שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

המטרה הכוללת של פרוטוקול קוקולטורה זה היא למדוד את ההשפעות של קרינה מייננת על חדירות חד-שכבתית של תאי אפיתל Caco-2 ותפקוד צומת הדוק בנוכחות או היעדר תאים חד-גרעיניים בדם היקפי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה של הקרינה והרדיואימונותרפיה לגבי השפעות סינרגטיות אפשריות בין חשיפה לקרינה מייננת לתפקוד תאי החיסון. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לבדוק גירויים שונים ואוכלוסיית תאים שונים ולצפות בתופעות ללא צימוד באמצעות מדידות משלימות אד הוק.

הליכי הקרינה נועדו להתייחס לחד-שכבת תא Caco-2 שכן נפח הגידול מוקרן עם הקרן המתאימה ומינון מדויק כמו במקרה של רדיותרפיה בחולה. שבוע לפני ההקרנה שלהם זרעו חמש פעמים 10 לתאי Caco-2 החמישיים בשני מיליליטר של מדיום שלם לתוך תרבית תאים סטרילית אחת בקוטר מיקרומטר אחד של מיקרומטר לכל באר בצלחת תרבית תאים של שש בארות. הוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום שלם טרי לתא התחתון של כל באר והניחו את התאים בחממת תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שבעה ימים.

ביום האחרון של הדגירה הוסף 25 מיליליטר פיקול לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. ושכבה בזהירות של 25 מיליליטר של דם מלא טרי שנאסף על ה-Ficoll. הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות.

והשתמש בפיפטה של פסטר כדי להעביר את התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי או PBMC בממשק לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את ה-PBMC המבודד בשתי שטיפות PBS של 10 מיליליטר. ותרבית את ה- PBMC במדיום שלם טרי למשך לא יותר משלוש עד חמש שעות בחממת תרבית התאים.

הגדר את אנרגיית קרני הרנטגן של הפוטון לשיא של שישה מגה-וולט. והניחו את תרבית התאים Caco-2 על יריעת פרספקס בעובי 1.4 סנטימטר במסלול צילומי הרנטגן ובמרחק של 100 סנטימטרים ממקור הקרינה. לאחר מכן הנח בולוס בעובי 0.57 סנטימטר על כל דגימה כדי להבטיח שיווי משקל של רכיב הקרינה המפוזר לאחור והחלקיקים הטעונים.

והשתמש בשדה קרינה שטוח וסימטרי של 20 על 20 סנטימטר רבוע ובקצב מינון של שלושה אפורים לדקה כדי להקרין את התאים. כדי להעריך את הפעילות המטבולית והכדאיות של תאי Caco-2, זרעו פעמיים פי 10 עד תאי Caco-2 החמישיים בכל באר של צלחת של 24 בארות 24 שעות לפני הקרנתם ב-1.25 מיליליטר של מדיום שלם. לאחר מכן החזירו את התאים לחממת תרבית התאים למשך 21 שעות.

למחרת מוסיפים 100 מיקרוליטר של חמישה מיליגרם לתמיסת MTT למיליליטר לכל באר ודוגרים על התאים למשך שלוש שעות נוספות. לאחר שטיפת התאים במיליליטר אחד של PBS, הוסף 500 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד לכל באר כדי להמיס את כל גבישי הפורמזאן המשתחררים על ידי תאי Caco-2 ולהעריך את הספיגה באמצעות קורא צלחות מרובה בארות בלמבדה של 570 ננומטר. כדי להעריך את כדאיות תאי Caco-2, שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של PBS לבאר ואחריו ניתוק התאים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין-EDTA למשך שתי דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

עצור את התגובה עם 500 מיקרוליטר של מדיום שלם והעביר את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים ב-50 מיקרוליטר PBS לכל צינור וערבבו את מתלי התאים המתקבלים עם נפח שווה של תמיסת צבע כדאיות Trypan Blue. לאחר שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ספרו את מספר התאים המוכתמים הלא מוכתמים והלא ברי קיימא בהמוציטומטר.

כדי להעריך את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית, או TEER של תאי Caco-2, מיד לאחר העברת הקרנה, מחצית מתרבית התאים Caco-2 מוכנסת לצלחת חדשה עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם טרי בכל באר ומחצית מתרביות ההכנסה לצלחת חדשה שנזרעה עם פעמיים כפול 10 עד ה-PBMC השישי לכל שלושה מיליליטר של מדיום שלם לבאר. לאחר מכן הכניסו אלקטרודת מקלות אכילה TEER לתוך תרבית התא כל שעה במשך שש השעות הראשונות ולאחר מכן כל שלוש שעות עד 48 שעות לאחר ההקרנה. לניתוח כתמים מערביים, 48 שעות לאחר הקרנתם, תאי Caco-2 ו-PBMC עם 40 מיקרוליטר לכל אחד כפול 10 עד התאים השישיים של מאגר ליזה בתאים.

בעת ליזה וגירוד של תאי Caco-2, הקפד לא לנתק את הממברנה הנקבובית מהתוספת, מה שעלול לגרום לאובדן ליזאט התאים ולתוצאה מוטה. אחסן את דגימות התאים הליזים במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר כימות כמות החלבון הכוללת בכל דגימת ליזה של תאים בשיטת חומצה ביצינצ'ונינית, הוסף כמויות שוות של מאגר דגימת Laemmli בתוספת בטא-מרקפטואתנול לכל דגימת חלבון כוללת בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים.

מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן אוספים את החלבונים המפורקים על ידי צנטריפוגה וטוענים נפחי חלבון שווים מכל דגימה בג'ל טרומי של ארבעה עד 20%. הפעל את הדגימות למשך שעה אחת ב -120 וולט.

לאחר מכן השתמש במערכת העברה חשמלית חצי יבשה כדי להעביר את החלבונים לקרום פלואוריד פוליווינילידן. לאחר מכן, הניחו את הממברנה במיכל וחסמו את אתרי הקישור הלא ספציפיים עם חלב יבש ללא שומן 5% ב-PBS בתוספת 0.2%Tween 20 למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. בתום הדגירה החוסמת, שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של 0.2% PBS Tween 20 למשך חמש דקות לכל שטיפה וסמנו את הממברנה עם הנוגדנים הראשוניים המתאימים המעניינים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.

לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה, יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם 0.2% PBS Tween 20 כפי שהודגם זה עתה ולדגור את הממברנה עם הנוגדנים המשניים המצומדים המתאימים של חזרת פרוקסידאז למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. לאחר שלוש כביסות PBS, דגרו את הממברנה בעזרת ערכת תמיסה כימילומינסנט משופרת. לאחר מכן צלם את הסרט המתקבל עם מערכת סריקה מתאימה וכימת את התוצאות עם תוכנית ניתוח תמונה מתאימה.

הקרנה של עד 10 אפורים אינה משנה את הפעילות המטבולית של תאי Caco-2 24 או 48 שעות לאחר ההקרנה, אם כי כדאיות התא פוחתת עם הזמן בשתי המנות. הערכת TEER של תאי Caco-2 שאינם מתורבתים לאחר חשיפה לשני גווני קרינה אפורים מגלה ערכי TEER עקביים עד 48 שעות לאחר ההקרנה. עם זאת, לאחר 10 אפורים של הקרנה, התאים מדגימים ירידה ממושכת ב-TEER החל משלוש שעות לאחר ההקרנה.

קוקולטורה עם PBMCs מביאה להפחתה של TEER הניכרת משלוש שעות לאחר ההקרנה בשתי המנות ועד 30 שעות לאחר ההקרנה, ואז נראה שערכי TEER נשארים עקביים יחסית. ניתוח כתמים מערביים של חלבוני צומת הדוק לא מגלה הבדלים בביטוי קלודין-1 או אוקלודין בתגובה להקרנה ו/או קוקולטורה PBMC, בעוד שתנודות גדולות נצפות בחלבוני פיגומים שונים. יתר על כן, חלבון NF-kappa B הכולל אינו מושפע באף אחת ממנות הקרינה, בעוד שרמות חלבון XIAP מווסתות פי ארבעה בשתי המנות.

באמצעות הליך זה ניתן להוסיף גירויים ביולוגיים אחרים כמו אנטרובקטריה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו גירויים ביולוגיים שונים יכולים לשנות את התגובה של החד-שכבתי הטובה לחשיפה לקרינה מייננת. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את ההשפעה של קרינה מייננת ותאי חיסון על חדירות תאי Caco-2 וביטוי קומפלקס צומת הדוק.