טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי
20 באפריל 2018
אנו מתארים את התפתחות מודל מבוסס ספרואיד, תלת מימדי במבחנה זה מאפשר לנו לבדוק הסטנדרטי העכשווי של משטרי טיפול ניסיוני עבור הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים בשורות תאים, מכוון הערכת טיפול רגישות והתנגדות על ראשי תאים אנושיים דגימות בעתיד.
המטרה הכוללת של שיטה זו במבחנה היא לייצר את הספרואידים התלת מימדיים של תרבית תאים המאפשרים בדיקה של משטרי טיפול סטנדרטיים או ניסיוניים הנוכחיים לקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר. שיטה זו מסייעת לנו להבין צמיחת גידול תלת מימדית של תאי סרטן ראש וצוואר כאשר הם נחשפים לקרינה או לטיפול בקרינה כימותרפית. נותר לומר כי הטיפול בתאי גידול ראשוניים הוא קשה ולא תמיד מוביל להיווצרות ספרואידים תלת מימדיים אמינים.
מי שתדגים את ההליך תהיה סבינה שוונק-ציגר, טכנאית מהמעבדה שלנו. תוך כדי שימוש בתאים ראשוניים מדגימת גידול, הניחו את הדגימה על משטח מתאים וסטרילי וחתכו אותה היטב בעזרת אזמל סטרילי חד פעמי לחתיכות קטנות מאוד. לאחר הפרדה מכנית מספקת של הרקמה הראשונית, העבירו אותה לבקבוקון המכיל קולגנאז 1 ו-2 ודגרו אותה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, מסננים את התערובת דרך מסננת תאי פלקון בגודל 70 מיקרומטר ושוטפים את המתלה עם HBSS. לאחר הפרדה מוצלחת ושטיפה לאחר מכן, העבירו את התרחיף המכיל מיליון עד שני מיליון תאים לבקבוק תרבית תאים T75 כדי לגדול לתת-מפגש ב-37 מעלות צלזיוס למשך עד עשרה ימים. תחת מיקרוסקופ, אשר את צמיחת תאי הגידול.
ספרו את התאים בתרבית. באמצעות צלחת 96 בארות הידבקות נמוכה במיוחד עם תחתית עגולה קעורה, זרע 5,000 תאי גידול ראשוניים, או 1,000 עד 2,000 תאים של קו תאי ביניים, ב-200 עד 300 מיקרוליטר של מדיה לתוך הבארות. לאחר מכן, תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
בצע החלפת מדיה אחת ליומיים. שימו לב לא לשאוב את הכדור עם הפיפטה במהלך שינויי מדיה. תרבית את הספרואידים עד לצפייה בקונגלומרטים התלת-ממדיים בצורת ספרואיד.
זכור לא לכלול את הבארות עם היווצרות ספרואידים לא סדירה או מרובה מחקירה נוספת. לאחר מכן, שנה את המדיה למדיה עם טיפולים כימותרפיים ו/או נוגדנים חד שבטיים בריכוזים הרצויים. הוסף ציספלטין בריכוזים של 2.5, 5 או 10 מיקרומולר או 5-פלואורואורציל בריכוזים של 30 מיקרומולר.
בהליך זה, מדוד את גודל הכדור לאחר תיעוד תמונות דיגיטליות ביום השישי, ביום ה-10 וביום ה-16 באמצעות תוכנה גרפית. לאחר צנטריפוגה של הצלחת בחום של 520 גרם למשך 2.5 דקות, הסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS 1x וצנטריפוגה שוב את הצלחת, ולאחר מכן הסירו את הסופרנטנט.
לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים אנזימטית לכל בקבוקון כדי לאפשר לספרואידים להתמוסס. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך שמונה דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. בדוק אם יש המסה מוצלחת של הספרואידים מתחת למיקרוסקופ.
הוסף 100 מיקרוליטר DMEM. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת בחום של 520 גרם למשך 2.5 דקות. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה את התאים ב-100 מיקרוליטר של DMEM.
לאחר מכן, במידת הצורך, בצע בדיקת התפשטות קולורימטרית זמינה מסחרית וקרא את הבדיקה בקורא ELISA. כל קווי התאים יכולים לייצר ספרואידים אמינים עם הבדלים בגודל ובזמן הקריאה. תאים ראשוניים אכן יצרו ספרואידים הניתנים לשחזור בלוחות הצמדה נמוכים במיוחד.
צביעת Ki-67 חושפת את פריפריה של התרבית המציגה שיעורי התפשטות גבוהים בהרבה מאשר תאים מרכזיים, ומחקה את התפלגות החומרים המזינים בגידולים ריריים מוצקים המראים לעתים קרובות ליבות נמקיות. כאן, ההשפעה של מספר טיפולים כימותרפיים והקרנות על גודל הכדור. קרינה עם שני אפורים לפני הטיפול בציספלטין, מובילה לירידה משמעותית בגודל הספרואיד בהשוואה לציספלטין בלבד.
עם התבססות נוספת של יצירת ספרואידים מתאים אנושיים ראשוניים, כך ניתן ליישם את הרעיון של בדיקות טיפוליות. ספרואידים ייווצרו לאחר ביופסיית הגידול, ולאחר מכן ייבדקו למאפיינים מולקולריים ורגישות לטיפול. הצלחנו ליצור פרוטוקול ליצירת ספרואידים הניתנים לשחזור מתרחיפים של תאים הן עבור קווי תאים והן עבור תאי גידול אנושיים ראשוניים.
בדיקה רב-מודאלית זו רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים קטנים בין קבוצות. בעתיד, ניתן יהיה להשתמש בבדיקה כדי להעריך תחילה את התגובה האישית לפרוטוקולי טיפול סטנדרטיים וניסיוניים. שנית, לאפיין עוד יותר את תאי הגידול מדגימות טריות.
ושלישית, מתאם את תגובת הטיפול לדפוסים מולקולריים. השימוש בתאים ראשוניים ויצירת ספרואידים יאפשרו שימור של כמה שיותר מאפיינים של צמיחת גידול in vivo בשילוב עם בדיקה חסכונית לחקר תגובת הטיפול האינדיבידואלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר מודל תלת-ממדי in vitro מבוסס ספרואידים, שנועד להערכת רגישות ועמידות לטיפול בקרצינומה של תאי squamous בראש ובצוואר. השיטה שואפת להגביר את ההבנה של צמיחת גידולים בתגובה לטיפולים בהקרנה ובכימותרפיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- קרצינומה של תאי קשקש של הראש והצוואר היא סוג סרטן מאתגר.
- לטיפולים הנוכחיים יש לעיתים קרובות יעילות משתנה.
- מודלים של תרביות תאים תלת-ממדיות יכולים לדמות טוב יותר תנאים in vivo.
- הטיפול בתאי גידול ראשוניים מציב אתגרים משמעותיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל in vitro מהימן לבדיקת טיפולים.
- הערכת היעילות של משטרי טיפול סטנדרטיים וניסיוניים.
- הסלה של מחקרים עתידיים בתאי אדם ראשוניים.
שיטות שנבחרו
- יצירה של ספרואידים בתרבית תאים תלת-ממדית.
- שימוש בקולגנאז לפירוק רקמה.
- דגירה של תאי גידול ראשוניים בטמפרטורה של 37 °C.
- הערכה של צמיחת הגידול תחת תנאי טיפול.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של ספרואידים מתאי גידול ראשוניים.
- תובנות לגבי דפוסי הגדילה של תאי סרטן ראש וצוואר.
- הערכה של תגובות לטיפול בסביבה מבוקרת.
- פוטנציאל לשיפור אסטרטגיות טיפול בהתבסס על הממצאים.
מסקנות
- המודל שפותח מבטיח עבור מחקרים עתידיים.
- הבנת העמידות לטיפול עשויה להוביל לתוצאות טובות יותר.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לדייק את המתודולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל תרבית תאים תלת-ממדית המבוסס על ספרואידים זה נותן מענה לצורך הקריטי במערכות פרה-קליניות חזויות לפיתוח תרופות לסרטן תאי קשקש של הראש והצוואר. על ידי מתן אפשרות לבדיקה סטנדרטית של רגישות לטיפול באמצעות תאי גידול ראשוניים, המערך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובגילוי ביומרקרים תרגומיים. גישה זו משפרת את מיון הפורטפוליו על ידי אספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור, המהוות בסיס להחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בשלבים מוקדמים של הגילוי וזיהוי המולקולות המבטיחות (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במערכת תלת-ממדית הרלוונטית למחלה, המדמה את ארכיטקטורת הגידול in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידות כמותיות של גודל הספרואידים והחיוניות שלהם לאחר הטיפול.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים להערכת השונות בתגובה לטיפול בין קווי תאים ודגימות ראשוניות, ובכך מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר יצירה סטנדרטית ובעלת תפוקה גבוהה של ספרואידים בלוחיות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד, לצורך סריקת תרכובות עקבית.
- ערך תפעולי: מאפשר חשיפה הדירה למשטרי כימותרפיה, הקרנה ואימונותרפיה עם נקודות סיום מוגדרות (גודל הספרואיד, חיוניות).
- יכולת הרחבה: תואם לפורמט של 96 בארות, התומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשילוב זרימת עבודה רב-תפקודית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שימוש בתאי גידול אנושיים ראשוניים לשמירה על מאפייני גידול ספציפיים למטופל, דבר המשפר את הרלוונטיות לחיזוי תגובה קלינית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר התאמה בין התגובה לטיפול לבין דפוסים מולקולריים (למשל, צביעת Ki-67) על מנת לזהות מנגנוני עמידות.
- מודל פרה-קליני: מספק מערכת יעילה מבחינה כלכלית וניתנת לשחזור להערכת משטרי טיפול סטנדרטיים וניסיוניים לפני מחקרים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור תוכניות אונקולוגיות המתמקדות בגידוליים מוצקים.
- ביולוגיה של תגליות: מקלה על בדיקת השערות בנוגע לדינמיקת צמיחת גידולים ואינטראקציות עם הסביבה המיקרוסקופית תחת לחץ של טיפול.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור (גודל הספרואיד, חיוניות) לאחר חשיפה ל-cisplatin, 5-FU, או שילובי קרינה.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של קבוצות טיפול באמצעות תיעוד תצويرי דיגיטלי ודיסוציאציה אנזימטית עבור בדיקות המשך.
- מחקר טרנסלציונלי: תומכת בהלימה של ביומרקרים על ידי קישור תגובת הספרואידים למסמני פרוליפרציה ופרופילים מולקולריים מדגימות ראשוניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת בדיקה סטנדרטית ובקרת איכות, הניתנת להתאמה לסוגי גידולים ושיטות טיפול שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון בניבוי על ידי מידול מדרגי רכיבי תזונה והטרוגניות של השכפול הנצפית בגידולים מוצקים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסוציאציה, זריעה והחלפת מצע גידול.
- ערך אסטרטגי: מפחית שחיקה ביולוגית על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של רגישות לטיפול במודלים המופקים מחולים.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי זיהוי מגיבים ולא-מגיבים לפני ביצוע מחקרים הדורשים משאבים רבים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמת גידול ראשוני ובטכניקות של דיסוציאציה אנזימטית.
- תלוי בשימוש בלוחיות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra-low adhesion) ובמיקרוסקופיה הפוכה לצורך ניטור הספרואידים.
- מחייב נהלי עבודה סטנדרטיים להחלפת מצעים כדי למנוע פגיעה בספרואידים במהלך השאיבה בפיפטה.
- דורש תיקוף על פני קווי תאים של HNSCC ודגימות ראשוניות מגוונות כדי להבטיח חסינות (robustness).
- מוגבל עקב שונות ביעילות היצירה של ספרואידים מתאים ראשוניים, דבר המחייב קביעת קריטריוני החרגה למבנים לא סדירים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Processing the Tumor Specimen
1:39
Seeding the Cells on Ultra-low Adhesion Cell Culture Plates and Exposing Spheroids to Multimodal Standard or Experimental Tumor Therapy
2:52
Assessment of Spheroid Size and Extent of Cellular Proliferation for Assay Read-out
4:08
Results: Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
5:12
Conclusion
