הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

מטרת ניסוי זה היא להחליף חומצת אמינו קנונית בחומצת אמינו לא קנונית לייצור חלבון רקומביננטי על ידי שילוב לחץ סלקטיבי לייצור חלבון פלואורסצנטי זהב חדש. שיטת שילוב הלחץ הסלקטיבי נועדה לייצר חלבונים בעלי תכונות כימיות חדשות. זה שימושי במיוחד כאשר מנסים להבין או להנדס את תפקוד החלבון.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית לביצוע מכיוון שהיא דומה לייצור חלבון רקומביננטי נפוץ. פלואורסצנציה בקורלציה של זמן ואורך גל מועילה לחקור את דינמיקת המצב הנרגש של החלבון המותאם, מה שבתורו מקל על הבנת ההשפעה של חומצת האמינו הלא קנונית המוחדרת לכרומופור על התכונות האופטיות. SPI יכול, באופן עקרוני, להיות מיושם על כל הגדרת ייצור חלבון שעבורה זמינים זנים אוקסוטרופיים ומדיה מוגדרת כימית.

זה כולל זני חיידקים אחרים וגם תרבית תאי יונקים. התזמון והגדרת תנאי הביטוי הם קריטיים מכיוון שחובה לדכא את הייצור של חלבון מסוג בר שאינו מותאם. לכן יש לייעל פרמטרים מסוימים כמו הטמפרטורה, זמן האינדוקציה או הרכב מצע הטיפוח.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה לאחר מחקרים ראשוניים של תמצית חלבון עם חומצות אמינו המכילות מתיל כגון סלנומתיונין. מי שידגים את ההליך יהיה אלמוט פלצר, סטודנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הפוך תאי E.coli אוקסוטרופיים טריפטופן עם פלסמיד הביטוי עבור ECFP.

השתמש במושבה בודדת כדי לחסן תרבית מוקדמת של חמישה מיליליטר מדיום LB בתוספת אמפיצילין בצינור תרבית. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. למחרת, יש לחסן 100 מיליליטר של מדיום NMM19 בתוספת באמצעות מיליליטר אחד של תרבית הלילה בבקבוק ארלנמאייר של ליטר אחד.

לאחר מכן, דגרו את התרבית למשך הלילה בשייקר מסלולי ב-200 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס. למחרת, מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר כל 30 דקות עד שהערך משתנה בפחות מ-0.05 במשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התרבית ב -5, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לקצור את תאי החיידקים.

השליכו את הסופרנטנט על ידי סילוק. השעו מחדש את התאים במדיום NMM19 בתוספת אמפיצילין לנפח כולל של 100 מיליליטר. העבר את המתלה הזה בחזרה לאותו בקבוק ארלנמאייר.

הוסף 4-אמינו-אינדול לריכוז סופי של מילימולר אחד. דגירה בשייקר מסלולי למשך 30 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. לאחר 30 דקות, הוסף IPTG לתרבית לריכוז סופי של 0.5 מילימולר כדי לגרום לביטוי גן מטרה.

דגירה למשך הלילה בשייקר מסלולי ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. למחרת, קצרו את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט על ידי סילוק.

הקפיאו את כדור התא במינוס 20 מעלות צלזיוס או מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לבצע טיהור חלבון מטרה. ראשית, הכן את הליזאט של תא החיידק כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הכנת עמודת הכרומטוגרפיה בהתאם להוראות היצרן, השתמש במאגר מחייב כדי לאזן את עמודת הכרומטוגרפיה של זיקה ליוני מתכת משותקת.

טען את הליזאט על העמודה עד לסיום. שימו לב לחלבון בצבע זהב הקשור לשרף הכרומטוגרפיה. שוטפים את העמוד עם מאגר מחייב.

לאחר מכן, יש לסלק את חלבון המטרה באמצעות מאגר פליטה. אסוף ואגד את כל השברים המנופחים המכילים חלבון פלואורסצנטי זהב, אותו ניתן לזהות על ידי צבע הזהב הנראה לעין. לאחר מכן, הכינו קרום דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי בין 5,000 ל-10,000 לפי הוראות היצרן.

דיאליזה של דגימה של מיליליטר אחד כנגד לפחות 100 מיליליטר של מאגר למשך שעתיים לפחות. כדי להתחיל, השתמש במאגר MS כדי לדלל את דגימת החלבון ל-0.1 מיליגרם למיליליטר, כך שהנפח הסופי הוא 80 מיקרוליטר. פיפטה בזהירות לערבב.

העבירו את התמיסה לבקבוקון דגימה אוטומטית של MS עם תוספת זכוכית, וסגרו אותו עם מכסה. החלק את הבקבוקון כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן, הכן ריק המכיל מאגר MS בבקבוקון שני.

הכניסו את שני הבקבוקונים לדגימה האוטומטית של HPLC. לאחר מכן, הכינו וכילו את מכשיר ה-MS בהתאם להוראות היצרן. הגדר את נפח הזרקת הדגימה האוטומטית לחמישה מיקרוליטר עבור הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים יחד עם שיטת ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרו-ספריי.

צור רשימת עבודה עבור הריצה הריקה, ואחריה הריצה לדוגמה של GdFP. הקצה את נפח ההזרקה, את מיקומי בקבוקון הדגימה האוטומטית המתאימים והפעל את רשימת העבודה. כדי להתחיל, הכינו תמיסת חלבון פלואורסצנטי זהב ואת הגלאי לספירת פוטונים בודדים בקורלציה של זמן ואורך גל כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

באמצעות תוכנת ספירת פוטונים בודדים, רכוש פליטת פלואורסצנציה בקצב ספירה של כ-200,000 פוטונים לשנייה עד שמצטברות כ-10,000 ספירות, במקסימום הרכישה של עקומות דעיכת הקרינה. לאחר מכן, החלף את קובטת הדגימה בקוביית קוורץ בגודל סנטימטר אחד מלאה בסיליקה קולואידית במאגר PBS. הוצא את מסנן הלייזר, והתאם את הסורג לקליטת פוטונים של 470 ננומטר בערוץ המרכזי של הגלאי.

לאחר מכן, רכוש את פונקציית התגובה האינסטרומנטלית עד להצטברות של כ-10,000 ספירות במקסימום הפליטה. המר, התאם ושרטט את הנתונים המתקבלים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי להשיג את הספקטרום הקשור לדעיכה, המייצג את התלות של זמני דעיכת הקרינה באורך גל הפליטה. במחקר זה, ספקטרומטריית מסה משמשת כדי לאשר כי וריאנט הפלואורופור מסוג חלבון פלואורסצנטי ירוק מוסט ספקטרלית לאדום, המכונה חלבון פלואורסצנטי זהב, מיוצר בהצלחה.

בעוד של-ECFP מסוג בר יש מסת חלבון מחושבת של 28,283.9 דלטון לאחר הבשלת הכרומופור, המסה המקבילה של חלבון פלואורסצנטי זהב היא 28,313.9 דלטון. ספקטרום ESI-MS המפותל של חלבון פלואורסצנטי זהב מציג שיא מסה עיקרי בכ-28,314.1 דלטון, החורג מהערך התיאורטי בפחות מ-10 חלקים למיליון. זה מאשר את שילוב חומצת האמינו הלא קאנונית על ידי שילוב לחץ סלקטיבי.

לספקטרום הספיגה של ECFP יש שני מקסימום אופייניים ב-434 ננומטר ו-452 ננומטר. לעומת זאת, חלבון פלואורסצנטי זהב מאופיין בפס ספיגה אחד רחב המוסט לאדום עם המקסימום של 466 ננומטר. בעוד שמקסימום הספיגה של EGFP מוסט עוד יותר לאדום ל-488 ננומטר, ספקטרום פליטת הקרינה של חלבון פלואורסצנטי זהב והיסט סטוקס המקביל של GdFP מסמנים שהוא המוסט לאדום ביותר מכל הנגזרות של חלבון פלואורסצנטי ירוק Aequorea victoria.

פליטת הקרינה שנפתרה בזמן המנוטרת על ידי ספירת פוטונים בודדים מוצגת כאן. עקומות הדעיכה מציגות דעיכה פלואורסצנטית מעט מהירה יותר ב-600 ננומטר מאשר ב-550 ננומטר. פליטת הקרינה של חלבון פלואורסצנטי זהב תלויה מאוד ב-pH, כפי שאופייני לגרסאות רבות של חלבון פלואורסצנטי ירוק.

כפי שניתן לראות כאן, יש ירידה ברורה בפלואורסצנטיות ב-pH נמוך יותר, אם כי המאפיינים הספקטרליים נשארים קבועים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים כאשר מתחילים ממושבות מתאי חיידקים שעברו טרנספורמציה או ממאגרי גליצרול קפואים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לוודא שחומצת האמינו הממוקדת מתרוקנת.

ה-ncAA חייב להיקלט על ידי התא, תואם ביולוגית, ולשלב אותו בחלבונים על ידי הזן האוקסוטרופי הנבחר. בעקבות הליך זה, ניתן לייצר מגוון גדול של חלבונים למטרות הנדסיות. בהתאם לשיטות חלבון המטרה, כמו מנתחי יציבות חלבון, ניתן להשתמש במבחני פעילות אנזימטית, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית או התגבשות חלבון, כדי לתאר את ההשפעה של חומצת האמינו הלא קנונית, על תכונות פונקציונליות ומבניות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו הוכיחה את עצמה כשימושית מאוד בתחום הביולוגיה הסינתטית, וסיפקה לה חלבונים ופרוטאומים חדשים לטבע. זה מרחיב את היכולות הכימיות להנדסת חלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב חומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים רקומביננטיים על ידי שילוב לחץ סלקטיבי, כיצד לאמת הכנסת חומצת אמינו מלאכותית על ידי ספקטרומטריית מסה, וכיצד לנתח חלבון פלואורסצנטי על ידי פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן.