טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

אנו מתארים את התפתחות מודל מבוסס ספרואיד, תלת מימדי במבחנה זה מאפשר לנו לבדוק הסטנדרטי העכשווי של משטרי טיפול ניסיוני עבור הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים בשורות תאים, מכוון הערכת טיפול רגישות והתנגדות על ראשי תאים אנושיים דגימות בעתיד.

המטרה הכוללת של שיטה זו במבחנה היא לייצר את הספרואידים התלת מימדיים של תרבית תאים המאפשרים בדיקה של משטרי טיפול סטנדרטיים או ניסיוניים הנוכחיים לקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר. שיטה זו מסייעת לנו להבין צמיחת גידול תלת מימדית של תאי סרטן ראש וצוואר כאשר הם נחשפים לקרינה או לטיפול בקרינה כימותרפית. נותר לומר כי הטיפול בתאי גידול ראשוניים הוא קשה ולא תמיד מוביל להיווצרות ספרואידים תלת מימדיים אמינים.

מי שתדגים את ההליך תהיה סבינה שוונק-ציגר, טכנאית מהמעבדה שלנו. תוך כדי שימוש בתאים ראשוניים מדגימת גידול, הניחו את הדגימה על משטח מתאים וסטרילי וחתכו אותה היטב בעזרת אזמל סטרילי חד פעמי לחתיכות קטנות מאוד. לאחר הפרדה מכנית מספקת של הרקמה הראשונית, העבירו אותה לבקבוקון המכיל קולגנאז 1 ו-2 ודגרו אותה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, מסננים את התערובת דרך מסננת תאי פלקון בגודל 70 מיקרומטר ושוטפים את המתלה עם HBSS. לאחר הפרדה מוצלחת ושטיפה לאחר מכן, העבירו את התרחיף המכיל מיליון עד שני מיליון תאים לבקבוק תרבית תאים T75 כדי לגדול לתת-מפגש ב-37 מעלות צלזיוס למשך עד עשרה ימים. תחת מיקרוסקופ, אשר את צמיחת תאי הגידול.

ספרו את התאים בתרבית. באמצעות צלחת 96 בארות הידבקות נמוכה במיוחד עם תחתית עגולה קעורה, זרע 5,000 תאי גידול ראשוניים, או 1,000 עד 2,000 תאים של קו תאי ביניים, ב-200 עד 300 מיקרוליטר של מדיה לתוך הבארות. לאחר מכן, תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בצע החלפת מדיה אחת ליומיים. שימו לב לא לשאוב את הכדור עם הפיפטה במהלך שינויי מדיה. תרבית את הספרואידים עד לצפייה בקונגלומרטים התלת-ממדיים בצורת ספרואיד.

זכור לא לכלול את הבארות עם היווצרות ספרואידים לא סדירה או מרובה מחקירה נוספת. לאחר מכן, שנה את המדיה למדיה עם טיפולים כימותרפיים ו/או נוגדנים חד שבטיים בריכוזים הרצויים. הוסף ציספלטין בריכוזים של 2.5, 5 או 10 מיקרומולר או 5-פלואורואורציל בריכוזים של 30 מיקרומולר.

בהליך זה, מדוד את גודל הכדור לאחר תיעוד תמונות דיגיטליות ביום השישי, ביום ה-10 וביום ה-16 באמצעות תוכנה גרפית. לאחר צנטריפוגה של הצלחת בחום של 520 גרם למשך 2.5 דקות, הסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS 1x וצנטריפוגה שוב את הצלחת, ולאחר מכן הסירו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים אנזימטית לכל בקבוקון כדי לאפשר לספרואידים להתמוסס. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך שמונה דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. בדוק אם יש המסה מוצלחת של הספרואידים מתחת למיקרוסקופ.

הוסף 100 מיקרוליטר DMEM. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת בחום של 520 גרם למשך 2.5 דקות. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה את התאים ב-100 מיקרוליטר של DMEM.

לאחר מכן, במידת הצורך, בצע בדיקת התפשטות קולורימטרית זמינה מסחרית וקרא את הבדיקה בקורא ELISA. כל קווי התאים יכולים לייצר ספרואידים אמינים עם הבדלים בגודל ובזמן הקריאה. תאים ראשוניים אכן יצרו ספרואידים הניתנים לשחזור בלוחות הצמדה נמוכים במיוחד.

צביעת Ki-67 חושפת את פריפריה של התרבית המציגה שיעורי התפשטות גבוהים בהרבה מאשר תאים מרכזיים, ומחקה את התפלגות החומרים המזינים בגידולים ריריים מוצקים המראים לעתים קרובות ליבות נמקיות. כאן, ההשפעה של מספר טיפולים כימותרפיים והקרנות על גודל הכדור. קרינה עם שני אפורים לפני הטיפול בציספלטין, מובילה לירידה משמעותית בגודל הספרואיד בהשוואה לציספלטין בלבד.

עם התבססות נוספת של יצירת ספרואידים מתאים אנושיים ראשוניים, כך ניתן ליישם את הרעיון של בדיקות טיפוליות. ספרואידים ייווצרו לאחר ביופסיית הגידול, ולאחר מכן ייבדקו למאפיינים מולקולריים ורגישות לטיפול. הצלחנו ליצור פרוטוקול ליצירת ספרואידים הניתנים לשחזור מתרחיפים של תאים הן עבור קווי תאים והן עבור תאי גידול אנושיים ראשוניים.

בדיקה רב-מודאלית זו רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים קטנים בין קבוצות. בעתיד, ניתן יהיה להשתמש בבדיקה כדי להעריך תחילה את התגובה האישית לפרוטוקולי טיפול סטנדרטיים וניסיוניים. שנית, לאפיין עוד יותר את תאי הגידול מדגימות טריות.

ושלישית, מתאם את תגובת הטיפול לדפוסים מולקולריים. השימוש בתאים ראשוניים ויצירת ספרואידים יאפשרו שימור של כמה שיותר מאפיינים של צמיחת גידול in vivo בשילוב עם בדיקה חסכונית לחקר תגובת הטיפול האינדיבידואלי.