התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים דרך מעשית להשיג תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני עכברים, ולתרבית אותם במבחנה תוך שמירה על תכונותיהם המקוריות. שיטה זו תסייע לחוקרי RPE להשיג מיומנויות דיסקציה הנדרשות להקמת תרביות תאי RPE בעכברים, ולהדגים כיצד לעשות זאת בדרך קלה. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא פשוט ואפשרי.

הדבר היחיד שנדרש הוא תרגול, וההדגמה החזותית של בידוד RPE והמיקרוסקופיה מדגימה פשוטו כמשמעו כיצד להשיג את הכישורים הנדרשים. כדי לבודד את גלגלי העיניים של העכבר, יש להמית תחילה שני עכברים בכל שיטה מאושרת, וללבוש כפפות להניח אותו על כרית סופגת. מקם אגודל ואצבע מורה סביב העין ודחף בעדינות את העור כדי לבלוט החוצה את גלגל העין.

לאחר שגלגל העין בולט, תחבו את קצה המספריים הזוויתיים בין העור לגלגל העין וחתכו בזהירות את הרקמה סביב העין עד לשחרורה. לאחר מכן, טבלו לזמן קצר את העין המבודדת באתנול 70% וטבלו אותה ב-PBS בצלחת פטרי. לאחר איסוף שתי העיניים מכל אחד מהעכברים, המשך בדיסקציה.

תחת המיקרוסקופ המנתח, הסר בזהירות את רוב רקמת החיבור מסביב לעין. אין צורך להשאיר את העין שקועה בשלב זה. לשם כך, השתמש במלקחיים תפורים כדי להרים את רקמות החיבור מגלגל העין, וחתוך אותן באמצעות מספריים של Vannas.

אל תחתוך את הסקלרה מכיוון שכמעט בלתי אפשרי להשיג את כוסות העיניים האחוריות השלמות אם הסקלרה נחתכת. לאחר ניקוי רקמת החיבור, טבלו את גלגלי העיניים ב-PBS ועברו לעבודה בארון זרימה למינרי בתנאים סטריליים. כעת, השתמשו במלקחיים כדי להעביר את העיניים לתוך צלחת של DMEM חם המכיל ריכוז גבוה של גלוקוז.

לאחר 20 עד 30 שניות, החלף את תמיסת הכביסה באמצעות שאיפה לשטיפה שנייה. העבירו את גלגלי העיניים לתמיסת עבודה מחוממת 2%Dispase II בשפופרות של 15 מ"ל ותנו לעיניים לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות כדי להתנתק. לאחר הדגירה, גלגלי העיניים צריכים להיות רכים.

לאחר מכן, שטפו את העיניים פעמיים באותו כלי עם מדיום גידול מחומם. לאחר השטיפה השנייה, החליפו את מצע הגידול במדיום טרי, והעבירו את גלגלי העיניים והמדיום לכלי חדש להמשך החיתוך. המשך לעבוד בספסל נקי בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה.

התחל את הדיסקציה על ידי אבטחת העין עם מלקחיים ובצע חתך סביב ה-ora serrata באמצעות מספריים של Vannas. שמור על גלגל העין בתמיסה, הסר בזהירות את הקרנית הקדמית על ידי הארכת החתך סביב היקף ה-ora serrata. לאחר השלמת החיתוך, משוך את הקרנית הקדמית.

לאחר מכן, הסר את קפסולת העדשה ואת האפיתל הפיגמנטי של הקשתית הנלווית על ידי משיכתה בעדינות מכוס העין באמצעות מלקחיים עם שיניים. לאחר מכן, חזור על הדיסקציה על העיניים הנותרות ודגר את כוסות העיניים האחוריות במדיום גידול למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להקל על הפרדת הרשתית העצבית מה-RPE. לאחר 20 דקות, חותכים את כוסות העיניים האחוריות לארבעה עלי כותרת.

בצע את החתכים ארוכים מספיק כדי לשטח את העין, אך קצרים מספיק כדי לשמור על עלי הכותרת מחוברים. לאחר מכן, שטחי את גביעונית העין כדי להסיר את הרשתית העצבית. אבטח את קומפלקס הכורואיד הנותר של RPE עם היד הלא דומיננטית ומשוך בעדינות רבה את הרשתית מהקצוות.

לאחר הסרת הרשתית העצבית, העבירו את קומפלקס הסקלרה הכורואיד RPE לרבע לתוך צלחת תרבית סטרילית חדשה מלאה במצע גידול חם. בצלחת הפטרי, אבטח עלי כותרת אחד של קומפלקס הכורואיד RPE הרבע עם מלקחיים עדינים במיוחד, ובעזרת סכין סהר מיקרו-כירורגית, קלף בעדינות את יריעות ה-RPE השלמות מקרום הבסיס הבסיסי. יש להבחין בבירור בין ה-RPE החום לבין הכורואיד הכהה, הדביק והרך.

לאחר מכן, הרטיבו קצה מיקרופיפטה p200 עם מצע גידול והשתמשו בקצה כדי להעביר את יריעות ה-RPE לתוך הכלי החדש המכיל מצע גידול מחומם. כעת, שטפו את יריעות ה- RPE שלוש פעמים במדיום גידול מחומם. לאחר כל שלב שטיפה, אסוף בזהירות את יריעות ה-RPE תוך הימנעות מרקמות אחרות, כגון פסולת מהרשתית או הכורואיד.

לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את יריעות ה- RPE לצינור של 1.5 מ"ל, ואפשרו להן לשקע על ידי כוח הכבידה. לאחר מכן, בארון הזרימה הלמינרית הסר את מצע הגידול הנוסף ותלה מחדש את התאים במצע גידול חם טרי. כעת, טריטורציה עדינה של הרקמה באמצעות מיקרופיפטה p200 מבלי ליצור בועות.

טריטורציה בין 40 ל-50 פעמים, בדיוק מספיק כדי ליצור תרחיף תא בודד. היזהר מכיוון שיותר מדי טריטורציה עלולה להיות קטלנית. כעת, צלחו את תאי ה-RPE שנאספו משני העכברים בתוספת קרום פוליאסטר אחת של 12 מ"ל בבאר של צלחת תרבית של 12 בארות.

רצוי צפיפות תאים גבוהה כדי שתאי ה-RPE ישמרו על צורתם המשושה והפיגמנטציה שלהם. תרבית RPE ראשונית של עכבר שהוקמה משני עכברים בתוספת ממברנת פוליאסטר 12 מ"מ הגיעה למפגש של 90 עד 95% לאחר שבוע בתרבית. לאחר שבועיים בתרבית, התאים היו 100% מתכנסים והחלו ליצור פסיפס של תאים פיגמנטיים משושים ודו-גרעיניים.

בשבוע השלישי, התאים המשיכו להשתנות בצורתם ובפיגמנטציה. עם זאת, לאחר ארבעה שבועות חלק מהתאים הפכו להיפרפיגמנטיים. טוהר תרבית תאי ה-RPE הראשונית הוערך באמצעות נוגדן RPE65, המסמן רטינואיד איזומרוהידרולאז, אנזים קריטי למחזור הראייה של בעלי חוליות.

שלמות התא לצמתים של התא וצורת התא המשושה הודגמה על ידי צביעה עם פלואידין. צמתים הדוקים הודגמו על ידי ניתוח ביטוי חלבון ZO-1, שניתן היה לדמיין באמצעות כתם אמינו ולאמת על ידי כתמים מערביים. בסך הכל, התרביות מסוגלות להתרבות, לשמור על פיגמנטציה וצורתן המשושה תוך יצירת צמתים הדוקים וביטוי סמנים פונקציונליים, כגון RPE65.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד תאי RPE מעיני העכבר ולתרבית אותם כראוי במבחנה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד לשמור על העיניים רטובות ולנסות לפעול מהר ככל האפשר.