טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע זלוף כבד עכבר מוצלח כדי להקל על טיהור אוכלוסיות תאי כבד ספציפיות מעניינות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכבד כיצד לסייע לתפקודים של אוכלוסיות תאי כבד ספציפיות במבחני מבחנה או in vivo. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא הכמות הגבוהה של הפטוציטים בתאי אנדותל סינוסואידיים שניתן להשיג מכל כבד.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שחיוני לראות את הצבע והצורה של כבד מעוכל בצורה אופטימלית כדי לשמור על כדאיות התאים. כדי למקם את קטטר וריד הפורטל, השתמש תחילה בחלק האחורי של מלקחיים כדי להזיז את המעיים לצד ימין של חלל הבטן של העכבר, לחשוף את וריד הפורטל, והשתמש במלקחיים מעוקלים כדי להחליק חתיכת חוט תפירה פוליאסטר בגודל 20 סנטימטר מתחת לווריד הפורטל בין הכבד לווריד התריסריון העליון של הלבלב. השתמש במלקחיים כדי למשוך בזהירות את החוט לצד השני של החיה, כך שהוא מרוכז מתחת לווריד הפורטל.

וקשרו קשר עילי רופף סביב וריד השער. הניחו את המלקחיים המעוקלים מתחת לווריד, ומשכו בעדינות את כל חומר הרקמה לכיוון הזנב כדי ליישר את הווריד. לאחר מכן, הניחו את השיפוע של מחט קטטר כלפי מעלה ובמקביל לחלק התחתון של וריד הפורטל ליד המלקחיים, ונקבו בעדינות את הווריד בעזרת המחט.

כאשר השיפוע נמצא בלומן הווריד, משוך את המחט העמוסה בקפיץ, והמשך לדחוף את קטטר כף היד דרך הווריד, עד שהשיפוע נמצא ליד האזור המסועף של ונוס. לאחר אבטחת הקשר סביב הצנתר, הגדר מיד את המשאבה הפריסטלטית על ארבעה מילימטרים לדקה וחבר את הקצה הגברי של הצינור לקצה הנקבי של הצנתר, ובשלב זה אתה אמור להתחיל לראות את ענף הכבד. חותכים את אבי העורקים הבטני לניקוז.

השתמש בנייר דבק כדי לשתק את הצינור על הכרית התחתונה. השתמש במספריים כדי לחתוך את עור הבטן בצורה אנכית, כדי לאפשר ניקוז של דם ונוזל זלוף. לאחר מכן סחטו את כלי הדם הקולחין כמה פעמים עם המלקחיים הישרים כדי לנפח את הכבד, וודאו שכל הדם התנקז החוצה, וחלחלו לכבד עם PBS עד שרקמת הכבד מסמיקה.

כדי לקצור את הפטוציטים, החלף תחילה את צינור הזרימה מבקבוק ליטר אחד של PBS לבקבוק של 125 מיליליטר, המכיל חיץ שני, בתוספת קולגנאז-4. כאשר הקולגנאז מגיע לכבד, סחטו לזמן קצר אך בחוזקה את כלי הדם הקולחין כדי לבנות לחץ ולאפשר למאגר העיכול למלא את כל אונות הכבד. שחררו את כלי הדם לפני שהמאגר פורץ דרך רקמת החיבור המקיפה את הכבד.

ואפשר למאגר לחלחל דרך הכבד עד שכל הנפח יזרום דרך הרקמה. לאחר מכן, הניחו צלחת מתגבשת המכילה 10 מיליליטר חיץ אחד ליד העכבר, והשתמשו במלקחיים ישרים ובמספריים כדי להעביר את הכבד למנה. העבירו את המנה למכסה מנוע סטרילי לתרבית רקמות, ובעזרת טכניקה סטרילית, תפסו את הכבד כדי לקלף את הקפסולה.

לנער בעדינות את התאים מרקמת הכבד, ולשפוך את תמיסת התאים המתקבלת דרך פילטר 100 מיקרון לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את שאריות הכבד מהפילטר עם חיץ נוסף. כאשר נראה שהכבד נטול תאים, מסננים את הפילטר הנמשך דרך מסנן של 40 מיקרון לתוך צינור שני של 50 מיליליטר ואוספים את התאים על ידי צנטריפוגה.

שפכו את התא הלא-פרנכימלי ואת הפטוציטים המתים המכילים סופרנטנט לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר על קרח בתנועה אחת, כדי לשמר את הגלולה ולהשעות מחדש את הגלולה ב-40 מיליליטר של בופר טרי אחד לצנטריפוגה הבאה. כדי לבודד את תאי האנדותל הסינוסואידליים, צנטריפוגה את הסופרנטנטים המכילים תאים שאינם פרנכימליים. משוך את מתלי התאים לתוך צינור חרוטי חדש יחיד של 50 מיליליטר, והביא את הנפח הכולל ל-35 מיליליטר.

אסוף את התאים שנמשכו על ידי צנטריפוגה, והשתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להעביר בזהירות את 25 המיליליטר העליונים של התא הלא-פרנכימלי המכיל סופרנטנט לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר על קרח. הוסף 25 מיליליטר של מדיום טרי לצינור, והשהה מחדש את הגלולה לצנטריפוגה שנייה והסרת סופרנטנט. לאחר מכן צנטריפוגה את הסופרנטנט והוסף 15 מיליליטר של תמיסת פרקול של 50% לצינור חדש של 50 מיליליטר.

בעזרת פיפטר המוגדר למהירות הפליטה הנמוכה ביותר, שכבו 20 מיליליטר של 25% פרקול על תמיסת 50% פרקול, והשעו מחדש את התאים הלא פרנכימליים ב-10 מיליליטר של מדיום ארבע מעלות צלזיוס. שכבו בזהירות את התאים על תמיסת Percoll. והפרידו את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות.

לאחר מכן, שאפו את 30 המיליליטר הראשונים של התמיסה, והשתמשו בפיפטה העברה מפלסטיק של חמישה מיליליטר כדי לאסוף את תאי האנדותל הסינוסואידליים ותאי קופפר הממוקמים בשלב הביניים של תמיסת שיפוע בצפיפות של 25 עד 50% לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. שוטפים את התאים עם 50 מיליליטר מדיום ומשעים מחדש את הגלולה תוך שטיפת דפנות תחתית הצינור ב -12 מיליליטר מדיום חם. כדי להפריד את תאי האנדותל הסינוסואידיים מתאי קופפר, העבירו את תרחיף התאים לצלחת פטרי פוליסטירן באינקובטור תרבית רקמה לח למשך שמונה דקות.

בסוף הדגירה, השתמשו בפיפטה של 25 מיליליטר כדי לשאוב את הסופרנטנט והשתמשו בסופרנטנט כדי לשטוף את הכלי עם הפיפטר המוגדר במהירות הנמוכה ביותר כדי לאסוף את תאי האנדותל הסינוסואידיים הנותרים. לאחר מכן העבירו את תאי האנדותל הסינוסואידליים לצינור חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה לצורך השעייתם מחדש וציפוי בכלי תרבית תאים מצופים קולגן.

סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של כבד עכבר לאחר זלוף אינקזיטיבי PBS באופן דומה לזה שהודגם זה עתה, חושפת תמונה ברורה של המיקרו-אנטומיה של הכבד והמיקרוווילי בין הפטוציטים. הפטוציטים שנקטפו במהלך הספינים במהירות נמוכה בשלב מוקדם של ההליך, מפגינים טוהר גבוה לאחר ארבע שטיפות באלבומין סרום בקר המכיל חוצצים. הפרדת תאי האנדותל הסינוסואידיים על ידי הידבקות סלקטיבית על צלחת פטרי פוליסטירן מצופה קולגן מביאה לטוהר של 83 עד 90% התלוי במידה רבה ביעילות הכוללת של עיכול הקולגנאז.

מדידות כמותיות באמצעות מיקרוסקופ אור מהליך הפרדה מייצג, כפי שהודגם זה עתה, חושפות תוצאות בידוד אופייניות של כמעט 100% אוכלוסיית הפטוציטים טהורה. וקצת יותר מ-89% אוכלוסיית תאי אנדותל סינוסואידיים טהורה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לצנתר וריד פורטל עכבר וכיצד לטהר גם הפטוציטים וגם תאי אנדותל סינוסואידיים מכבד העכבר.

הליך זה עשוי לשמש גם לטיהור תאי לוויין מהחלק הלא פרנכימלי לאחר בידוד הפטוציטים באמצעות שיפועי צפיפות שונים ומהירויות צנטריפוגה.