Name: באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: למד את דינמיקת מערכות חלבון מורכבות באמצעות טכניקת FRET תלת-צבעי ברמת מולקולה בודדת. השיטה מאפשרת חילוץ מידע קינטי וחקר אינטראקציות מתואמות ושיתופיות בחלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומן על ידי קרן מחקר גרמני (מוסד 39/969-1), המועצה האירופית למחקר באמצעות הסכם גרנט ERC 681891 (ש. ע.)..

<ol><li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+dynamics%2C+assembly%2C+and+evolution+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li>
<li>Henzler-Wildman, K., Kern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+personalities+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic personalities of proteins.</a> Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).</li>
<li>Hohng, S., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Three-Color+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Three-Color FRET.</a> Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).</li>
<li>Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+movement+and+bending+of+nucleic+acid+structures+visualized+by+multicolor+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).</li>
<li>Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+four-color+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Single-molecule four-color FRET.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).</li>
<li>Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+90%27s+mechanochemical+cycle+is+dominated+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).</li>
<li>Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-colour+FRET+reveals+directionality+in+the+Hsp90+multicomponent+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery.</a> Nat Commun. 5, 4192(2014).</li>
<li>Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multicolor+Single-Molecule+FRET+Approach+to+Study+Protein+Dynamics+and+Interactions+Simultaneously%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously.</a> Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).</li>
<li>Yengo, C. M., Berger, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+and+resonance+energy+transfer%3A+Powerful+tools+for+measuring+real+time+protein+dynamics+in+a+physiological+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).</li>
<li>Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Nucleotide+Binding+in+Hsp90+and+Its+Regulation+by+Aha1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1.</a> Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).</li>
<li>Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Information+from+Single-molecule+FRET+Experiments+Using+the+Fast+Nano-positioning+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System.</a> J Vis Exp. (120), e54782(2017).</li>
<li>Stephanopoulos, N., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+effective+protein+bioconjugation+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Choosing an effective protein bioconjugation strategy.</a> Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).</li>
<li>Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Fluorophore+Attachment+on+Protein+Conformation+and+Dynamics+Studied+by+spFRET+and+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%28Weinheim+an+der+Bergstrasse%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-color+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%3A+monitoring+multiple+interactions+and+distances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances.</a> Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).</li>
<li>Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nat Methods. 14, 174-180 (2017).</li>
<li>Rabiner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.cs.ubc.ca/~murphyk/Software/HMM/rabiner.pdf">A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition.</a> Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).</li>
<li>Fink, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFink%2C+GA+%22Markov+Models+for+Pattern+Recognition%22">Markov Models for Pattern Recognition</a>. , Springer London. London. (2014).</li>
<li>Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Likelihood-Ratio+Tests+for+Hidden+Markov+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models.</a> Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).</li>
<li>Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confidence+intervals+for+hidden+Markov+model+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Math+Stat+Psychol%22%5BJournal%5D)">Confidence intervals for hidden Markov model parameters.</a> Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).</li>
<li>McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-Molecule+FRET+Trajectories+Using+Hidden+Markov+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling.</a> Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).</li>
<li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+Rates+and+States+from+Biophysical+Time+Series%3A+A+Bayesian+Approach+to+Model+Selection+and+Single-Molecule+FRET+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data.</a> Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li>
<li>Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+Research+Tool+%28SMART%29%3A+an+integrated+approach+for+analyzing+single+molecule+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e30024(2012).</li>
<li>Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Analysis+beyond+Dwell+Times%3A+Demonstration+and+Assessment+in+and+out+of+Equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium.</a> Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dynamic+HSP90+complex+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).</li>
<li>Wayne, N., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+Hsp90+is+required+for+in+vivo+function.+Design+and+analysis+of+monomers+and+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).</li>
<li>Ali, M. M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+Hsp90-nucleotide-p23%2FSba1+closed+chaperone+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex.</a> Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).</li>
<li>Southworth, D. R., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-dependent+ensembles+of+conserved+conformational+states+define+the+Hsp90+chaperone+ATPase+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle.</a> Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).</li>
<li>Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+force+sensing+of+filamin+revealed+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp012016x">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-mode+waveguides+for+single-molecule+analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.</a> Science. 299 (5607), 682-686 (2003).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

אנו מציגים בהליך ניסיוני להשיג smFRET תלת-צבעי נתונים עבור מערכת חלבונים מורכבים, תיאור שלב אחר שלב של הניתוח של מדידות אלה. גישה זו מציעה את האפשרות ייחודי להעריך ישירות המתאם בין מספר אתרים אינטראקציה או שינויים הסתגלותי.
על מנת לקבל נתונים יחיד מולקולה צבע רב מתאימים חלבונים חשוב לבצע מדידות לשחזור ברמת רעש נמוכה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול פסיבציה משטח יעיל ואמין עבור זרימת קאמרית9. צפיפות מספיקות של מולקולות ותשמרו על פני השטח אמור לשמש כדי להגדיל את התש...

חלבונים רבים ממלאים תפקידם במתחמי דינמי עם מולקולות אחרות, מתווכת על-ידי שינויים הסתגלותי ואגודות ארעי על מגוון רחב של צירי זמן-1,-2,-3. מצמידים חיצוני כמקור אנרגיה (למשל, ATP) אינטראקציות דינמי אלה יכולים להוביל כיוון במחזור פונקציונלי ולתחזק בסופו של דבר ללא שיווי משקל היציב-המדינה בתא, תנאי מוקדם לכל החיים.
כדי להבין באופן מלא את מכונות מולקולריות אלה, תיאור סטטי מודרכת על ידי מחקרים מבניים אינה מספיקה. בנוסף, זה חיוני לא ידע קינטי מהמודל המשמש כבסיס וכדי לקבוע את קבועי קצב קינטי. קיימות מספר שיטות לאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של האינטראקציות בינארית בין שתי מולקולות של עניין, למשל, פני השטח פלזמון תהודה, שיטות הרפיה עם הבדיקה ספקטרוסקופיות (למשל, קפיצה או זרימה עצר טכניקות), ותהודה מגנטית גרעינית. אולם, ישימות שלהם הוא ברוב המקרים מוגבל שתי המדינות מערכות פשוטות (למשל, אחד מאוגד, מדינה לא מאוגד) עקב בממוצע הטמון בניסויים בצובר. במקרים שבהם מעורבים יותר מדינות או intermediates, הן מפיקות רק תערובת מורכבת של הקבועים קצב. מולקולה בודדת שיטות כגון פינצטה אופטית או מגנטי או smFRET שני צבעים, קרי, תורם אחד אחד מקבל fluorophore, עם דגימת משטח. מרותק למיטה יכול לשחזר את קבועי קצב לכל נצפו שינויים הסתגלותי. אולם, כשמדובר אינטראקציות המשפיעים על אתר קישור אחד או יותר, שיטות אלה נשארים מוגבל, המידע לאינטראקציות מתאם אפשרי של השניים (או יותר) רק יהיה נגיש דרך עקיפה מסקנות ערכה של ניסויים.
צבע רב smFRET4,5,6,7,8,9 מציע הזדמנות ללמוד את האינטראקציה בין רכיבים אלה באופן ישיר, בזמן אמת, תחת תנאים ליד-פיזיולוגיים10. זה מתיר אחד לחקור לדוגמה, הכריכה תלויי-קונפורמציה של ליגנד או חלבון אחר8,9,11. הגישה הכללית המובאת כאן היא לסמן את protein(s) של עניין-עמדות מסוימות, כדי לצרף חלבון אחד על פני השטח של התא מדידה, וכדי לעקוב אחר עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן על TIRFM פריזמה-סוג (עבור פרטים ראה 9 , 12). הקרבה המרחבי של צבעים שונים ואז יכול להיקבע מתוך העברת האנרגיה ביניהם. תיוג אסטרטגיות עשויים להשתנות מחלבון לחלבון (נבדקה 13), קווים מנחים כדי להימנע חפצים במדידות smFRET קיימים14.
מאז צבע התורם יכול להעביר אנרגיה שונה מקבל צבע בניסוי צבע רב smFRET, המיקום היחסי של כל צבעי אינו נגיש של עירור של צבע אחד לבד15,16. אבל בשילוב עם מתחלפים עירור לייזר (אלכס17, ו שנסקרה ב 18) שיטה זו מספקת את כל המידע-עתיים-פחות משנייה והרזולוציה תת ננומטר.
המנהל, נתוני מבנה יכולה להיות מושגת על ידי שימוש של המרחקים בין צבע ברזולוציה גבוהה מחושב משילוב של כל עוצמות קרינה פלואורסצנטית בניסוי צבע רב smFRET עם אלכס. עם זאת, כאן אנו מתמקדים זיהוי מצב, הפרדה, כמו גם הפקת מודלים קינטי, שבו צבע רב smFRET היא הכרחית. כאשר "רק" מבנה נחישות על ידי טריאנגולציה היא הרצויה, ערכת ניסויים פשוטים smFRET שני צבעים עם יחס אות לרעש גבוה יכול להיות בביצוע12,19.
אנו משתמשים על ידי קרינה פלואורסצנטית חלקית (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) כמדד להעברת אנרגיה בין שני fluorophores7. PF מחושבת על פי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקביל היעילות סריג של ניסוי שני צבעים:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
איפה, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> הוא עוצמת ב פליטה ערוץ em לאחר עירור עם צבע לשעברו- c הוא מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. זיהוי ערוצי מייצגים באותה התנוחה לדוגמה קאמרית, אבל הרשומה טווחי האור פלורסצנטיות ספקטרלי שונים. אותו מזהה עירור, פליטה נמצאים בשימוש פרוטוקול זה (קרי, "כחול", "ירוק" או "אדום").
בגלל חסרונות ניסיוני עוצמות קרינה פלואורסצנטית נמדד תלויים לא רק על העברת אנרגיה, אלא גם על מאפייני fluorophore וההתקנה. על מנת להשיג את יעילות העברת אנרגיה אמיתית בין שתי fluorophores, עוצמות נמדד צריך לתקן. ההליך הבא מבוסס על התייחסות9. גורמים תיקון דליפה נראית לעין (lk, קרי, הגילוי של פוטונים מ fluorophore בערוץ המיועד צבע אחר), גאמה נראית לעין (ag, קרי, התשואה קוונטית זריחה של לצבוע את זיהוי יעילות של הערוץ) מתקבלים מן עקבות מולקולה בודדת המציגים מקבל של הלבנת אירוע.
דליפת לצבוע התורם לתוך בכל ערוץ אפשרי מקבל מחושבת על פי כל נקודות נתונים עקבות קרינה פלואורסצנטית מוקלט שבו מקבל לצבוע מולבן אך התורם הוא עדיין פלורסנט (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
החציון של ההיסטוגרמה זליגת משמש כגורם זליגת נראית לעין. לאחר תיקון עבור דליפה, הגורם גמא לכאורה נקבע מתוך אותה קבוצה של עקבות. הוא מחושב על ידי חלוקת השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ מקבל על ידי השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ התורם על הלבנה של לצבוע מקבל:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
כאשר c הוא שוב בערוץ זיהוי עבור מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. החציון של ההתפלגות וכתוצאה מכך משמש פקטור התיקון נראית לעין.
עוצמות המתוקן בכל אחד מהערוצים מתקבלים על ידי:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
PF לאחר מכן מחושב על פי:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
ניתן להפריד בין אוכלוסיות שונות במרחב רב ממדית שמקיפות את s PF. המיקום ואת הרוחב של כל מדינה נקבע על ידי התאמת הנתונים עם פונקציות גאוסיאנית רב-מימדי. אופטימיזציה עוקבות של אחד הממ גלובלית המבוססת על כל עקבות PF מספק תיאור כמותי של קינטיקה התצפיות. אפילו שינויים קטנים של התעריפים הן לזיהוי.
HMMs מספקים דרך של אומדן משוער מודל המדינה מאוסף של עקבות הזמן רועש. המערכת נחשבת באחד ערכה של בדידה, הברית מוסתרים בכל זמן נתון, התצפית בפועל (קרי, הפליטה) היא פונקציה הסתברותית של המדינה מוסתרים20. במקרה של נתונים smFRET TIRFM, פליטת הסתברויות bאני לכל המדינה אני שניתן למדל באמצעות פונקציות צפיפות ההסתברות גאוסיאנית רציפה. בנקודות זמן בדידים מפוזרים באופן קבוע, מעברים מאחד למדינה אחרת יכולה להתרחש לפי ההסתברות מעבר הזמן-שמורה, רק תלויה במצב הנוכחי. המטריקס המעבר A מכיל אלה הסתברות המעבר ij בין כל המדינות מוסתרים. התפלגות המצב ההתחלתי של <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> נותן ההסתברויות ספציפיים- <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> לנקודה בפעם הראשונה של עקבות הזמן. שימוש בגישה מרבי-הסבירות, פרמטרים אלה ניתן למטב בצורה הטובה ביותר לתאר את הנתונים עם קדימה-אחורה, באום-ולש אלגוריתמים20,21. זה מניב את estimators נראות מקסימלית (MLE). לבסוף, שניתן להסיק על רצף מצב סביר הפיק את המסלול של תצפיות עם אלגוריתם ויטרבי. בניגוד אחרים ניתוחים הממ של smFRET נתונים24,25,26 אנחנו לא משתמשים את הממ כמו גרידא "החלקה" של נתונים אבל תמצית המודל המדינה קינטי של ערכת הנתונים ללא הצורך עבור התאמת זמן להתעכב היסטוגרמות27. ניתוח הממ מתבצעת באמצעות קבצי script ללא צורך במיקור חוץ באמצעות איגור Pro. הטמעת הקוד מבוסס על התייחסות21. אנו מספקים ערכת תוכנה ונתונים למופת בדף שלנו לעקוב סעיפים 5 ו- 6 של פרוטוקול זה, (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). תוכנה מלא הינו זמין על פי בקשה.
נקודות הנתונים עם PF זמן &lt;-1 או PF &gt; 2 בערוץ כל זיהוי מוקצים ההסתברות פליטה מינימלית על כל המדינות (10-200). פעולה זו מונעת מעברים מלאכותי בנקודות אלו נתונים.
הפרמטרים עבור ההסתברויות פליטה מתקבלים מן ההתאמה של ההיסטוגרמה PF 3D עם פונקציות לפי עקומת גאוס, כפי שמתואר בשלב 5.7. פרמטרים אלה נשמרים קבועים במהלך אופטימיזציה של הממ.
הגישה שהוצגו, הווקטור הפצה המצב ההתחלתי של המטריקס המעבר משמשים באופן גלובלי לתאר את ההרכב כולו עקבות. והם מתעדכנים בהתבסס על כל N מולקולות של ערכת הנתונים על פי הפניה27.
התחל פרמטרים עבור התפלגות המצב ההתחלתי נקבעים מתוך תחזיות דו-מימדית של ההיסטוגרמה PF (שלב 5.3) ולא ההסתברויות המעבר מוגדרות כ 0.05 למעט ההסתברויות כדי להישאר באותו המצב, אשר נבחרו כך כי ההסתברות לעזוב את מצב מסוים מנורמל לאחדות.
שיטה פרופיל הסבירות משמש כדי לתת מרווחי ביטחון (CIs) עבור כל המעבר המחירים21,22, אשר לשמש הערכות משמעותי עבור חוסר הבהירות. לחישוב גבולות של המודיע על שיעור מסוים, ההסתברות המעבר של ריבית קבוע בערך השונה MLE. זה מניב את λ דגם המבחן '. מבחן הסבירות יחס (LR) הסבירות <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> בהתחשב ערכת הנתונים 0 מתבצע על פי:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
ביטחון 95% המאוגד עבור הפרמטר הוא הגיע כאשר LR חורג 3.841, quantile 95% של x2-התפלגות עם דרגת חופש אחת22,23.
כוחה של השיטה הוא הפגין באמצעות של Hsp90. החלבון בשפע זה נמצא ב חיידקים וב פרוקריוטים והוא חלק תגובת לחץ הסלולר28. זה מטרה סמים מבטיח טיפול בסרטן29. Hsp90 הוא homodimer עם כיס כריכה נוקלאוטיד בתחום N-מסוף של כל יחידה משנית30. זה יכול לעבור במעברים בין לפחות שני הייצורים החיים באופן גלובלי מובהק, אחד סגור,31,19,פתוח, בצורת V קונפורמציה N-מסוף אחד32. הטבע dimeric ישירות מעלה את השאלה של יחסי הגומלין בין האתרים מחייב נוקלאוטיד שני ב- Hsp90.
בחלק זה, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור רכישת נתונים וניתוח של ניסוי smFRET תלת-צבעי על שמרים Hsp90, נוקלאוטיד. הכריכה תלויי-קונפורמציה של המגבר-PNP שכותרתו fluorescently (AMP-PNP *, אנלוגים הלא-hydrolyzable ATP) ניתוח. היישום של ההליך המתואר היתרים המחקר של האיגוד נוקלאוטיד ו באותו הזמן את השינויים הסתגלותי של Hsp90, ובכך חושף את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של Hsp90.

<table><tbody><tr><td><הגדרה>חזקה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שיכוך רעידות&nbsp; &nbsp;</td><td>ניופורט, אירווין, קליפורניה, ארה"ב</td><td>RS2000</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 473nm LX 75mW LASER</td><td>Coherent Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1185052</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 532nm LS 50mW LASER</td><td>Coherent Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1261779</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 594nm LS 60mW LASER</td><td>Coherent Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1233470</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 637nm LX 140mW LASER</td><td>Coherent Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1196625</td><td></td></tr><tr><td>יחידת בקרת לייזר</td><td>Coherent Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1234465</td> עדשות טלסקופ <td>אספריות מדעיות מרחוק</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs Inc, ניוטון, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td></td><td>d=25.4 מ"מ, f=50 מ"מ ו-f=100 מ"מ</td></tr><tr><td>CF ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>ZET 473/10</td><td>עירור מסנן ניקוי</td></tr><tr><td>CF ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>ZET 532/10</td><td>עירור מסנן ניקוי</td></tr><tr><td>CF ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; בינגן, גרמניה</td><td>ZET 594/10</td><td>עירור מסנן ניקוי</td></tr><tr><td>CF ex4</td><td>Thorlabs Inc, ניוטון, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>FL635-10</td><td>עירור מסנן ניקוי</td></tr><tr><td>DM ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; בינגן, גרמניה</td><td>ZQ594RDC</td><td>עירור מראה דיכרואית</td></tr><tr><td>DM ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; בינגן, גרמניה</td><td>570DCXR</td><td>עירור מראה דיכרואית</td></tr><tr><td>DM ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; בינגן, גרמניה</td><td>ZQ491RDC</td><td>עירור מראה דיכרואית</td></tr><tr><td>AOTFnC-Vis</td><td>AA Opto-Electronic, אורסיי, צרפת</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&lambda;/4 צלחת</td><td>Thorlabs Inc, ניוטון, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon Instruments Inc, מלוויל, ניו יורק, ארה"ב</td><td></td><td>high-NA אובייקטיבי</td></tr><tr><td>piezo פוקוס positioner MIPOS 250 CAP</td><td>piezosystem jena GmbH, Jena, בקר פייזו גרמניה</td><td></td><td>NV 40/1 CLE</td></tr><tr><td>piezo צעד</td><td>ניופורט, אירווין, קליפורניה, ארה"ב</td><td>PZA12</td><td>PZC200-KT NanoPZ ערכת מפעיל</td></tr><tr><td>עדשות אספריות אכרומטיות</td><td>Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, G&ouml; ttingen, גרמניה</td><td>G322-304-000</td><td>d=50 מ"מ, f=200 מ"מ</td></tr><tr><td>חריץ אופטי מתכוונן</td><td>Owis GmbH, Staufen i. Br., גרמניה</td><td>27.160.1212</td><td>מקסימום צמצם 12 x 12 מ"מ</td></tr><tr><td>DM det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>T 600 LPXR</td><td>זיהוי מראה דיכרואי</td></tr><tr><td>DM det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>H 560 LPXR superflat</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>HC BS R635</td><td>זיהוי מראה דיכרואי</td></tr><tr><td>BP det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>525/40 BrightLine HC</td><td>זיהוי מסנן פס פס</td></tr><tr><td>BP det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>586/20 BrightLine HC</td><td>זיהוי מסנן פס</td></tr><tr><td>פס BP det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, גרמניה</td><td>631/36 BrightLine HC</td><td>זיהוי מסנן פס</td></tr><tr><td>פס BP det4</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; בינגן, גרמניה</td><td>700/75 ET</td><td>זיהוי מסנן פס פס פס</td></tr><tr><td>זיהוי תריסים אופטיים</td><td>Vincent Associates, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב</td><td>Uniblitz VS25S2T0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor Technology Ltd, בלפסט, צפון אירלנד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כרטיס קלט/פלט דיגיטלי, PCIe-6535</td><td>National Instruments, אוסטין, טקסס, ארה"</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ב משאבת מזרק</td><td>מכשיר הרווארד, הוליסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>PHD22/2000</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</ חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>>><תא זרימה חזק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קוורץ שקופיות</td><td>G. Finkenbeiner Inc, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td></td><td>Spectrosil2000, h=3 מ"מ</td></tr><tr><td>סרט TEGADERM</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, גרמניה</td><td>1626W</td><td>10 x 12 ס"מ</td></tr><tr><td>ספריי דבק</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, גרמניה</td><td>Photo Mount 050777</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, גרמניה</td> שמן טבילה <td>Immersol G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, המבורג, גרמניה</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>פריזמה</td><td>Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, גרמניה</td><td></td><td>Suprasil1</td></tr><tr>מחזיק <td></td><td></td><td>מנסרת אלומיניום</td><td>שנבנה</td></tr> <tr><td></td><td>בהתאמה אישיתThorlabs Inc, ניוטון, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td></td><td>עם קידוח מותאם אישית</td></tr><tr><td>Tygon S3 E-3603 צינורות</td><td>neoLab Migge GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>2-4450</td><td>ACF00001</td></tr><tr><td>צינורות PTFE</td><td>Bohlender GmbH, Gr&uuml; nsfeld, גרמניה</td><td>S1810-08</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Sample</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td><td></td><td></td><td>UniProt ID P02829</td></tr><tr><td>נגזרות Maleimide של Atto488, Atto550</td><td>ATTO-TEC GmbH, זיגן, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP*</td><td>Jena Bioscience, Jena, גרמניה</td><td></td><td>&gamma;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td></tr><tr><td>Fluospheres</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב</td><td>F8764</td><td>שונה באמין, 0.2 &mu; m, צהוב-ירוק פלואורסצנט</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</strong</td><td>>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis</td><td>Andor Technology Ltd, בלפסט, צפון אירלנד</td><td></td><td>גרסה 4.30</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, אוסטין, טקסס, ארה"ב</td><td></td><td>גרסה 2012, 32 סיביות; שונות בקרת חומרה</td></tr><tr><td>MDS תוכנת בקרת MDS</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td>version 2.03a</td></tr><tr><td>Coherent Connection</td><td>Coherent Inc, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td></td><td>גרסה 3</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics Inc, פורטלנד, אורגון, ארה"ב</td><td></td><td>גרסה 6.37</td></tr></tbody></table>

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

העברת אנרגיה תהודה של מולקולה בודדת פורסטר (smFRET) הפך טכניקה biophysical בשימוש נרחב כדי ללמוד את הדינמיקה של מולקולות. עבור רבים למכונות המולקולריות בחלבונים התא יש לפעול יחד עם שותפים אינטראקציה במחזור תפקודית כדי למלא את המשימה שלהם. ההרחבה של שני צבעים לצבע מרובה smFRET מאפשר לחקור בו זמנית אינטראקציה אחד או יותר או לשינוי הסתגלותי. זה לא רק מוסיף מימד חדש ניסויים smFRET אך גם מציעה את האפשרות ייחודי ללמוד ישירות רצף האירועים כדי לזהות אינטראקציות מתואם כאשר באמצעות דוגמה קיבוע פלורסצנטיות החזרה גמורה מיקרוסקופ (TIRFM). לכן, צבע רב smFRET הוא כלי רב-תכליתי ללמוד למערכות ביולוגיות מתחמי באופן כמותי, בפירוט שעצם בעבר.
כאן, אנחנו מדגימים כיצד להתגבר על האתגרים המיוחדים של צבע רב smFRET ניסויים על חלבונים. אנו מציגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים להשגת הנתונים, לחילוץ מידע קינטי. זה כולל מעקב קריטריוני הבחירה מהמדינה, ההתאוששות של המדינה מסלולים מתוך נתוני רעש באמצעות אנסמבל תלת-ממד של מודל מרקוב חבוי (הממ). לעומת שיטות אחרות, המידע קינטי לא החלים להתעכב זמן היסטוגרמות אלא ישירות מאת הממ. המסגרת נראות מקסימלית מאפשר לנו להעריך באופן ביקורתי את מודל קינטי וכדי לספק אי ודאות משמעותיים על המחירים.
על-ידי החלת שיטת שלנו החלבון הלם חום 90 (Hsp90), אנו מסוגלים disentangle האיגוד נוקלאוטיד והשינויים הסתגלותי הכללית של החלבון. זה מאפשר לנו לצפות ישירות את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של דיימר Hsp90.

צבע רב smFRET המידות לאפשר זיהוי ישיר קורלציה בין שניים או יותר אתרים אינטראקציה ברורים. זה הופך את הטכניקה הייחודית לחקור מערכות רכיבים מרובים, כגון חלבון מתחמי. אנו מתמקדים המצגת של smFRET תלת-צבעי ניסוי כאן, אשר משמש דוגמה להמחשה.
תהליך העבודה הכללי של השיטה מוצגת באיור1. החלק הראשון כולל את ההקלטה של צבע רב smFRET נתונים על מיקרוסקופ TIRF מנסרה-סוג. האסטרטגיה מצורף משטח, את התרשימים של ההתקנה מת...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל נתונים smFRET תלת-צבעי וניתוח שלה עם אנסמבל תלת-ממד מודל מרקוב חבוי. מתוך תפיסה זו, מדענים יכולים לחלץ מידע קינטי מערכות חלבונים מורכבים, כולל cooperativity או אינטראקציות מתואם.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את הדינמיקה של מערכות חלבון מורכבות בצורה כמותית תוך התמקדות באינטראקציות מתואמות כגון שיתוף פעולה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכמותית שבו יש חשיבות מרכזית למתחמי חלבונים ולאינטראקציות הדינמיות שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ליישם FRET דינמי רב צבעוני של מולקולה בודדת על מערכות רלוונטיות מבחינה ביולוגית.לפני הרכבת תא הזרימה, חתוך תעלת זרימה בסרט דבק שקוף בעובי 40 מיקרון, רסס דבק קיבוע מהיר בצד הלא דביק של הסרט ואפשר לדבק להתייבש. כדי להתחיל בהרכבת תא זרימה, השג שקופית קוורץ התמזגה פונקציונלית PEG ביוטין PEG בעובי שלושה מילימטר עם חורי כניסה ויציאה. מרחו את הצד המצופה בדבק ריסוס של סרט התקרה על הצד הפונקציונלי של המגלשה תוך יישור התעלה עם ווי הכניסה והיציאה.מחממים את השקופית ל 80 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך דקה. לחץ את הסרט על השקופית למשך 30 שניות באמצעות שקופית מיקרוסקופ נוספת כדי לפזר את הלחץ באופן שווה. ואז הניחו למכלול להתקרר למשך דקה אחת.קלף את יריעת המגן המכסה את הדבק. הנח החלקת כיסוי על הדבק החשוף ליצירת תא הזרימה. מחממים את החדר ל 80 מעלות צלזיוס למשך דקה.לחץ על החלקת המכסה על הדבק למשך 30 שניות כדי לאטום את החדר ולאפשר לתא המורכב להתקרר. מרחו טיפת גליצרול על פני המנסרה לפני הנחת תא הזרימה מעל הפריזמה. התקן את תא הזרימה במחזיק למיקרוסקופ TIRF מסוג פריזמה רב צבעונית.חבר את צינורות הכניסה והיציאה בסיום. כדי להתחיל להגדיר את המכשיר למדידת שלושת הצבעים, פתח את תוכנת מצלמת ה-CCD המכפיל אלקטרונים, הגדר את חיישן EMCCD לטמפרטורה הנמוכה ביותר האפשרית. הגדר את מהירות ההעברה האנכית של המצלמה ל-3.3 מיקרו-שניות, בחר מתח שעון אנכי רגיל, הגדר את קצב הקריאה האופקי ל-17 מילי-הרץ ב-16 סיביות, את רווח ההגברה המוקדמת לשלוש ואת רמת הרווח של מכפיל האלקטרונים ל-1000.בחר טריגר צירוף חיצוני. הגדר את זמן החשיפה ל-70 אלפיות השנייה. ומשך הקלטת הסרט ל-750 מחזורי רכישה.צרו תיקייה חדשה לקובצי המדידה. אפשר שמירה אוטומטית בתוכנת EMCCD והגדר את תבנית הקובץ של מסגרת הסרט ל-TIFF. הגדר את נתיב השמירה האוטומטית של הקובץ לתיקיה החדשה שנוצרה.לאחר מכן פתח את התוכנה השולטת במסנן המתכוונן אקוסטו-אופטי, תוכנת בקרת הלייזר ותוכנת ההדק המסנכרנת את הלייזרים ה-AOTF, התריסים האופטיים והמצלמות. השתמש ב-AOTF כדי לכוונן את עוצמת הלייזר לכשלושה מילי-וואט לפני הכניסה לפריזמה. טען את דפוס ההפעלה המסנכרן את כל המכשירים לעירור הלייזר לסירוגין, ולאחר מכן התקן את מחזיק הדגימה במכשיר.הנח את קצה צינור הכניסה בצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את מאגר הניסוי. חבר את צינור היציאה למשאבת מזרק המוגדרת למצב נסיגה. שטפו את החדר עם 150 מיקרוליטר חיץ.מקד את מצלמת ה-CCD בממשק הפונקציונלי, יישר את קרני העירור ומזהמי פלואורסצנט אקונומיקה. לאחר מכן הזרימו 300 מיקרוליטר של תמיסה של 0.25 מיליגרם למיליליטר של אבידין נטול גליקוזיל וחוצצים לתוך התא ודגרו למשך דקה אחת. שטוף את אבידין נטול גליקוזיל לא קשור מהתא עם חיץ.לאחר מכן הזרימו 300 מיקרוליטר של חיץ עם ריכוז BSA של 0.5 מיליגרם למיליליטר דרך החדר כדי לחסום פגמים בתפקוד פני השטח. לאחר מכן, טען את תא הזרימה במנות של 150 מיקרוליטר של ביוטיניל פלואורסצנטי Hsp90 ב-BSA המכיל מאגר בהגדלת ריכוזי Hsp90 עד להשגת צפיפות פני שטח מספקת. שטפו חלבון לא קשור מהתא עם 300 מיקרוליטר של חיץ המכיל BSA.טען 150 מיקרוליטר של תמיסה של 25 ננו-מולרית של חיץ המכיל AMP-PMP ו-BSA מסומן לתוך התא ודגירה למשך חמש דקות. חזור על הטעינה והדגירה פעם אחת. לאחר מכן השתמש בצעד Piezo כדי להזיז את תא הדגימה בניצב לקרן העירור כדי לשנות את שדה הראייה כרצונך.התאם את מיקוד התמונה במידת הצורך. התחל את הקלטות המצלמה בתוכנת המצלמה על ידי לחיצה על כפתור קח אות כפי שמוצג. התחל את מחזורי רכישת העירור בתוכנת הטריגר כדי להתחיל ברכישת נתונים.כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את תוכנת הניתוח וייבא את הסרטים המוקלטים של שתי המצלמות. לחץ על מצא עקבות כדי לקבוע את עקבות עוצמת הקרינה המתאימות למולקולות בודדות פוטנציאליות. עבור כל מולקולה, חשב את סכום כל העקבות של אותה נקודה עם אותו צבע עירור.הערך את פרופילי העוצמה בכל הערוצים עבור רמה שטוחה בערך בעוצמת הגלם של המפרק ושלב הלבנה יחיד עבור כל צבעי העירור. חפש התנהגות אנטי-קורלטיבית בערוצי הזיהוי המתאימים והתרחשות של פלואורסצנטיות אדומה במעקב. אם כל הקריטריונים מתקיימים, שמור את עקבות הקרינה לניתוח נוסף.רק המולקולה המצוינת עומדת בקריטריונים בדוגמה זו. אל תכלול עקבות שאין להן מישורים שטוחים, המציגות אירועים מהבהבים ולא אנטי מתאם או שיש להן שלבי הלבנה מרובים. בחירת עקבות היא שלב קריטי בכל טכניקות המולקולה הבודדת.יש לבחור רק עקבות העומדות בקריטריונים מוגדרים היטב. כאן קריטריונים אלה הם אנטי קורלציה, שלבי הלבנה בודדים ומישורים שטוחים. לאחר מכן, הציגו את המולקולות השמורות בזו אחר זו וקבוצה אחת של עקבות עוצמה בחרו מרווח זמן שבו כל הקומות הרביעיות כבר מולבנות.חשב את עוצמת הרקע של האלומה עבור מרווח זמן זה, ולאחר מכן בחר את טווח יעילות ה-FRET שבו שני הצבעים ב-Hsp90 קיימים, והקפד לא לכלול עקבות עם אירועים מהבהבים. חשב את עקבות הקרינה החלקית. אל תכלול מולקולות עם יחס אות לרעש נמוך בעקבותלאחר מכן, צור תחזיות דו-ממדיות של נתוני הקרינה החלקית והפעל את כלי חישוב האוכלוסייה היחסית. לחץ על Init. צייר מצולע סביב שיא העניין.ולחץ על ספירה כדי לחשב את האוכלוסייה היחסית לשיא זה. צור היסטוגרמה תלת-ממדית של נתוני הקרינה החלקית ונרמל את ההיסטוגרמה. הגדל את הפרמטרים הראשוניים עבור התאמה גאוס תלת מימדית והוסף את אוכלוסיות המצב לסוף וקטור הפרמטר.התאם את הנתונים והצג את התוצאות. לאחר הגדרת המיקום והרוחב של כל מצב במרחב הפלואורסצנטי החלקי התלת-ממדי, אתחל את ממשק מודל מרקוב הנסתר. בחר את מספר המצבים המתאים, את מספר הממדים של אות הכניסה ואת סוג הקלט.בצע אופטימיזציה של פרמטרי HMM כדי לקבוע את אומדני הסבירות המקסימלית עבור הסתברויות המעבר. חזור על בחירת האוכלוסייה, ההתאמה ומיטוב HMM עבור קבוצות משנה של נתונים. לבסוף, חשב את מרווח הסמך עבור הסתברויות המעבר וכווץ את מצבי הקונפורמציה כדי לפשט את הנתונים לניתוח נוסף.מצבי הקונפורמציה של חלבון Hsp90 נחקרו עם מולקולה בודדת בשלושה צבעים FRET בנוכחות נוקלאוטיד המדווח המסומן AMP-PMP. חמישה מצבי קונפורמציה היו ניתנים להבחנה על ידי עוצמות פלואורסצנטיות כאשר ארבעה מהמצבים הללו היו נבדלים מבחינה תפקודית. מולקולה בודדת בשלושה צבעים FRET הביאה לנתוני הקרינה החלקית המשתרעים על פני מרחב תלת מימדי.הקרנות דו-ממדיות שימשו כדי לסייע בהפרדת המצבים מכיוון שניתן להבחין בין כל המצבים הצפויים תיאורטית בתנאי הניסוי על ידי התפרחת החלקית שלהם בהקרנות דו-ממדיות. האוכלוסיות היחסיות של מדינות אלה נקבעו מהתחזיות הדו-ממדיות ושימשו כאילוצים להתאמות גאוס תלת-ממדיות. האופטימיזציה והמידול של אנסמבל 3D HMM שלאחר מכן סיפקו את הסתברויות מעבר המצב שחולצו.רווחי סמך חושבו עבור כל קבוע קצב שחולץ. חזרה על הניסויים בנוכחות 250 מיקרו-מולרים נוספים ללא תווית AMP-PMP הבהירה את השפעת הקישור של נוקלאוטיד אחד על אתר הקישור השני בדימר Hsp90. קריסת הקונפורמציות הקשורות והלא קשורות אפשרה לחשב את זמן השהייה הממוצע עבור דיסוציאציה פלואורסצנטית של AMP-PMP מ-Hsp90 בנוכחות ובהיעדר AMP-PMP נוסף ללא תווית.לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ מידע קינטי ממערכת חלבונים דינמית באמצעות FRET רב צבעוני ומיקרוסקופ TIRF. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים במדעי החיים לקבוע אינטראקציות מתואמות במערכות מרובות חלבונים. זה חשוב להבנה מעמיקה יותר של מנגנוני ויסות בסיסיים כגון שיתוף פעולה.

using-three-color-single-molecule-fret-to-study-correlation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת האנאיזוטרופיה הפלואורסצנטית כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבון תסמונת שוואכמן-יהלום (SBDS) המתויג פלואורופור לבין גורם התארכות דמוי 1 GTPase (EFL1). על דגירה של חלבוני SBDS עם ריכוזים הולכים וגדלים של EFL1, נצפתה עלייה מתמדת באנאיזוטרופיה, מה שמצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שני החלבונים.

זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

אינטראקציות חלבון-חלבון קריטי עבור מערכות ביולוגיות, מחקרים של קינטיקה איגוד לספק תובנות הדינמיקה והתפקוד של מתחמי חלבון. אנו מתארים שיטה מכמת את הפרמטרים קינטי של חלבון מורכב באמצעות קרינה פלואורסצנטית והעברת אנרגיה תהודה הטכניקה זרימה עצר.

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

אנו מתארים כאן פרוטוקול לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בין שני חלבונים מבוטאים בצורה שונה מאוד ב- Pseudomonas aeruginosa חי באמצעות מדידות FLIM-FRET. הפרוטוקול כולל מבני זני חיידקים, קיבוע חיידקים, הדמיה ושגרת ניתוח נתונים לאחר הדמיה.

מדידות FLIM-FRET של אינטראקציות חלבון-חלבון בחיידקים חיים.

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט...

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

כאן אנו מציגים, שיטה לדמיין היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי BiFC מבוסס FRET-FLIM assay. שיטה זו היא בעלת ערך לחקר מתחמי אינטראקציה בין חלבון חלבון ב- vivo.

קביעת אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים של גורם שעתוק של קופסת MADS וחלבון חיישן סידן על ידי BiFC-FRET-FLIM Assay

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

למד את דינמיקת מערכות חלבון מורכבות באמצעות טכניקת FRET תלת-צבעי ברמת מולקולה בודדת. השיטה מאפשרת חילוץ מידע קינטי וחקר אינטראקציות מתואמות ושיתופיות בחלבונים.

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

גלה סרטונים נוספים