Name: שיטות מדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera ותקופות הגולמי הזמני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: למד שיטות למדידת פיגמנטציה באגפי Drosophila guttifera ולקביעת תקופות הגולמי. הפרוטוקולים מאפשרים ניתוח מנגנוני התפתחות ומאפיינים בוגרים במחקר אבולוציוני-התפתחותי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים קרול B. שון וורנר תומאס על מתן מניות לעוף, Naoyuki הפתיל עבור ציוד, ביונג ג'ין סוק על עזרתו מצלם אגאטה Kiyokazu על הייעוץ, נקאג'ימה אליזבת לצורך עריכה באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI 17K 19427 ו טקדה למדע.

<ol><li>Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarson%2C+HL+%22Essays+in+evolution+and+genetics+in+honor+of+Theodosius+Dobzhansky%22">Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky</a>. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).</li>
<li>Markow, T. A., O'Grady, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarkow%2C+TA+%22Drosophila%3A+a+guide+to+species+identification+and+use%22">Drosophila: a guide to species identification and use</a>. , Academic Press. New York. (2006).</li>
<li>Patterson, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatterson%2C+JT+%22The+Drosophilidae+of+the+southwest%22">The Drosophilidae of the southwest</a>. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).</li>
<li>Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10164-014-0399-z">Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata.</a> J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).</li>
<li>Werner, T., Jaenike, J. <a target="_blank" href="http://humanities.lib.rochester.edu/drosophilaguide/">Drosophilids of the Midwest and Northeast</a>. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).</li>
<li>Arnoult, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+diversification+of+fly+pigmentation+through+evolution+of+a+gene+regulatory+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module.</a> Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).</li>
<li>Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+origination+and+diversification+of+a+dimorphic+gene+regulatory+network+through+parallel+innovations+in+cis+and+trans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans.</a> PLoS Genet. 11 (4), e1005136(2015).</li>
<li>Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chance+caught+on+the+wing%3A+cis-regulatory+evolution+and+the+origin+of+pigment+patterns+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila.</a> Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).</li>
<li>Glassford, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-option+of+an+ancestral+Hox-regulated+network+underlies+a+recently+evolved+morphological+novelty%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty.</a> Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).</li>
<li>Koshikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+modularity+and+the+evolution+of+new+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Enhancer modularity and the evolution of new traits.</a> Fly. 9 (4), 155-159 (2015).</li>
<li>Koshikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+cis-regulatory+activities+underlies+novel+domains+of+wingless+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).</li>
<li>McGregor, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+evolution+through+multiple+cis-regulatory+mutations+at+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene.</a> Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+mechanisms+underlie+the+evolutionary+diversification+of+Drosophila+sex+combs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).</li>
<li>Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+novel+wing+colour+pattern+by+the+Wingless+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen.</a> Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).</li>
<li>Wittkopp, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+polymorphism+to+interspecific+divergence%3A+genetics+of+pigmentation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila.</a> Science. 326 (5952), 540-544 (2009).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+in+the+wing+of+Drosophila%3A+a+study+of+the+engrailed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene.</a> Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).</li>
<li>Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupal+development+and+pigmentation+process+of+a+polka-dotted+fruit+fly%2C+Drosophila+guttifera+%28Insecta%2C+Diptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera).</a> Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).</li>
<li>Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoshikawa%2C+S+%22Diversity+and+evolution+of+butterfly+wing+patterns%3A+an+integrative+approach%22">Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach</a>. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).</li>
<li>True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+wing+melanin+patterns+form+by+vein-dependent+elaboration+of+enzymatic+prepatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns.</a> Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeography+of+the+Subgenus+Drosophila+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29%3A+evolutionary+history+of+faunal+divergence+between+the+Old+and+the+New+Worlds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds.</a> PLoS ONE. 11 (7), e0160051(2016).</li>
<li>Resh, V. H., Cardé, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aResh%2C+VH+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).</li>
<li>DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+families+of+sigmoidal+curves%3A+application+to+bioassay%2C+radioligand+assay%2C+and+physiological+dose-response+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves.</a> Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1050590207/abstract">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).</li>
<li>McKinney, M. L., McNamara, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcKinney%2C+ML+%22Heterochrony%3A+the+evolution+of+ontogeny%22">Heterochrony: the evolution of ontogeny</a>. , Plenum Press. New York. (1991).</li>
<li>Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pixels+to+picograms%3A+a+beginners%27+guide+to+genome+quantification+by+Feulgen+image+analysis+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry.</a> J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).</li>
<li>Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+size+of+termites+%28Insecta%2C+Dictyoptera%2C+Isoptera%29+and+wood+roaches+%28Insecta%2C+Dictyoptera%2C+Cryptocercidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae).</a> Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).</li>
</ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים.

נתאר כאן את הפרוטוקולים עבור ההגדרה של שלבים הגולמי, הסרת את puparium להשגחה מפורט, מדידת המשכים של שלבים הגולמי, מידת האינטנסיביות של כתמים שחורים על כנף ב guttifera ד. פרוטוקולים אלה יכול להיות מיושם עבור רבים דרוזופילה , הקשורות לטוס זן במיוחד עם כנף פיגמנטציה.
התבוננות מעמיקה ותיאור מפורט יותר אירועים התפתחותיים תאפשר בהמשך חלוקת משנה של שלבים. במקרים רבים, אירוע התפתחותיות הדורשות ניתוח או חלוקתה של גולם אינה מתאימה להגדרת הבמה, כי אחד צריך להרוג גולם עבור האחסון הזמני, ...

חלק תכונות מורפולוגיות דרוזופילה מגוונים בין המינים1,2,3,4,5. עלינו לגשת לשאלה של גיוון איך מורפולוגי נשאלת על ידי השוואת את המנגנונים של דור מורפולוגיות אלה. דוגמאות כאלה מורפולוגיות הם trichomes זחל, מסרקים המין למבוגרים, המנגנון איברי המין החיצוניים, פיגמנטציה בטן ואגף פיגמנטציה6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. ללמוד הבדלים מורפולוגיים בין מבוגרים, התבוננות וניתוח של השלבים הגולמי הם חשובים, כי גורלו של תכונות למבוגרים נקבע לפי הזחל מאוחר וממשיך מורפוגנזה הבאים במהלך תקופת הגולמי.
בלימודי ביולוגיה התפתחותית דרוזופילה melanogaster, "שעות APF" (שעות לאחר היווצרות הגולמי) היא השיטה הנפוצה כדי לציין גולמי16. מערכת זו מעסיקה זמן מוחלט לאחר היווצרות הגולמי, והוא מאוד נוח עבור ניסויים שגרתית. עם זאת, מהירות התפתחותי עשויים להיות שונים בין הגלמים, עשוי להיות מושפע הבדל גנטי, epigenetic או microenvironmental ואת ולכן נתקל באותו זמן מוחלט לאחר היווצרות הגולמי אינה מבטיחה כי הגלמים הם באותו שלב התפתחותי. במקרים רבים, שלבים מוגדרים על-ידי תכונות מורפולוגיות עדיפים להשוואת בכמה אנשים. במיוחד, השוואה בין מינים דורש היערכות מדויק השוואה בין שלבים (הומולוגיים) המתאים.
Bainbridge ו- Bownes17 מוכר 20 שלבים הגולמי (P1 כדי P15(ii)) מבוסס על תכונות מורפולוגיות של הגלמים melanogaster דרוזופילה . לביום היא השיטה הנפוצה ביותר של מורפולוגי הזמני התפתחותית18. במחקר הקודם, ביצענו staging הגולמי של דרוזופילה guttifera להקים בסיס הכנף פיגמנטציה מחקרים19. Guttifera ד יש דפוס שחור עם נקודות על הכנפיים והוא אחד המינים מודל עבור אגף פיגמנטציה היווצרות20. למרות הפננו את הקריטריונים מורפולוגי שמתואר Bainbridge של Bownes' מחקר17, מדדנו ישירות משכים הבמה על ידי תצפיות טורי19, במקום להשתמש שערוך Bainbridge ו Bownes' הבמה המשכים מתדר שנצפו. כאן נתאר את השיטה של היערכות הגולמי ואת מדידה של המשכים של הגולמי שלבי דרוזופילה בשימוש ואחFukutomi19.
ללמוד מנגנון התפתחותית של אגף פיגמנטציה, עלינו לדעת מתי בשלבים הגולמי או למבוגרים הפיגמנטציה. Fukutomi et al. 19 לכמת צפיפות אופטית (נחמד) של פיגמנטציה בשלבים הגולמי ומבוגרים על-ידי ניתוח תמונות של תמונות כנף. הפיגמנטציה של כנפיים דרוזופילה נחשב נגרמת על ידי הצטברות של מלנין שחור21. על כימות של מקרי מוות ממנת יתר, שימשו תמונות גווני אפור ו- ImageJ תוכנה (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . כדי לזהות ולכמת את הפיגמנטציה במקום ספציפי (ΔOD), אנחנו להחסיר OD מחוץ נקודה OD בתוך מקום. כדי להפוך שיטה זו אובייקטיבית הדירים, המקומות יתר המידה צריך להיות נחוש באמצעות אגף ורידים כמו ציוני דרך. במאמר זה נתאר בפירוט שיטה זו של כימות של פיגמנטציה כנף ב דרוזופילה guttifera.

<table><tbody><tr><td>Drosophila guttifera</td><td>מרכז מלאי מיני הדרוזופילה באוניברסיטת קליפורניה סן דייגו</td><td>15130-1971.10</td><td>Drosophila guttifera, מין זבוב פירות המשמש במאמר זה</td></tr><tr><td>בקבוקון פלסטיק</td><td>הייטק</td><td>MKC-30</td><td>בקבוקון פלסטיק, לתחזוקת מלאי זבובים</td></tr><tr><td>בקבוקון פקקי זמזום וסגירת בקבוקים לבקבוקוני זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AS-271</td><td>פקק תאית, לתחזוקת מלאי זבובים</td></tr><tr><td>סוכר רך לבן</td> סוכר <td>Mitsui</td><td>J-500 גרם</td><td>סוכר לבן רך, לקמח תירס סטנדרטי/סוכר/שמרים / מזון אגר</td></tr><tr><td>קמח תירס</td><td>טחנות קמח ניפון</td><td>F</td><td>קמח תירס, לקמח תירס סטנדרטי / סוכר / שמרים / מזון אגר</td></tr><tr><td>גריסי תירס - C</td><td>טחנות קמח ניפון</td><td>GC</td><td>גריסי תירס - C, לקמח תירס סטנדרטי / סוכר / שמרים / מזון</td></tr><tr><td>אגר אבקת אגר</td><td>Matsuki Kanten Sangyo</td><td>No.602</td><td>אבקת אגר, לקמח תירס/סוכר/שמרים/אגר סטנדרטי</td></tr><tr><td>מזון בירה יבשה</td><td>Asahi Food & בריאות</td><td>Y2A</td><td>שמרי בירה יבשים, לקמח תירס סטנדרטי/סוכר/שמרים/מזון אגר</td></tr><tr><td>בוטיל p-הידרוקסיבנזואט</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06327-02</td><td>בוטיל p-hydroxybenzoate, לקמח תירס סטנדרטי/סוכר/שמרים/מזון אגר</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Wako</td><td>057-00456</td><td>אתנול, לקמח תירס סטנדרטי/סוכר/שמרים/מזון אגר</td></tr><tr><td>מיקרו-צינור תחתון שטוח</td><td>Ina Optica</td><td>CF-0150</td><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינור, עבור איסוף גלמים</td></tr><tr><td>CAPSULEFUGE</td><td>Tomy</td><td>PMC-060</td><td>מיני מיקרוצנטריפוגה, לאיסוף גלמים</td></tr><tr><td>מעוקר Schale NB</td><td>Sansei Medical</td><td>01-013</td><td>צלחת פטרי מפלסטיק (קוטר 90 מ"מ x גובה 15 מ"מ)</td></tr><tr><td>מתלה צינורות סרום</td><td>Iwaki</td><td>9796-050</td><td>משמש כתא לח, לתצפית על גולם</td></tr><tr><td>קורנינג פלקון צלחת תרבית רקמות Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>צלחת פטרי מפלסטיק (קוטר 35 מ"מ x גובה 10 מ"מ)</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות סטנדרטית פלקון</td><td>353002</td><td>צלחת פטרי מפלסטיק (קוטר 60 מ"מ x גובה 15 מ"מ)</td><td></td></tr><tr><td>סיכת דחיפה</td><td>Kokuyo</td><td>51233709</td><td>סיכת דחיפה, ליצירת חורים במכסה המיקרו-צינור</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ אולימפוס</td><td></td><td>SZX16</td><td>סטריאומיקרוסקופ, לתצפית מורפולוגית</td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>אולימפוס</td><td>DSE-330-A</td><td>מצלמה דיגיטלית, להדמיית</td></tr><tr><td>סרט דו צדדי NICETACK</td><td>Nichiban</td><td>NW-15SF</td><td>סרט דו צדדי, להסרת</td></tr><tr><td>מלקחיים Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>מלקחיים, להסרת</td></tr><tr><td>מברשת צבע ואן גוך VISUAL</td><td>Talens יפן</td><td>GWVR-#5/0</td><td>מברשת צבע, להסרת מברשת צבע</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 12 באר</td><td>Merck</td><td>665-180</td><td>צלחת תרבית תאים 12 בארות, למדידת משכי תקופות גולם</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>NaCl, עבור PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>285-14</td><td>KCl, עבור PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td>Na2HPO4&middot; 12H2O, עבור PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28721-55</td><td>KH2PO4, עבור מסנן PBS</td></tr><tr><td>Steped Neutral Density (ND) 0.04 - 3.0</td><td>Edmund Optics</td><td>64-384</td><td>מסנן צפיפות מדורגת, לכיול מדידת פיגמנטציה</td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8.0-101</td><td>תוכנת ImageJ, למדידת עוצמת כתמים שחורים על כנף (https://imagej.nih.gov)</td></tr> <tr><td>מגלשת זכוכית FINE FROST מגלשת</td> זכוכית <td>Matsunami Glass Ind</td><td>FF-001</td>, <td>למדידת עוצמת כתמים שחורים על כנף</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ מרובע 18 x 18</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>C018181</td><td>תלוש כיסוי, למדידת עוצמת כתמים שחורים על כנף</td></tr></tbody></table>

שיטות מדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera ותקופות הגולמי הזמני

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

מגוונת מיני דרוזופילה (זבוב הפירות) מספקים הזדמנויות ללמוד מנגנונים של פיתוח, שינויים גנטיים אחראים שינויים אבולוציוניים. בפרט, השלב למבוגרים הוא מקור עשיר של תכונות מורפולוגיות להשוואה interspecific, כולל השוואה פיגמנטציה כנף. במחקר התפתחותי הבדלים בין המינים, התבוננות מפורטת ובימוי המתאים נדרשים עבור השוואה מדויקת. כאן נתאר פרוטוקולים הזמני של תקופות הגולמי, כימות של אגף פיגמנטציה של זבוב פירות מנוקד, guttifera דרוזופילה. ראשית, אנו מתארים את שיטת עבור ההגדרה של שלבים הגולמי בהתבסס על מורפולוגיות ופיקוח מורפולוגי מפורט. שיטה זו כוללת טכניקה עבור הסרת את puparium, כמו במקרה chitinous החיצוני של הגולם, כדי לאפשר התבוננות מפורטת מורפולוגיות הגולמי. שנית, אנו מתארים שיטה למדידת משך שלבים מוגדרים הגולמי. לבסוף, אנו מתארים את השיטה על כימות של פיגמנטציה כנף בהתבסס על ניתוח התמונה באמצעות תמונות דיגיטליות ותוכנה ImageJ. באמצעות שיטות אלה, אנו יכולים להקים בסיס מוצק להשוואת תהליכים התפתחותיים של תכונות למבוגרים בשלבים הגולמי.

תקופת guttifera ד הגולמי מחולק 17 שלבים (P1 - P15(ii); תמונות של נציג שלושה שלבים (P1, P5 - 6, P10) מוצגים באיור 3, בכל שלבי 17 מומחשים איור 4). למרות Bainbridge ו- Bownes17 מזוהה 20 שלבים melanogaster ד, חלק השלבים האלה לא היתה אפשרות להחיל כדי guttifera ד. את הסדר של שני אירועים התפתחותיים, את המראה של הגוף הצהוב (מסה של תאים לשפוך בתוך פיתול26) ואת העית...

פרוטוקולים עבור היערכות תקופות הגולמי ומדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera מתוארים. האחסון הזמני, כימות של פיגמנטציה לספק בסיס מוצק לימוד מנגנוני התפתחותית של תכונות למבוגרים ולאפשר השוואה interspecific של תכונה הפיתוח.

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לביים תקופות גולם ולמדוד פיגמנטציה של כנפיים של Drosophila guttifera. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית האבולוציונית, כגון כיצד מתפתחים דפוסי פיגמנטציה בדרוזופילה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לקבל מידע מפורט על התפתחות מורפולוגית ותהליך פיגמנטציה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההתפתחות המורפולוגית ותהליך הפיגמנטציה של Drosophila guttifera, ניתן ליישם אותה על מינים אחרים של Drosophila. כדי להתחיל בהסרת הגלם, הדביקו פיסת סרט דו צדדי על פיסת מגבת נייר. הניחו גולם על הסרט הדו-צדדי, כשצד הגחון כלפי מעלה.אתר את הרווח בין הצד הקדמי של הגולם לבין הגולם הפנימי. אחוז והסר את הגולם סביב הפער הזה, באמצעות מלקחיים. ולחשוף את הצד הקדמי של ראש הגולם.הכנס את קצה המלקחיים על ידי הזזתו במקביל לציר הקדמי-אחורי. הרם את קצה המלקחיים כדי לשבור את הגולם באופן מקומי. חזור על פעולה זו עד שהשבירה תגיע לחלק האחורי של הגולם.ודא שנוצר רווח בין הגולם לרגלי הגולם. ולשבור את הצד הגחוני של הגולם תוך מזעור הנזק לגולם הפנימי. לאחר שבירת הגולם ככל האפשר, הוציאו את הגולם בעזרת מברשת צבע עדינה.מניחים את הגולם על פיסת נייר טישו שהורטבה ב-ddH2O ומונחת בצלחת פטרי מפלסטיק. צלם מיד, מכיוון שהגולם החשוף פגיע ומתייבש בקלות. המשך בהכנת התמונה והסר את החלק הקדמי של הגולם בעזרת מלקחיים.הוציאו את הגולם והניחו אותו בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט, או PBS, בצלחת פטרי מפלסטיק. לאחר מכן, חותכים את המפרק הבסיסי של כנף. כאשר הכנף מקופלת, הניחו אותה בצלחת פטרי מפלסטיק מלאה ב-ddH2O כדי להאריך אותה בלחץ אוסמוטי.אסוף מבוגרים חדשים שנסגרו אחת ל-10 דקות מתיק מלאי. הרדמת זבוב באמצעות כרית הרדמה CO2. אשר הרדמה על ידי חוסר תנועה וחתוך את המפרק הבסיסי של הכנף.זרוק 10 מיקרוליטר PBS על מגלשת זכוכית. הנח את הכנף בטיפה. וכסו את הטיפה בתלוש כיסוי.לאחר מכן, הפעל את האור של מיקרוסקופ הסטריאו והגדר אותו למקסימום. הגדר את עדשת האובייקט ל-11.5x והגדר את הסרעפת למצב הפתוח ביותר. לאחר מכן, הפעל את המצלמה והגדר את המצלמה.התמקד בדגימה על ידי הזזת כפתור המיקוד של המיקרוסקופ. לחץ על לחצן הצמצם של יחידת השלט הרחוק כדי לצלם תמונה. קחו תמונה של הכנף, שבמרכזה סנסילום קמפניפורמי, הממקמת את החלק הדיסטלי של הכנף בצד שמאל ואת החלק הפנימי של הכנף בצד העליון.פתחו תמונה עם נקודת סנסילום קמפניפורמית במרכז. לחצו על 'תמונה', 'הקלד 1, 8 סיביות', כדי להמיר את התמונה לתמונה של 8 סיביות. לחץ על מלבן בכלי בחירת האזור וצייר מלבן.הגדר את הצד הימני של המלבן כך שהוא ממוקם מימין לנקודת הסנסילום הקמפניפורמית. לחץ/י על ״עריכה״, ״בחירה״, ״הוסף למנהל״ ולאחר מכן בדוק/י את העמודה ״הצג הכל״. לאחר מכן, לחץ על הכלי זווית בכלי בחירת הקווים.צייר את הקו הראשון על הקו האחורי של וריד האורך השלישי. הגדר את נקודות הקצה השמאליות של הקו בקודקוד המלבן שצויר קודם לכן. צייר את הקו השני בצד העליון של המלבן.הקש על מקש M כדי למדוד את הזווית בין שני הקווים המצוירים בשלב זה. לחץ על חלון התמונה על מסך המחשב. לחץ על ערוך, בחירה, הוסף למנהל.לחץ על מלבן בכלי בחירת האזור וצייר מלבן בערך 1/9 מגודל חלון התמונה. לחץ על ערוך, בחירה, סובב. כתוב את מעלות המינוס של הזווית שנמדדה קודם לכן בעמודה זווית ולחץ על אישור כדי לסובב את המלבן שצויר בשלב זה.הזז את המלבן שצויר באמצעות מקשי החצים והגדר את נקודת הקצה של הקו האחורי של וריד האורך השני בצד שמאל של המלבן. והצד התחתון של המלבן, מתחבר לקו האחורי של וריד האורך השלישי. ודא ששורטט קו מאונך מנקודת הקצה של וריד האורך השני לקו האחורי של וריד האורך השלישי.הגדר את כף הרגל של הקו הניצב כנקודה A.רשום את קואורדינטת X ואת קואורדינטת Y של נקודה A, המצוינים מתחת לכלי בחירת האזור בעת הצבת הסמן על נקודה A.פתח את התמונה עם נקודה A במרכז. לחצו על 'תמונה', 'סוג', 8 סיביות, כדי להמיר את התמונה לתמונה של 8 סיביות. לחץ על מלבן בכלי בחירת האזור וצייר מלבן בגודל של כ-1/9 מגודל חלון התמונה.לחץ על ערוך, בחירה, ציין. בדוק את העמודה הסגלגלה והממורכזת. כתוב 100 פיקסלים בעמודות הרוחב והגובה.כתוב/י את קואורדינטות ה-X של נקודה A בעמודת הקואורדינטות X, וכתוב/י את קואורדינטות ה-Y של נקודה A בעמודת הקואורדינטות Y ולאחר מכן לחץ/י על ״אישור״. לאחר מכן, לחץ על ניתוח ומדידה. אם הכיול כבר הסתיים, ODs מסומנים בעמודה ממוצע. השוואת הנתונים של שלבים מרובים גילתה כי שלב P12 הוא העיתוי של הופעת הפיגמנטציה וכי הפיגמנטציה מסתיימת עד 12 שעות לאחר האקלוזיה.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית האבולוציונית לחקור את ההבדלים בהתפתחות הגולם ובתהליך הפיגמנטציה בין מיני דרוזופילה.

methods-for-staging-pupal-periods-measurement-wing-pigmentation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וריאציה פנוטיפי עבור תכונות יכול לנבוע מוטציות cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט השליטה דפוסי ביטוי גנים. שיטות נגזר לשימוש תסיסנית melanogaster יכול כמותית להשוות את רמות דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בתיווך או שונה באופן טבעי וריאנטים cre.

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים...

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

מאמר זה מתאר טכניקה להסרת בובה של חרק תוך שמירה על הגלמים הפנימיים שלמים ולכן כשירים לחקירה נוספת. הפרוטוקול לדוגמה מציג את ההליך עם Drosophila guttifera; עם זאת, טכניקה זו ישימה למיני דרוזופילה אחרים.

הסרת פופריום חרקים: שיטה לחקירת גולמים

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש, רב-תכליתי לביצוע חי הדמיה של תהליכים התפתחותיים מורפוגנזה הכללי של גיד השריר בפרט חי הגלמים דרוזופילה .

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

פרוטוקול זה נועד להעריך את הכדאיות של דרוסופילה בכל שלב התפתחותי, מעובר למבוגר. ניתן להשתמש בשיטה כדי לקבוע ולהשוות בין הכדאיות של גנוסוגים שונים או תנאי גדילה.

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

כאן, מוצג פרוטוקול להדמיה חיה ארוכת טווח של רגל הדרוזופילה בשלב הגולם, הכולל הסרה מלאה של הגולם. ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על רקמות אחרות.

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

למד שיטות למדידת פיגמנטציה באגפי Drosophila guttifera ולקביעת תקופות הגולמי. הפרוטוקולים מאפשרים ניתוח מנגנוני התפתחות ומאפיינים בוגרים במחקר אבולוציוני-התפתחותי.

שיטות מדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera ותקופות הגולמי הזמני

גלה סרטונים נוספים