שיטות מדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera ותקופות הגולמי הזמני

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לביים תקופות גולם ולמדוד פיגמנטציה של כנפיים של Drosophila guttifera. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית האבולוציונית, כגון כיצד מתפתחים דפוסי פיגמנטציה בדרוזופילה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לקבל מידע מפורט על התפתחות מורפולוגית ותהליך פיגמנטציה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההתפתחות המורפולוגית ותהליך הפיגמנטציה של Drosophila guttifera, ניתן ליישם אותה על מינים אחרים של Drosophila. כדי להתחיל בהסרת הגלם, הדביקו פיסת סרט דו צדדי על פיסת מגבת נייר. הניחו גולם על הסרט הדו-צדדי, כשצד הגחון כלפי מעלה.

אתר את הרווח בין הצד הקדמי של הגולם לבין הגולם הפנימי. אחוז והסר את הגולם סביב הפער הזה, באמצעות מלקחיים. ולחשוף את הצד הקדמי של ראש הגולם.

הכנס את קצה המלקחיים על ידי הזזתו במקביל לציר הקדמי-אחורי. הרם את קצה המלקחיים כדי לשבור את הגולם באופן מקומי. חזור על פעולה זו עד שהשבירה תגיע לחלק האחורי של הגולם.

ודא שנוצר רווח בין הגולם לרגלי הגולם. ולשבור את הצד הגחוני של הגולם תוך מזעור הנזק לגולם הפנימי. לאחר שבירת הגולם ככל האפשר, הוציאו את הגולם בעזרת מברשת צבע עדינה.

מניחים את הגולם על פיסת נייר טישו שהורטבה ב-ddH2O ומונחת בצלחת פטרי מפלסטיק. צלם מיד, מכיוון שהגולם החשוף פגיע ומתייבש בקלות. המשך בהכנת התמונה והסר את החלק הקדמי של הגולם בעזרת מלקחיים.

הוציאו את הגולם והניחו אותו בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט, או PBS, בצלחת פטרי מפלסטיק. לאחר מכן, חותכים את המפרק הבסיסי של כנף. כאשר הכנף מקופלת, הניחו אותה בצלחת פטרי מפלסטיק מלאה ב-ddH2O כדי להאריך אותה בלחץ אוסמוטי.

אסוף מבוגרים חדשים שנסגרו אחת ל-10 דקות מתיק מלאי. הרדמת זבוב באמצעות כרית הרדמה CO2. אשר הרדמה על ידי חוסר תנועה וחתוך את המפרק הבסיסי של הכנף.

זרוק 10 מיקרוליטר PBS על מגלשת זכוכית. הנח את הכנף בטיפה. וכסו את הטיפה בתלוש כיסוי.

לאחר מכן, הפעל את האור של מיקרוסקופ הסטריאו והגדר אותו למקסימום. הגדר את עדשת האובייקט ל-11.5x והגדר את הסרעפת למצב הפתוח ביותר. לאחר מכן, הפעל את המצלמה והגדר את המצלמה.

התמקד בדגימה על ידי הזזת כפתור המיקוד של המיקרוסקופ. לחץ על לחצן הצמצם של יחידת השלט הרחוק כדי לצלם תמונה. קחו תמונה של הכנף, שבמרכזה סנסילום קמפניפורמי, הממקמת את החלק הדיסטלי של הכנף בצד שמאל ואת החלק הפנימי של הכנף בצד העליון.

פתחו תמונה עם נקודת סנסילום קמפניפורמית במרכז. לחצו על 'תמונה', 'הקלד 1, 8 סיביות', כדי להמיר את התמונה לתמונה של 8 סיביות. לחץ על מלבן בכלי בחירת האזור וצייר מלבן.

הגדר את הצד הימני של המלבן כך שהוא ממוקם מימין לנקודת הסנסילום הקמפניפורמית. לחץ/י על ״עריכה״, ״בחירה״, ״הוסף למנהל״ ולאחר מכן בדוק/י את העמודה ״הצג הכל״. לאחר מכן, לחץ על הכלי זווית בכלי בחירת הקווים.

צייר את הקו הראשון על הקו האחורי של וריד האורך השלישי. הגדר את נקודות הקצה השמאליות של הקו בקודקוד המלבן שצויר קודם לכן. צייר את הקו השני בצד העליון של המלבן.

הקש על מקש M כדי למדוד את הזווית בין שני הקווים המצוירים בשלב זה. לחץ על חלון התמונה על מסך המחשב. לחץ על ערוך, בחירה, הוסף למנהל.

לחץ על מלבן בכלי בחירת האזור וצייר מלבן בערך 1/9 מגודל חלון התמונה. לחץ על ערוך, בחירה, סובב. כתוב את מעלות המינוס של הזווית שנמדדה קודם לכן בעמודה זווית ולחץ על אישור כדי לסובב את המלבן שצויר בשלב זה.

הזז את המלבן שצויר באמצעות מקשי החצים והגדר את נקודת הקצה של הקו האחורי של וריד האורך השני בצד שמאל של המלבן. והצד התחתון של המלבן, מתחבר לקו האחורי של וריד האורך השלישי. ודא ששורטט קו מאונך מנקודת הקצה של וריד האורך השני לקו האחורי של וריד האורך השלישי.

הגדר את כף הרגל של הקו הניצב כנקודה A.רשום את קואורדינטת X ואת קואורדינטת Y של נקודה A, המצוינים מתחת לכלי בחירת האזור בעת הצבת הסמן על נקודה A.פתח את התמונה עם נקודה A במרכז. לחצו על 'תמונה', 'סוג', 8 סיביות, כדי להמיר את התמונה לתמונה של 8 סיביות. לחץ על מלבן בכלי בחירת האזור וצייר מלבן בגודל של כ-1/9 מגודל חלון התמונה.

לחץ על ערוך, בחירה, ציין. בדוק את העמודה הסגלגלה והממורכזת. כתוב 100 פיקסלים בעמודות הרוחב והגובה.

כתוב/י את קואורדינטות ה-X של נקודה A בעמודת הקואורדינטות X, וכתוב/י את קואורדינטות ה-Y של נקודה A בעמודת הקואורדינטות Y ולאחר מכן לחץ/י על ״אישור״. לאחר מכן, לחץ על ניתוח ומדידה. אם הכיול כבר הסתיים, ODs מסומנים בעמודה ממוצע. השוואת הנתונים של שלבים מרובים גילתה כי שלב P12 הוא העיתוי של הופעת הפיגמנטציה וכי הפיגמנטציה מסתיימת עד 12 שעות לאחר האקלוזיה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית האבולוציונית לחקור את ההבדלים בהתפתחות הגולם ובתהליך הפיגמנטציה בין מיני דרוזופילה.