Name: העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: למדו שיטות להדבקת עכברים ב-Helicobacter pylori וניתוח היסטופתולוגי של רקמת הקיבה. טכניקות אלו מאפשרות חקר דלקות וסרטן במודלים חיים ותורמות לפיתוח טיפולים חדשים למחלות מערכת העיכול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות גב' א דה פאולי, גב' ג'ורג'י. ריי מקאן לקבלת סיוע טכני. המחברים להכיר השימוש במתקני וסיוע טכני של פלטפורמה היסטולוגיה מונש, המחלקה של האנטומיה, ביולוגיה התפתחותית, אוניברסיטת מונש. המעבדה נתמך על ידי מימון הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) רוזה לוקסמבורג (APP1079930, APP1107930). רוזה לוקסמבורג נתמך על ידי מלגת מחקר בכיר מ NHMRC (APP1079904). KD ו- MC שניהם נתמכים על ידי מונש מלגות לתואר שני. KD נתמך גם על ידי המרכז מולדת חסינות, זיהומיות מחלות, מכון הדסון למחקר רפואי, בעוד MC יש מלגת לתארים מתקדמים הבינלאומי מן הפקולטה לרפואה, לסיעוד למדעי הבריאות, אוניברסיטת מונש. מחקר על הדסון המכון של המחקר הרפואי נתמך על ידי תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני.

<ol><li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).</li>
<li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+dangerously%3A+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li>
<li>Akopyants, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+the+cag+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).</li>
<li>Censini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cag%2C+a+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori%2C+encodes+type+I-specific+and+disease-associated+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).</li>
<li>Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+innate+immunity+in+Helicobacter+pylori-induced+gastric+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).</li>
<li>O'Rourke, J. L., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Helicobacter+pylori+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Animal models of Helicobacter pylori infection and disease.</a> Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).</li>
<li>Sakagami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophic+gastric+changes+in+both+Helicobacter+felis+and+Helicobacter+pylori+infected+mice+are+host+dependent+and+separate+from+antral+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis.</a> Gut. 39 (5), 639-648 (1996).</li>
<li>Correa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+and+gastric+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).</li>
<li>Enno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALToma-like+lesions+in+the+murine+gastric+mucosa+after+long-term+infection+with+Helicobacter+felis.+A+mouse+model+of+Helicobacter+pylori-induced+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection%3A+introducing+the+Sydney+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li>
<li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li>
<li>Israel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+strain-specific+differences+in+genetic+content%2C+identified+by+microarray%2C+influence+host+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).</li>
<li>Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-induced+gastritis+in+the+domestic+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat.</a> Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).</li>
<li>Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+spiral-shaped+bacterium+from+the+cat+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach.</a> Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).</li>
<li>Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+Helicobacter-induced+gastric+cancer%3A+use+of+cocarcinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens.</a> Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).</li>
<li>Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+of+specific-pathogen-free+mice+to+chronic+Helicobacter+pylori+%28strain+SS1%29+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection.</a> Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).</li>
<li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18770594">Laboratory maintenance of Helicobacter species.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).</li>
<li>Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li>
<li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li>
<li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li>
<li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li>
<li>Uotani, T., Graham, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Helicobacter+pylori+using+the+rapid+urease+test%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test.</a> Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).</li>
<li>Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li>
<li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396(2009).</li>
<li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+bilis%3A+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li>
<li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li>
<li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li>
<li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129%2FSv+mice+fails+to+suppress+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li>
<li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מודל העכבר ויוו זיהום הליקובקטר . השלבים הקריטיים של ההליך הם: 1) הכנת הליקובקטר inocula המכיל חיידקים קיימא תאי; 2) משלוח של המספרים המתאימים של חיידקים העכבר באמצעות intragastric gavage; 3) גילוי של זיהום חיידקי המושבה סופר ו/או PCR; . ו-4) עיבוד של רקמות הקיבה כדי לאפשר את ההערכה של histopathology ב נגוע בטנם. הצעות נוספות עבור שינויים, שיקולים טכניים ולפתרון נדונים להלן.
השיטה של גידול spp. הליקובקטר באמצעות אגר דם בסיס מס ' 2 ...

הליקובקטר פילורי הוא. בצורת ספירלה, גראם שליליים, אנושי קיבה חיידק נוכח כל האוכלוסיות ברחבי העולם, עם זיהום המחירים במדינות מתפתחות מוערך לפי 80%1. למרות שרוב ח פילורי-אנשים נגועים הם אסימפטומטיים, יש לפתח מחלות חמורות יותר, ועד סרטן קיבה2כיב פפטי. ח פילורי-סרטן הקשורים בהרחבה מאופיינים על-ידי שינויים ממאירים בתאי אפיתל (GECs) או היווצרות של רקמות הלימפה קטרי במיוחד בבטן, וכתוצאה מכך אדנוקרצינומה קיבה או רירית הקשורים הלימפה לימפומה רקמות (מאלט), בהתאמה. ח פילורי מותאמת במיוחד כדי לשרוד גומחה אקולוגית קשה של הקיבה בשל נוכחותם של הגורמים התקפה אלימה ומנגנונים שונים להקל על הדבקות שלה, גדילה וחילוף החומרים במקצוע הזה. בפרט, ארסית זני ה פילורי להחזיק את 40 kb חטיבתי פתוגניות איילנד (חטיבתיפאי) מקודד כ 30 גנים הדרושים לייצור סוג 4 הפרשת מערכת (T4SS)3,4 . חטיבתי פאי-חיוביות ח פילורי זנים משויכים אינדוקציה של רמות גבוהות של דלקת כרונית במארח, אשר היה מעורב כמו קודמן חיוני של אדנוקרצינומה קיבה5.
In vivo מודלים בעלי חיים, במיוחד עכברים, היה מאוד אינפורמטיבי על ידי ומאפשר לחוקרים לחקור את התרומה של המארח, גורמים חיידקי וסביבתיים על ה פילורי זיהום, מחלת התוצאה6. מחקרים בעבר הראו כי ממושך ח פילורי זיהום של עכברים על הרקע הגנטי C57BL/6 תוצאות בפיתוח של גסטריטיס כרונית של בלוטת להתנוון, שניהם ההיכר של ה פילורי זיהום7. יתר על כן, זיהום עם המין חיידקי קשורים חתולים/כלב, חתול ה', הוכח כדי לעודד היווצרות מאלט בעכברים עם התקדמות המחלה כפי שניתן לראות ב-8,לימפומה מאלט האנושי9מחלות דומות. הנפוץ ביותר בשימוש ח פילורי בידוד במחקרים קולוניזציה העכבר הוא "סידני המתח 1" (SS1) זן10, אשר חטיבתיפאי+ אך יש של T4SS שאינם פונקציונליים (T4SS−)11. זנים אחרים בשימוש נרחב כוללים ח פילורי B128 7.13 (חטיבתיפאי+/T4SS+)12 ו- X47-2AL (חטיבתיפאי–/T4SS−)13. ה חתול זיהומים, המתח CS1 ("החתול ספירלה 1", חטיבתיפאי–/T4SS−) נמצא בשימוש בדרך כלל14.
במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את הכנת הליקובקטר inocula ויוו זיהום, נוהל gavage intragastric של עכברים, כמו גם שיטות עיבוד רקמות לחקר שינויים histopathological בבטן. בפרט, מאמר זה יתמקד השיטות היסטולוגית נהגו להמחיש מושבת חיידקים להעריך שינויים histopathological, כולל היווצרות מאלט, רירית קיבה של עכברים נגועים. חלק מהשיטות המתוארות כאן עשוי להיות מותאם לחדר העבודה של פתוגנים במעיים אחרים כגון ס Typhimurium או rodentium ג.

<table><tbody><tr><td><ריאגנטים בקטריולוגיים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr>בסיס <tr><td>אגר דם אוקסואיד מס' 2</td><td>תרמו פישר CM0271B מדעי</td><td></td><td>יש להמיס במים נטולי ניזון לפני עיקור</td></tr><tr><td>פרימיום דפיברין דם סוס</td><td>אוסטרלי אתי ביולוגי</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>להמיס במים נטולי ניון לפני העיקור</td></tr><tr><td>חבילות גז CampyGen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>היסטולוגי ריאגנטים </חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אבסולוט, 100%</td><td>ChemSupply</td> מפוגל <td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול (2-פרופנול)</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>קסילן (ללא גופרית)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr>מסנן<td>המטוקסילין</td><td>ענבר</td><td>Scientific MH-1L</td> של מאייר <td>לפני השימוש מסנן</td></tr><tr><td>Eosin, Aqueous Stain</td><td>Amber Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>לפני השימוש</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa Stain, שונה</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WG80-2.5L</td><td>לדלל לפני השימוש (20% Giemsa, 80% מים נטולי יונים)</td></tr><tr><td>היסטולן</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX הרכבה בינונית</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים לביולוגיה מולקולרית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קיוביט dsDNA BR ערכת בדיקה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>טמפרטורת החישול של ureB פריימרים ששימשו במחקר זה היא 61 מעלות; ערכת C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>כוללת 10x מאגר PCR ומגנזיום כלוריד</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td>יש לדלל ל-10 מ"מ במים סטריליים ללא נוקלאז לפני השימוש</td></tr><tr><td>בדרגה מולקולרית אגרוז</td><td>ביולין</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן קרבונט</td><td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td> <td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטהידראט</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אנטיביוטיקה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ונקומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>V2002-1G</td><td>מתמוסס במים נטולי יונים</td></tr><tr><td>פולימיקסין B</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4932-5MU</td><td>מתמוסס במים נטולי יונים</td></tr><tr><td>Trimethoprim (&ge; 98% HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>מתמוסס ב-100% (אבסולוטי) אתנול</td></tr><tr><td>אמפוטריצין</td><td>אמרסקו (אסטרלי סיינטיפיק)</td><td>E437-100MG</td><td>מתמוסס במים נטולי יונים</td></tr><tr><td>Bacitracin מ-Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>מתמוסס במים נטולי יונים</td></tr><tr><td>חומצה Naladixic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>מתמוסס במים נטולי יונים</td></tr><tr><td><ריאגנטים חזקים>אחרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתוקסיפלורן (Pentrhox)</td><td>התפתחויות רפואיות בינלאומיות</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>פרפלסט שעוות פרפלסט</td><td>פלוס, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד וכלי פלסטיק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוקסואיד צנצנות אנאירוביות</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>HP0011 / HP0031</td><td></td></tr><tr><td>COPAN Pasteur Pipettes</td><td>Interpath Services</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>לאסוף כדורי חיידקים על ידי צנטריפוגה ב -2,200 סל"ד למשך 10 דקות ב -4 מעלות; C</td></tr><tr><td>23 גרם מחט גלישה מדויקת</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Portex צינורות פוליאתן עדינים</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>צנתרי הזנה מפלסטיק</td><td>Instech&nbsp; מעבדות</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל טוברקולין לואר להחליק מזרקים חד פעמיים</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופסטל אפנדורף לצינורות 1.2 - 2 מ"ל</td> עלי <td>פוליפרופילן הניתנים לחיטוי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Z317314</td> המשמשים להומוגניזציה של הקיבה</tr><tr><td>GentleMACs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>השתמש בתוכניות gentleMACS מוגדרות מראש לרקמת קיבה של עכבר</td></tr><tr><td>M Tubes (כובע כתום)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>לולאת פלסטיק סטרילית</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>צלחת קרה, Leica EG1160 מערכת הטבעה</td><td>Leica Biosystems</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תבניות בסיס רקמה-טק, תבנית בסיס 38 x 25 x 6</td><td>סאקורה, אלפן אן דן ריין</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, Leica RM2235</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charged SuperFrost Plus שקופיות זכוכית</td><td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

הליקובקטר פילורי הוא. חיידק קיבה נוכח חצי מהאוכלוסייה הכללית, היא הגורם המשמעותי התחלואה והתמותה בבני אדם. מספר מודלים העכבר של זיהום הליקובקטר בקיבה פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הסלולר לפיה ח פילורי חיידקים ליישב את הבטן של בני-אדם כפונדקאים, לגרום למחלות. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקולים: 1) להתכונן המתלים חיידקי הזיהום ויוו של עכברים ויה intragastric gavage; 2) לקבוע את רמות מושבת חיידקים ברקמות קיבה העכבר, על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) וספירת קיימא; ו 3) להעריך שינויים פתולוגיים, מאת היסטולוגיה. כדי ליצור Helicobacter זיהום בעכברים, חיות (SPF) ללא פתוגן מסוים קודם מחוסנים עם המתלים (מכיל ≥ 105 המושבה יוצרי יחידות, CFUs) של העכבר-להמדינות זני גם הליקובקטר פילורי או אחרים spp. הליקובקטר בקיבה של חיות, כגון הליקובקטר חתול. -זיהום שלאחר זמן מתאים-נקודות, קיבות טוחנות, גזור sagittally לתוך רקמות שווה שני קטעים, אחד המרכיבים את האזורים antrum וגוף. אחד של קטעים אלה משמש לאחר מכן או ספירה מעשית או הפקת דנ א, ואילו השני הוא נתון לעיבוד היסטולוגית. מושבת חיידקים ושינויים histopathological בבטן עשויים להידרש באופן שגרתי בסעיפים רקמת קיבה מוכתם Warthin-כוכביים, Giemsa או Haematoxylin, אאוזין (H & E) כתמים, לפי הצורך. ניתוחים נוספים אימונולוגי עשוי להתבצע גם על ידי אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence על העכבר רקמת קיבה חלקים. הפרוטוקולים המתוארים להלן נועדו במיוחד כדי לאפשר את ההערכה בעכברים של פתולוגיות קיבה דמוי אלה הקשורות האדם ח פילורי מחלות, כולל דלקת, ניוון בלוטת הלימפה זקיק היווצרות. Inoculum הכנה והפרוטוקולים intragastric gavage עשוי גם להיות מותאם ללמוד בפתוגנזה של אחרים המעית האנושי גורמי מחלה לישוב עכברים, כגון סלמונלה Typhimurium או Citrobacter rodentium.

פרוטוקול זה מתאר שיטת gavage דרך הפה כדי להשיג זיהום intragastric עם ה פילורי או ה חתול עכבר מאתר דגמים (איור 1). לאחר המתת חסד, קיבות הוסר, שקל, מחולק ל 2 חצאים שווים הכוללת את antrum, הגוף ואזורים שאינם הבלוטות של רקמות הקיבה (איור 2). האזור הלא-הבלוטות מוסר לפני ביצוע כל הבדיקות.
קולוניזציה מוצלחת של בעלי חיים בדרך כלל אושר על ידי ביצוע קיימא סומכים ח פילורי-נגוע homogenates קיבה ולאחר מכן ספירת מושבות בו...

עכברים מייצגים מודל לא בפז ויוו ללמוד זיהום מחלות הנגרמות על ידי מיקרואורגניזמים במערכת העיכול. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות ללימוד מושבת חיידקים ושינויים histopathological העכבר מודלים של הליקובקטר פילורי-הקשורים למחלה.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגסטרואנטרולוגיה על ההשפעה של חברי המיקרוביוטה, במיוחד אלה של הסוג הליקובקטר, על דלקת וסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר של זיהום הליקובקטר והשפעתו על הבטן בתנאים פיזיולוגיים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת פיתוח של טיפולים למניעה או חיסול של זיהום הליקובקטר או ההשלכות שלה, כולל אנטיביוטיקה, תרופות, או חיסונים.שיטות אלה מספקות תובנה ספציפית לפתוגנזה של זיהום הליקובקטר. עם זאת, כמה טכניקות עשוי להיות מותאם לחקר פתוגנים אחרים במערכת העיכול. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם הכנת אינוקולום חיידקי המסוגל ליצור זיהום בעכברים.זה הכרחי כי המבודדים הליקובקטר ידועים עכבר קולוניזציה זנים שלא עברו תת תרבות נרחבת במבחנה. בנוסף, יש לתעד את מספר תת-התת-ת-תים במבחנה עבור זנים אלה. הוסיפו מתלים חיידקיים לצינורות פוליסטירן 15 מיליליטר, ולהשתמש בלולאת פלסטיק כדי להעביר טיפה אחת של 10 עד 20 מיקרוליטר מכל תרבות לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות.לאחר מכן, להעריך את הכדאיות ואת תנועתיות של החיידקים תחת מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה בהגדלה 100 פעמים. השתמשו באנוקולה H.pylori רק אם לרוב החיידקים יש צורת מרה. H.felis אינוקולה צריך בעיקר להכיל חיידקים בצורת סם.ולטעון את האנוקולה למזרקים בודדים, חד פעמיים, מיליליטר. לצייד כל מזרק עם מחט 23-מד, ולהשתמש בסרט פרפין פלסטיק לחבר קטטר פוליאתילן חד פעמי לכל מחט. לאחר מכן, רסן ידנית עכבר בן שישה עד שמונה שבועות ללא פתוגן ועכבר נטול הליקובקטר על ידי עורף הצוואר והזנב, והכנס קטטר אחד למרכז הלסת הפתוחה.מדריך קטטר caudal לכיוון הוושט, הארכת הצוואר של העכבר כדי לאפשר קלות גישה לקיבה דרך הוושט הרחק קנה הנשימה עד רוב או כל הקטטר כבר לא נראה והתנגדות מורגשת. לאחר מכן, לספק לפחות פעם אחת 10 לחיידקים החמישי כדי להבטיח קולוניזציה אופטימלית ופתולוגיה של המחלה. בסוף הניסוי, השתמש במספריים דקים ומעוקלים כדי לפתוח את חלל הבטן לכרסום בבטן.חותכים את הבטן לאורך העקמומיות הגדולה יותר, ושוטפים בעדינות את האיבר פעמיים בצינור אחד של 50 מיליליטר של PBS טרי לכל שטיפה כדי להסיר כל מזון שיורית. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את הרקמה לתוך תבשיל פטרי מפלסטיק מוכתם באורך שישה ס"מ כדי לתעד את המשקל הרטוב. לאחר שיטוח הקיבה, חצי את הדגימה בשטויות לשני שברי רקמות שווים המרכיבים את אזורי הנמלים, הגוף והפורטנום הלא-בלוטות.הסר את האזור שאינו הבלוטות, ולשקול מחצית מכל קיבה לפני אחסון פיסת הרקמה בתתפיסה המתאימה לניתוח במורד הזרם המתוכנן. מוסיפים את החצי השני של רקמת הקיבה לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 10% פורמלין, משטח את הרקמות נגד הצדדים העליונים של הצינורות לאחר 10 שניות. כאשר הרקמות הפכו מודבקות על קירות הצינור, לטבול מחדש את הדגימות בפורמלין לפחות 24 שעות.כדי לספור את מספר H.pylori קיימא בקיבה לאחר זיהום, הומוגניזציה דגימות הקיבה המאוחסנים BHI, ולבצע דילול סדרתי כפול של הומוגנטים קיבה וכתוצאה מכך מרק טרי, סטרילי. לחלק אגר דם סוס מיובש מראש, או HBA, צלחות בתוספת אנטיביוטיקה נוספת לשלושה או ארבעה קטעים, ו, באמצעות התאמה של טכניקת מיילס ומיסה, להוסיף 10 עד 100 microliters של כל דילול הומוגני בקיבה על קטע של כל צלחת אגר. מורחים את ההומוגנים בלולאות פלסטיק סטריליות ומאפשרים לצלחות להתייבש.לאחר מכן, מניחים את הצלחות במצב הפוך בצנצנות גז אנארובה המכילות צלחת פטרי של מים וחבילת גז. לאחר מכן, הדגירה את הצנצנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד שבעה ימים. כאשר ניתן לצפות במושבות, למנות את המקטעים המכילים בין 10 ל 100 מושבות מבודדות.לאחר המתת חסד, הקיבה נקצרת מבעלי החיים ומשקלו. האזור הלא בלוטות מוסר, והקיבה מחולקת לשני חצאים שווים המרכיבים את הנמלים והגוף. קולוניזציה מוצלחת מאושרת בדרך כלל על ידי ביצוע ספירה בת קיימא וספירה עוקבת של מושבות בודדות מהומוגנטים קיבה מפוספס על לוחות HBA.שים לב כי נוכחות של חיידקים מזהמים מן microbiota קיבה העכבר או מספר גדול של מושבות H.pylori יכול לסבך את ספירת H.pylori CFUs. לחלופין, PCR ניתן להשתמש כדי לאמת זיהום באמצעות פריימרים מאומתים ספציפיים מכוונים לאזור זוג 325 בסיס של H.felis ו H.pylori ureB גנים. בניסוי מייצג זה, עכברים מסוג פראי C57 Black-6 הראו סימנים מתונים של דלקת, כולל היפרפלזיה ניוון בלוטה בשישה חודשים לאחר ההדבקה עם H.felis, כמו גם חדירה תאית של submucosa.דלקת חמורה יותר נצפתה בעכברים נוקאאוט באותו זמן נקודה, עם נוכחות נוספת של זקיקי הלימפה נצפתה בסמיכות חדירות הסלולר. חיידקי H.felis ניתן גם לדמיין בחלקים מוכתמים Giemsa של רקמת קיבה עכבר נגוע. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי, אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence כדי לענות על שאלות נוספות על סוגי התגובות המארח המושרה במהלך זיהום הליקובקטר.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה וגסטרואנטרולוגיה לחקור את התפקיד הסיבתי של הליקובקטר פילורי במחלות קיבה בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להדביק עכברים להתרבות עם מיני הליקובקטר וללמוד את הפתולוגיה הקשורה לזיהום. אל תשכח כי זני הליקובקטר המשמשים בפרוטוקול זה הם זיהומיות, ולכן נהלים biosafety סטנדרטי תמיד צריך להיות אחריו תוך כדי עבודה עם חיידקים אלה.

mouse-models-of-helicobacter-infection-and-gastric-pathologies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום הליקובקטר פילורי באמצעות טכניקת gavage תוך קיבתי במודל עכבר. התרחיף החיידקי מנוהל באמצעות קטטר המוחדר דרך הפה לתוך הקיבה. חיידקים מחוסנים מתיישבים ויוצרים זיהום בקיבה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לחקור את האינטראקציה בין המארח לפתוגן.

טכניקת גבאג' תוך קיבתי לזיהום הליקובקטר מבוקר בעכברים

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול לכימות עומס הליקובקטר פילורי ברקמות קיבה של עכבר לאחר הדבקה כדי לאשר את הנשאות שלו.

כימות עומס הליקובקטר פילורי בקיבת עכבר נגוע

סרטון זה מדגים שיטה להקמת מודל זיהום אורגנואיד קיבה על ידי הזרקה מיקרו של פתוגן קיבה הליקובקטר פילורי לתוך לומן האורגנואידים. מודל זה מסייע בחקר שינויים הנגרמים על ידי זיהום בתאי קיבה.

הקמת מודל זיהום באמצעות מיקרו-הזרקה של אורגנואידים בקיבה עם חיידקים פתוגניים

כאן אנו מתארים שיטה להמחשת אברון החיידקים האונקוגני המכונה מערכת הפרשת Cag Type IV (Cag-T4SS).  אנו מוצאים כי ה-Cag-T4SS מיוצר באופן דיפרנציאלי על פני השטח של הליקובקטר פילורי בתגובה לתנאים משתנים של זמינות ברזל.

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של הליקובקטר פילורי CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

מאמר זה מדגים נהלים כירורגיים של ריפלוקס גסטרו-ויזפאגי עם עכברים. מודלים אלו הם כלים שימושיים למחקר על מנגנונים וטיפול במחלת ריפלוקס גסטרו-ויזפאגי ופוטנציאלית בבריטי’ס הוושט ובסרטן הוושט.

מודלי כירורגי של Gastroesophageal Reflux עם עכברים

תרביות שמקורן בתאי גזע טומנות בחובן פוטנציאל אדיר למידול מחלות זיהומיות. כאן מתוארת תרבית של אורגנואידים בקיבה של עכברים ובני אדם שמקורם בתאי גזע בוגרים. האורגנואידים מוזרקים במיקרו עם פתוגן הקיבה הליקובקטר פילורי.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

כאן נתאר פרוטוקול על יצירה וערבה culturing האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי (3D) קיבה organoids, ואת שיטת להעברת organoids תלת-ממד טפט 2-ממדי. השימוש טפט אפיתל הקיבה כמו assay הרומן פצע שריטה ללימודי התחדשות גם מתואר.

העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות

כאן, ביצענו הערכה שיטתית של חולים שאובחנו עם ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית בדרגה נמוכה בקיבה על ידי ביופסיה אנדוסקופית קודמת וקיבלנו אבחנה פתולוגית על ידי כריתה מלאה של הנגע על ידי דיסקציה אנדוסקופית תת-רירית (ESD), תוך ניתוח גורמים שעלולים להגביר את הסיכון להסלמה פתולוגית.

הקמה והערכה של מודל חיזוי סיכונים להסלמה פתולוגית של ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית בדרגה נמוכה בקיבה

פרוטוקול זה מתאר שיטת צביעת חיסון לכל הקיבה, שעובדה על ידי טכניקת "Swiss roll" שפותחה במקור למעי העכברים.

מיפוי מרחבי משופר של שכבות שרירי הקיבה בעכברים באמצעות טכניקת גלגול שוויצרית מותאמת

סרטון זה ידגים שיטות להשראת זיהומים בדרכי השתן של עכברים בדרך התסתתית (transurethrally) ולכימות היקף הזיהומים שנוצרו.

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

למדו שיטות להדבקת עכברים ב-Helicobacter pylori וניתוח היסטופתולוגי של רקמת הקיבה. טכניקות אלו מאפשרות חקר דלקות וסרטן במודלים חיים ותורמות לפיתוח טיפולים חדשים למחלות מערכת העיכול.

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

גלה סרטונים נוספים