באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את הדינמיקה של מערכות חלבון מורכבות בצורה כמותית תוך התמקדות באינטראקציות מתואמות כגון שיתוף פעולה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכמותית שבו יש חשיבות מרכזית למתחמי חלבונים ולאינטראקציות הדינמיות שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ליישם FRET דינמי רב צבעוני של מולקולה בודדת על מערכות רלוונטיות מבחינה ביולוגית.

לפני הרכבת תא הזרימה, חתוך תעלת זרימה בסרט דבק שקוף בעובי 40 מיקרון, רסס דבק קיבוע מהיר בצד הלא דביק של הסרט ואפשר לדבק להתייבש. כדי להתחיל בהרכבת תא זרימה, השג שקופית קוורץ התמזגה פונקציונלית PEG ביוטין PEG בעובי שלושה מילימטר עם חורי כניסה ויציאה. מרחו את הצד המצופה בדבק ריסוס של סרט התקרה על הצד הפונקציונלי של המגלשה תוך יישור התעלה עם ווי הכניסה והיציאה.

מחממים את השקופית ל 80 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך דקה. לחץ את הסרט על השקופית למשך 30 שניות באמצעות שקופית מיקרוסקופ נוספת כדי לפזר את הלחץ באופן שווה. ואז הניחו למכלול להתקרר למשך דקה אחת.

קלף את יריעת המגן המכסה את הדבק. הנח החלקת כיסוי על הדבק החשוף ליצירת תא הזרימה. מחממים את החדר ל 80 מעלות צלזיוס למשך דקה.

לחץ על החלקת המכסה על הדבק למשך 30 שניות כדי לאטום את החדר ולאפשר לתא המורכב להתקרר. מרחו טיפת גליצרול על פני המנסרה לפני הנחת תא הזרימה מעל הפריזמה. התקן את תא הזרימה במחזיק למיקרוסקופ TIRF מסוג פריזמה רב צבעונית.

חבר את צינורות הכניסה והיציאה בסיום. כדי להתחיל להגדיר את המכשיר למדידת שלושת הצבעים, פתח את תוכנת מצלמת ה-CCD המכפיל אלקטרונים, הגדר את חיישן EMCCD לטמפרטורה הנמוכה ביותר האפשרית. הגדר את מהירות ההעברה האנכית של המצלמה ל-3.3 מיקרו-שניות, בחר מתח שעון אנכי רגיל, הגדר את קצב הקריאה האופקי ל-17 מילי-הרץ ב-16 סיביות, את רווח ההגברה המוקדמת לשלוש ואת רמת הרווח של מכפיל האלקטרונים ל-1000.

בחר טריגר צירוף חיצוני. הגדר את זמן החשיפה ל-70 אלפיות השנייה. ומשך הקלטת הסרט ל-750 מחזורי רכישה.

צרו תיקייה חדשה לקובצי המדידה. אפשר שמירה אוטומטית בתוכנת EMCCD והגדר את תבנית הקובץ של מסגרת הסרט ל-TIFF. הגדר את נתיב השמירה האוטומטית של הקובץ לתיקיה החדשה שנוצרה.

לאחר מכן פתח את התוכנה השולטת במסנן המתכוונן אקוסטו-אופטי, תוכנת בקרת הלייזר ותוכנת ההדק המסנכרנת את הלייזרים ה-AOTF, התריסים האופטיים והמצלמות. השתמש ב-AOTF כדי לכוונן את עוצמת הלייזר לכשלושה מילי-וואט לפני הכניסה לפריזמה. טען את דפוס ההפעלה המסנכרן את כל המכשירים לעירור הלייזר לסירוגין, ולאחר מכן התקן את מחזיק הדגימה במכשיר.

הנח את קצה צינור הכניסה בצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את מאגר הניסוי. חבר את צינור היציאה למשאבת מזרק המוגדרת למצב נסיגה. שטפו את החדר עם 150 מיקרוליטר חיץ.

מקד את מצלמת ה-CCD בממשק הפונקציונלי, יישר את קרני העירור ומזהמי פלואורסצנט אקונומיקה. לאחר מכן הזרימו 300 מיקרוליטר של תמיסה של 0.25 מיליגרם למיליליטר של אבידין נטול גליקוזיל וחוצצים לתוך התא ודגרו למשך דקה אחת. שטוף את אבידין נטול גליקוזיל לא קשור מהתא עם חיץ.

לאחר מכן הזרימו 300 מיקרוליטר של חיץ עם ריכוז BSA של 0.5 מיליגרם למיליליטר דרך החדר כדי לחסום פגמים בתפקוד פני השטח. לאחר מכן, טען את תא הזרימה במנות של 150 מיקרוליטר של ביוטיניל פלואורסצנטי Hsp90 ב-BSA המכיל מאגר בהגדלת ריכוזי Hsp90 עד להשגת צפיפות פני שטח מספקת. שטפו חלבון לא קשור מהתא עם 300 מיקרוליטר של חיץ המכיל BSA.

טען 150 מיקרוליטר של תמיסה של 25 ננו-מולרית של חיץ המכיל AMP-PMP ו-BSA מסומן לתוך התא ודגירה למשך חמש דקות. חזור על הטעינה והדגירה פעם אחת. לאחר מכן השתמש בצעד Piezo כדי להזיז את תא הדגימה בניצב לקרן העירור כדי לשנות את שדה הראייה כרצונך.

התאם את מיקוד התמונה במידת הצורך. התחל את הקלטות המצלמה בתוכנת המצלמה על ידי לחיצה על כפתור קח אות כפי שמוצג. התחל את מחזורי רכישת העירור בתוכנת הטריגר כדי להתחיל ברכישת נתונים.

כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את תוכנת הניתוח וייבא את הסרטים המוקלטים של שתי המצלמות. לחץ על מצא עקבות כדי לקבוע את עקבות עוצמת הקרינה המתאימות למולקולות בודדות פוטנציאליות. עבור כל מולקולה, חשב את סכום כל העקבות של אותה נקודה עם אותו צבע עירור.

הערך את פרופילי העוצמה בכל הערוצים עבור רמה שטוחה בערך בעוצמת הגלם של המפרק ושלב הלבנה יחיד עבור כל צבעי העירור. חפש התנהגות אנטי-קורלטיבית בערוצי הזיהוי המתאימים והתרחשות של פלואורסצנטיות אדומה במעקב. אם כל הקריטריונים מתקיימים, שמור את עקבות הקרינה לניתוח נוסף.

רק המולקולה המצוינת עומדת בקריטריונים בדוגמה זו. אל תכלול עקבות שאין להן מישורים שטוחים, המציגות אירועים מהבהבים ולא אנטי מתאם או שיש להן שלבי הלבנה מרובים. בחירת עקבות היא שלב קריטי בכל טכניקות המולקולה הבודדת.

יש לבחור רק עקבות העומדות בקריטריונים מוגדרים היטב. כאן קריטריונים אלה הם אנטי קורלציה, שלבי הלבנה בודדים ומישורים שטוחים. לאחר מכן, הציגו את המולקולות השמורות בזו אחר זו וקבוצה אחת של עקבות עוצמה בחרו מרווח זמן שבו כל הקומות הרביעיות כבר מולבנות.

חשב את עוצמת הרקע של האלומה עבור מרווח זמן זה, ולאחר מכן בחר את טווח יעילות ה-FRET שבו שני הצבעים ב-Hsp90 קיימים, והקפד לא לכלול עקבות עם אירועים מהבהבים. חשב את עקבות הקרינה החלקית. אל תכלול מולקולות עם יחס אות לרעש נמוך בעקבות

לאחר מכן, צור תחזיות דו-ממדיות של נתוני הקרינה החלקית והפעל את כלי חישוב האוכלוסייה היחסית. לחץ על Init. צייר מצולע סביב שיא העניין.

ולחץ על ספירה כדי לחשב את האוכלוסייה היחסית לשיא זה. צור היסטוגרמה תלת-ממדית של נתוני הקרינה החלקית ונרמל את ההיסטוגרמה. הגדל את הפרמטרים הראשוניים עבור התאמה גאוס תלת מימדית והוסף את אוכלוסיות המצב לסוף וקטור הפרמטר.

התאם את הנתונים והצג את התוצאות. לאחר הגדרת המיקום והרוחב של כל מצב במרחב הפלואורסצנטי החלקי התלת-ממדי, אתחל את ממשק מודל מרקוב הנסתר. בחר את מספר המצבים המתאים, את מספר הממדים של אות הכניסה ואת סוג הקלט.

בצע אופטימיזציה של פרמטרי HMM כדי לקבוע את אומדני הסבירות המקסימלית עבור הסתברויות המעבר. חזור על בחירת האוכלוסייה, ההתאמה ומיטוב HMM עבור קבוצות משנה של נתונים. לבסוף, חשב את מרווח הסמך עבור הסתברויות המעבר וכווץ את מצבי הקונפורמציה כדי לפשט את הנתונים לניתוח נוסף.

מצבי הקונפורמציה של חלבון Hsp90 נחקרו עם מולקולה בודדת בשלושה צבעים FRET בנוכחות נוקלאוטיד המדווח המסומן AMP-PMP. חמישה מצבי קונפורמציה היו ניתנים להבחנה על ידי עוצמות פלואורסצנטיות כאשר ארבעה מהמצבים הללו היו נבדלים מבחינה תפקודית. מולקולה בודדת בשלושה צבעים FRET הביאה לנתוני הקרינה החלקית המשתרעים על פני מרחב תלת מימדי.

הקרנות דו-ממדיות שימשו כדי לסייע בהפרדת המצבים מכיוון שניתן להבחין בין כל המצבים הצפויים תיאורטית בתנאי הניסוי על ידי התפרחת החלקית שלהם בהקרנות דו-ממדיות. האוכלוסיות היחסיות של מדינות אלה נקבעו מהתחזיות הדו-ממדיות ושימשו כאילוצים להתאמות גאוס תלת-ממדיות. האופטימיזציה והמידול של אנסמבל 3D HMM שלאחר מכן סיפקו את הסתברויות מעבר המצב שחולצו.

רווחי סמך חושבו עבור כל קבוע קצב שחולץ. חזרה על הניסויים בנוכחות 250 מיקרו-מולרים נוספים ללא תווית AMP-PMP הבהירה את השפעת הקישור של נוקלאוטיד אחד על אתר הקישור השני בדימר Hsp90. קריסת הקונפורמציות הקשורות והלא קשורות אפשרה לחשב את זמן השהייה הממוצע עבור דיסוציאציה פלואורסצנטית של AMP-PMP מ-Hsp90 בנוכחות ובהיעדר AMP-PMP נוסף ללא תווית.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ מידע קינטי ממערכת חלבונים דינמית באמצעות FRET רב צבעוני ומיקרוסקופ TIRF. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים במדעי החיים לקבוע אינטראקציות מתואמות במערכות מרובות חלבונים. זה חשוב להבנה מעמיקה יותר של מנגנוני ויסות בסיסיים כגון שיתוף פעולה.