התאמה למודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמות IHC ו-qPCR ניתנות לשימוש חוזר בפרויקטים של אונקולוגיה לצורך תיקוף של סמנים ביולוגיים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: הפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות הבחנה בין תת-סוגי גידולים על בסיס סמנים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: פרוטוקולי IHC ו-qPCR סטנדרטיים מבטיחים הדירות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר מיון מוקדם של פורטפוליו על ידי זיהוי תתי-קבוצות של גידולים המוגדרות מולקולרית.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף של תרכובות מותאם סיכונים בהתבסס על ביטוי המטרה במודלים רלוונטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של immunohistochemistry ו-quantitative PCR.
- תלוי בגישה לדגימות רקמה בשימור FFPE ותשתיות של פתולוגיה מולקולרית.
- נדרש תיקוף סטנדרטי של נוגדנים ותכנון גששים (probes) עבור יעדי OTX1, OTX2 ו-ACTB.
- דורש עמידה בדרישות בטיחות ביולוגית לטיפול ברקמות אנוש ובריאגנטים מסוכנים.
- מוגבל למדידות בנקודת הסיום; אינו מספק דינמיקה של ביטוי מרחבי בזמן אמת.
