שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד כמותית את צריכת המזון של דרוזופילה בוגרת, המספקת אמצעי להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות כגון הפעלה תרמוגנטית ואופטוגנטית של נוירונים. מדדים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההזנה, כגון הנוירו-מכניקה של רעב, שובע ותיאבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מכמתת בו זמנית את צריכת המזון של קבוצות מרובות של זבובים, מה שהופך אותה לשימושית במיוחד לזיהוי זבובים האכלה חריגה במסכים גנטיים.

כדי להתחיל, אספו אספקה להכנת המיכל החיצוני. השעו 0.5 גרם אגרוז ו -50 מיליליטר מים מזוקקים כפולים. מחממים בתסיסה תכופה, ומרתיחים להמסה מלאה על מערבל מגנטי עם פלטת חום.

כאשר האגרוז 1% מתקרר לכ-60 מעלות צלזיוס, העבירו חמישה מיליליטר למיכל חיצוני ריק והשאירו את המיכל פתוח עד שהאגרוז התקרר לטמפרטורת החדר כדי להניב כרית אגרוז. לאחר מכן, הוסף 0.5 גרם אגרוז ל -50 מיליליטר מים מזוקקים כפולים. מחממים בתסיסה תכופה ומרתיחים להמסה מלאה על מערבל מגנטי עם צלחת חום.

כאשר האגרוז 1% מתקרר לכ-60 מעלות צלזיוס, הוסיפו 1.71 גרם סוכרוז לאגרוז כדי לקבל 100 מילימול סוכרוז. הוסף 0.25 גרם צבע כחול לתמיסת האגרוז כדי לקבל 0.5% משקל לנפח מזון צבוע מסומן. ואז הכינו את המיכל הפנימי.

הניחו את המכולות הפנימיות הריקות על משטח אופקי שטוח. לאחר מכן הוסיפו 750 מיקרוליטר של מזון עם תווית צבע כחול למיכלי מזון בודדים. מניחים להתמצקות לפחות חמש דקות.

העבירו מיכל פנימי מלא למיכל חיצוני מוכן ומקמו אותו במרכז כרית האגרוז. הכן תאי האכלה עם מזון נטול צבע להפחתת רקע. השאירו את תאי ההאכלה פתוחים בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות, עד שדופן המיכל החיצוני נקי מעיבוי.

לפני ניסויים התנהגותיים, יש לאזן את תאי ההזנה המוכנים בטמפרטורת הניסוי של 30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי להבטיח שהטמפרטורה אחידה יחסית בתאי ההאכלה. כדי להתחיל בתהליך ההאכלה, העבירו בזהירות 20 זבובים מהבקבוקון הביתי שלהם לתא האכלה שחומם מראש על ידי הקשה עדינה. המשך בתהליך ההאכלה בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

הפסק להאכיל על ידי הקפאת תאי ההאכלה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. העבירו בזהירות 20 זבובים מבקבוקון אחד לתא האכלה על ידי הקשה עדינה. ולאחר מכן הנח את החדר הצידה על מערך התאורה.

למניפולציה אופטוגנטית, השתמש במערך של נוריות LED כתומות כמקור לגירוי האור, וקבע לוחית פרספקס אופקית מעל נוריות הלד כדי לתמוך בתאי ההזנה במהלך התאורה. שמור את ההתקנה בחממה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם 60% לחות. לעורר את זבובי ההדברה הגנטית במקביל לזבובי Taotie-GAL4 UAS CsChrimson, אך בתאי האכלה שונים.

המשך בתהליך ההאכלה למשך 60 דקות עם תאורה אחורית על ידי האור הכתום. לאחר מכן הקפיאו את תאי ההאכלה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הפסקת ההאכלה, שפכו את כל 20 הזבובים מתא ההאכלה על פיסת נייר שקילה.

לאחר מכן העבירו אותם לצינור של 1.5 מיליליטר בעזרת מברשת רכה. הוסף 500 מיקרוליטר PBST לצינור והומוגניזציה של הזבובים באמצעות טחנת טחינה ב-60 הרץ למשך חמש שניות. לאחר מכן ודא הומוגניזציה מספקת על ידי תצפית כאשר אין שברי חלקי גוף הניתנים לזיהוי.

סובב את הצינורות עם הומוגנטים למשך 30 דקות ב-1300 סל"ד כדי לפנות את הפסולת. לאחר הצנטריפוגה, העבירו 100 מיקרוליטר של סופרנטנט לבאר של צלחת 96 באר. כדי למנוע חישוב שגוי של סופגים הנגרמת על ידי פסולת, הוצא בעדינות את הצינור המשמש מהצנטריפוגה והפיל בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע למזרן.

לאחר טעינת כל הדגימות, הנח את הצלחת בקורא צלחות כדי למדוד את הסופג של הדגימות ב-630 ננומטר. תגובת ההזנה כומתה על ידי בדיקה ויזואלית וניקוד זבובים עם צבע הניתן לזיהוי במעיים. לאחר הפעלת תאי העצב של Taotie, כ-58% מזבובי Taotie dTRPA1 הפגינו התנהגויות אכילה חזקות.

ו-23% מהם הראו התנהגויות אכילה קלות. נוירונים מופעלים חריפים של Taotie-GAL4 על ידי TRPA1 הגדילו באופן דרמטי את צריכת המזון, מה שמרמז על כך שהנוירונים המסומנים ב-Taotie-GAL4 משתתפים בוויסות צריכת המזון של דרוזופילה בוגרת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת את כמות צריכת המזון לאחר מניפולציה של פעילות הנוירונים כדי לחקור מנגנונים עצביים של בקרת האכלה אצל Drosophila melanogaster בוגר.