פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות ללא משוא פנים דפוסי מצב כרומטין קומבינטוריים ברקמות הגידול ובקווי התאים הסרטניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה של הסרטן, כגון כיצד מצבי שינוי היסטון עקרים יכולים לתרום להיווצרות הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעבד שינויים מרובים בהיסטון, כמו גם מספר דגימות בו זמנית, כמו גם ביעילות.

ראשית, נתקו 50 מיליגרם של רקמת מלנומה באופן ידני ושני מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק או HBSS, באמצעות סכין גילוח סטרילי. טוחנים את הרקמה לחתיכות של שלושה או ארבעה מילימטר למשך כחמש דקות בצלחת תרבית רקמה סטרילית. העבירו את תמיסת הרקמה לצינור דיסוציאטור והוסיפו עוד שמינית מיליליטר של HBSS.

להפריד עוד יותר את הרקמה, באמצעות דיסוציאטור, עד להומוגניזציה. לאחר מכן, הצליבו את הרקמה, והוסיפו 200 מיקרוליטר של 16% פורמלדהיד לשלושה מיליליטר HBSS. בעזרת מערבל מנערים את התערובת ב-10 סל"ד למשך 10 דקות בדיוק בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הוצאת הדגימה מהחממה, הוסיפו 200 מיקרוליטר גליצין גידולי לכל שלושה מיליליטר דגימה ונערו את התערובת ב-10 סל"ד למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. סובב את הדגימה ב-934 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה עליונה. בסיום, הסר את הסופרנטנט והוסף חמישה מיליליטר PBS קר כקרח.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה שוב ב-934 פעמים גרם ואז הסר את הסופרנטנט. הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר קציר ChIP עם מעכבי פרוטאז לכל 50 מיליגרם רקמה ולייז את הדגימות למשך 30 דקות על קרח. בזמן שהתאים שוכבים, הפעל את משבש אמבט המים ואת מערכת הקירור הנלווית ואפשר לטמפרטורה להגיע לארבע מעלות צלזיוס.

הנח את צינור הסוניקטור במשבש אמבט המים ועשה סוניקציה של רקמת המלנומה למשך 60 מחזורים ב-30 שניות הפעלה ו-30 שניות כבוי כדי להשיג שברי כרומטין של 200 עד 600 זוגות בסיסים. עבור שמונה מיליגרם של רקמת מלנומה, דגרו שלושה מיקרוגרם מכל נוגדן היסטון עם 20 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים של חלבון g ו-100 מיקרוליטר של חיץ חוסם קשירה למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב, באמצעות אקדח צינור. לאחר סוניקציה, יש לדלל את הדגימה חמש פעמים באמצעות מאגר דילול ChIP כדי להוריד את ריכוז ה-SDS ל-0.1% לאחר השלמת הדגירה של הנוגדן והחרוזים המגנטיים של החלבון g, הסר את מאגר הדילול ChIP והשהה מחדש את החרוזים ב-240 מיקרוליטר של המאגר הטרי.

לאחר מכן, הניחו 20 מיקרוליטרים של החרוזים לתוך 12 צינורות נפרדים, שכל אחד מהם ישמש לדגימת רקמה נפרדת. יש להצמיד את החומר הסוניקטיבי באופן שווה לחרוזי החלבון g עם נוגדן ספציפי ולסובב את הצינורות באמצעות אקדח צינור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקר שלאחר קישור צולב הפוך, העבירו את תמיסת חלבון הנוגדנים לצלחת 96 בארות והניחו אותה על מעמד מגנטי.

לאחר שאפשרת לחרוזים להיצמד למשך 30 שניות לפחות, הסר את הסופרנטנט. שטפו את החרוזים חמש פעמים עם 150 מיקרוליטר מאגר כביסה קר כקרח של RIPA באמצעות פיפטה רב ערוצית. הזז את המגנט ברציפות למשך 30 שניות בכל כביסה, ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט.

לאחר שלבי הכביסה, הוסף תערובת מאסטר מאגר פליטה, המכילה 44 מיקרוליטר של מאגר פליטה ישירה, מיקרוליטר אחד של Rnase וחמישה מיקרוליטר של פרוטנאז k לכל שבב והזן את הדגימה לקישור צולב הפוך. דגרו את הדגימות באמצעות מחזור תרמי PCR למשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס, ארבע שעות ב-50 מעלות צלזיוס ושמונה עד 16 שעות ב-65 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, הנח את הדגימות בחזרה על המגנט והעביר את הסופרנטנט לצלחת PCR חדשה של 96 בארות המכילה את ה-DNA המשקע באמינו.

הוסף 2.3 x חרוזים פרמגנטיים לתמיסה ופיפטה בזהירות למעלה ולמטה 25 פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצית. לאחר מכן, יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן הניחו את הדגימות בחזרה על המגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות נוספות.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסיפו לדגימות 150 מיקרוליטר של אתנול 70% ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות מבלי להפריע לחרוזים. לאחר שאפשרו לחרוזים להתייבש, הסר את הדגימות מהמגנט והוסף 30 מיקרוליטר של 10 מילי-מולארי. מערבבים על ידי פיפטינג 25 פעמים.

לאחר הדגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר, הניחו אותן בחזרה על המגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות נוספות. העבירו 20 מיקרוליטר מכל דגימה לצלחת חדשה של 96 בארות להכנת הספרייה. לאחר הגברת PCR, הסר את הדגימות והביא את הנפח הכולל ל-100 מיקרוליטר באמצעות מים נטולי גרעין.

בצע בחירת גודל פרמגנטי דו צדדי על ידי הוספת 55 מיקרוליטר חרוזים לכל דגימה וערבוב 25 פעמים עם פיפטה. ואז דוגרים בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. הניחו את הדגימות בחזרה על המגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות נוספות כדי להשיג שברים גדולים על החרוזים שאינם מתאימים לריצוף.

לאחר הדגירה, העבירו את הסופרנטנט לצלחת PCR חדשה של 96 בארות. מוסיפים עוד 25 מיקרוליטר של חרוזים פרמגנטיים ומערבבים על ידי פיפטינג 25 פעמים ומדגרים בטמפרטורת החדר מהמגנט למשך ארבע דקות. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר, הניחו את הדגימות בחזרה על המגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות.

ואז השליכו את הסופרנטנט. תוך כדי השארת הדגימות על המגנט, הוסיפו 150 מיקרוליטר של אתנול 70% ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות מבלי להפריע לחרוזים. הסר את האתנול וחזור על הכביסה.

לאחר שאפשרו לחרוזים להתייבש, הסר את הדגימות מהמגנט והוסף 25 מיקרוליטר של pH עקבות 10 מילי-מולרי 8.0. מערבבים על ידי פיפטינג 25 פעמים ודוגרים בטמפרטורת החדר, מחוץ למגנט למשך ארבע דקות. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר, הניחו את הדגימות בחזרה על המגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות.

כעת, כמת את הספריות באמצעות מכשיר אלקטרופרוגרמה של DNA בעל רגישות גבוהה לפני הריבוב כדי להבטיח שהגדלים מתאימים לריצוף. פרוטוקול זה מאפשר אימונו-משקעים של רקמות גידול קפואות וקווי תאים שניתן לבצע על עשרות דגימות ובמקביל בשיטת תפוקה גבוהה. שברי כרומטין צריכים לנוע בין 200 ל-1000 זוגות בסיסים למשקעים חיסוניים אופטימליים.

יש לכמת DNA ChIP מטוהר לפני שממשיכים להכין את הספרייה. ספריות שהושלמו המתאימות לריבוב ולריצוף מהדור הבא צריכות לנוע בין 200 ל-600 זוגות בסיסים ולהיות נטולות כל דימרים פריימר. לאחר הרצף, ישנם מדדי בקרת איכות רבים שיש לעמוד בהם לפני שתמשיך לשלבים נוספים של הצינור, כגון שיחות שיא של macs וניתוח chromHmm.

דגימות ChIP צריכות להיות מועשרות על גבי DNA קלט וכל שינוי היסטון צריך להציג פרופיל מובהק המייצג מרכיב ספציפי של הנוף האפיגנטי. אלגוריתם כרום HMM משתמש במודל מרקוב נסתר רב-משתני כדי לזהות את דפוסי הכרומטין הקומבינטוריים והמרחביים הבולטים ביותר החוזרים על סמך שינויי ההיסטון שנחקרו. באמצעות ששת השינויים הללו, כרום HMM מזהה מצבי כרומטין מובחנים מבחינה תפקודית המייצגים תחומים מדכאים ופעילים כאחד, כגון דיכוי פוליקומב, דיכוי הטרוכרומטי, שעתוק פעיל ומשפרים פעילים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה עד ארבעה ימים, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לקבוע תנאי סוניקציה אופטימליים ומפרט לנוגדנים לפני שתמשיך בהכנת הספרייה וניתוח הנתונים. ללימוד הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף RRS ולכידת אישור כרומוזומים כדי לקבוע קואליציה של חלקי מצב כרומטין עם ביטוי גנים ומבנה כרומטין גבוה יותר.

לאחר הניסוי, הטכניקה סללה את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה של הסרטן לחקור דפוסי מצב כרומטין בדגימות גידול של חולים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לעבד ולנתק רקמות גידול, לבצע משקעים חיסוניים של כרומטין, להכין ספריות לריצוף הדור הבא, לעבד נתונים לאחר ריצוף ולקבל תובנות לגבי השלבים הראשוניים של ניתוח במורד הזרם. אל תשכח שכאשר עובדים עם פורמלדהיד, זה יכול להיות מסוכן ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון מכסה אדים מתאים, בעת ביצוע הליך זה.