ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לייצר את נגיף הבקולו בתרבית תאי חרקים, לטהר עם כרומטוגרפיה של זיקה להפרין ולהתרכז באולטרה-צנטריפוגה. המוצר הסופי יכול לשמש להעברת גנים in vivo או כחיסון. שיטה זו יכולה לעזור לחוקרים שרוצים להשתמש ב-baculovirus מטוהר ומרוכז ליישום ריפוי גנטי.

חלקיקי נגיף הבקולו עשויים להכיל פסולת תאית וחלבונים מתרבית Sf9 שעלולים לגרום לדלקת או לתגובה חיסונית בשימוש בבני אדם. כדי למנוע רעילות, נגיף הבקולו מטוהר ומופרד מחלקיקים מזהמים. חלקים מסוימים של ההליך יודגמו על ידי מרילו נרסיסו, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי.

כדי להגדיר את תרבית ההשעיה, זרעו 50 מיליליטר של תאי Sf9 במדיום תרבית חרקים לתוך בקבוק ארלנמאייר פוליקרבונט בנפח 250 מיליליטר. והניחו את הבקבוק בחממת שייקר מסלולית. הוסיפו שני מיליליטר של נגיף הבקולו P2 לתאים, ונערו במהירות של 135 סל"ד תוך שמירה על טמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס.

ארבעה ימים לאחר ההדבקה, כל אוכלוסיית תאי Sf9 תראה אפקט ציטופתי, המהווה אינדיקציה לייצור גבוה של נגיף הבקולו. להגביר ברצף את נגיף הבקולו עד לקבלת הנפח הרצוי, על ידי הגדלת נפח תרבית התאים בכל זיהום עוקב פי 10 עד 50. לאחר צנטריפוגה של הסופרנטנט הסופי של נגיף הבקולו-וירוס למשך 30 דקות ב-1000 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את הפסולת התאית, העבירו את הסופרנטנט לכלי נקי וטפלו בנוקלאז ב-50 יחידות למיליליטר למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לעכל את ה-DNA וה-RNA הגנומי.

לבסוף, סנן את הסופרנטנט הנגיפי דרך יחידת סינון של 0.45 מיקרון. הגדר את מערכת הכרומטוגרפיה על ידי הנחת קו חיץ הכביסה מיציאת הכניסה A1 לבקבוק המכיל לפחות 500 מיליליטר של מאגר כביסה. השתמש ביציאת כניסת המאגר A2 לטעינת מאגר הפליטה.

הכנס כמה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר לתוך אספן השברים כדי לאסוף את הסופרנטנט של נגיף ה-baculovirus העובר בעמודה, את מאגר הכביסה ואת נגיף ה-baculovirus החמקמק. איזון עמוד הפרין עם חמישה נפחי עמודות של 7.9 מיליליטר של מאגר כביסה בקצב זרימה ליניארי של שבעה מיליליטר לדקה. טען 250 מיליליטר של baculovirus supernatant, על עמודת הפרין באמצעות משאבת הדגימה של יציאת דגימת הכניסה בקצב זרימה ליניארי של שני מיליליטר לדקה.

לאחר מכן הפעל 10 נפחי עמודות של מאגר כביסה דרך עמודת הפרין בקצב זרימה ליניארי של שני מיליליטר לדקה עד שעקומת הספיגה האולטרה סגולה תחזור לקו הבסיס ותהפוך ליציבה. חמק מחלקיקי נגיף הבקולו מעמודת הפרין עם חמישה נפחי עמודות של מאגר פליטה בקצב זרימה ליניארי של ארבעה מיליליטר לדקה. שימו לב לשיא פליטה חד של חלבון בכרומטוגרמה כאשר חלקיקי נגיף הבקולו מתנתקים מעמודת הפרין.

לאחר הפליטה, יש לדלל מיד את הסופרנטנט של נגיף הבקולו-וירוס פי 10 באמצעות מאגר נתרן פוספט של 20 מילימטר כדי למנוע הפעלה של חלקיקי נגיף הבקולו מהלם אוסמוטי במהלך הצנטריפוגה שלאחר מכן. התחל את הליך הריכוז על ידי הוספת נפח שווה של הסופרנטנט של נגיף הבקולו-וירוס לחיטוי לצינורות אולטרה-צנטריפוגה. מדוד את משקל הצינור על ידי איזון והתאם את משקל התוכן של צינורות האולטרה-צנטריפוגה בעזרת PBS סטרילי.

הנח כל אחד מצינורות האולטרה-צנטריפוגה בדלי נגדי של הרוטור SW 32 Ti והפעל את האולטרה-צנטריפוגה ב-80,000 גרם למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, פתח את צינורות האולטרה-צנטריפוגה במכסה תרבית רקמה ושאף את הנוזל באופן אספטי מבלי להסיר את כדור הבקולו-וירוס. הוסף 200 מיקרוליטר PBS המכיל 0.5% BSA והשהה מחדש כל כדור על ידי פיפטינג נמרץ למעלה ולמטה.

לבסוף, העבירו 50 עד 100 מיקרוליטר של נגיף הבקולו המרוכז לקריוביאלים ואחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. טיטרים של Baculovirus הוערכו על ידי זיהום של תאי HT1080. הקו המחובר על ידי יהלומים מראה את סך היחידות הזיהומיות של נגיף הבקולו בכל שבר.

חלקיקי נגיף הבקולו נקשרים חזק לעמוד הפרין, ולכן לא מתגלה כמות משמעותית של וירוס במאגר שטיפת העמודים. שיא חד של חלבון נצפה במהלך הפליטה, התואם את חלק נגיף הבקולו. הפרמטרים המשמשים בפרוטוקול זה ממקסמים את התפוקה וממזערים את ההשבתה של חלקיקי נגיף הבקולו הזיהומיים.

פרוטוקול זה יכול לשמש לטיהור נגיפים וחלבונים אחרים שיש להם זיקה להפרין.