להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת
9 באפריל 2018
אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לצבוע שלדי ציטו של אקטין ומיקרו-צינורות בסינפסה החיסונית של תאי B לצורך דלדול פליטה מגורה, או מיקרוסקופ STED, והדמיית המבנה שלהם, ארגונם ביחסים מרחביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ארגון שלד התא במהלך הפעלת תאי B, כולל ארגון מחדש של שלדי הציטו של האקטין והמיקרו-צינורות במהלך היווצרות סינפסה חיסונית. היתרון העיקרי של מיקרוסקופ STED רב-צבעוני הוא בכך שהוא מאפשר הדמיה בו זמנית של שלד הציטו של האקטין, רשת המיקרו-צינוריות וחלבונים מרכזיים הקשורים לשלד הציטו ברזולוציה בקנה מידה ננומטרי.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפעלת תאי B, ניתן ליישם אותה גם על היווצרות סינפסות חיסוניות של סוגי תאים חיסוניים אחרים כגון תאי הרג טבעיים ותאי T. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יגלו כי אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ להדמיה בו זמנית ולפלואורופורים מרובים באמצעות STED תדרוש תרגול מסוים. ידגימו את ההליך הזה יחד עם ג'יה ומדיסון קייט צ'וי וקייטלין פריצ'רד.
התחל בצנטריפוגה של 2.5 פעמים 10 עד 6, תאי לימפומה מסוג B A20 לכל טרנספקציה, והשעיה מחדש של התאים ב-100 מיקרוליטר של ריאגנט טרנספקציה בתוספת אחד עד 2.5 מיקרוגרם של ה-DNA של הפלזמה המעניין. מערבבים את התמיסות בעדינות ומעבירים כל כמות תאים לבארות בודדות של צלחת של שש בארות. כוונן את הנפח בכל באר לשני מיליליטר עם מדיום שלם של 37 מעלות צלזיוס והנח את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
למחרת בבוקר, טבלו 1.5 18 מילימטר כיסויי זכוכית עגולים ב-100% מתנול ותנו לכיסויים להתייבש לחלוטין למשך כ-10 דקות. הניחו את הכיסויים המיובשים בבארות בודדות של צלחת תרבית רקמה בת 12 בארות והוסיפו 400 מיקרוליטר של נוגדן אימונוגלובולין G נגד עכבר עזים למרכז כל כיסוי כך שתיווצר בועה במרכז ומתפשטת לקצוות מבלי לטפטף לבאר. דגרו את הכיסויים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר מכן שטפו את הכיסויים במיליליטר אחד של PBS סטרילי לבאר, שלוש פעמים, כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. לאחר הכביסה האחרונה, אחסן כל כיסוי במיליליטר אחד של PBS טרי וסטרילי עד לזריעת התאים. כאשר התאים המועברים מוכנים, אספו אותם בצינור חרוטי של 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של תמיסת מלח חוצצת HEPES שונה בתוספת FBS.
לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לריכוז של 2 על 10 עד 5 תאים למיליליטר ולשנות את תמיסת המלח HEPES בתוספת FBS, ולהשתמש במלקחיים כדי להעביר כל כיסוי על פיסת סרט פרפין. הוסף 250 מיקרוליטר של תאים לכל כיסוי ודגר את הכיסוי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך כדי לאפשר לתאים להתפשט על פני המשטחים המצופים אנטי-אימונוגלובולין G. בתום הדגירה יש להסיר את עודפי המלח מכל שקופית ולצפות כל כיסוי ב -350 מיקרוליטר של קיבוע, תוך הקפדה על כיסוי המשטח כולו.
לאחר 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר, השתמש במיקרופיפטה כדי לשאוב בזהירות את הקיבוע מקצה כל כיסוי ולשטוף את הכיסויים עם 500 מיקרוליטר של חדירות וחסימה. לאחר מכן, חדור וחסום את התאים עם 250 מיקרוליטר של חדירות טרייה וחסימת מאגר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, הסר את המאגר העודף וסמן את התאים ב-50 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המעניין למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה יש לשטוף את הכיסוי שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר מכתים בכל שטיפה ולהוסיף 50 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המתאים לכל כיסוי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הנוגדן המשני, הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב הרכבה לשקופית מיקרוסקופ והרכיב את החלקות הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ בודדות, כשצד התא כלפי מטה. לאחר מכן הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה בחושך להדמיה למחרת.
כדי לדמות את התאים במיקרוסקופ STED, הפעל תחילה את מיקרוסקופ STED. הפעל את הלייזרים במנורת התאורה האפיפלואורסצנטית ופתח את תוכנת המיקרוסקופ. הגדר את הפרמטרים עבור לייזרי הדלדול STED וטען את הדגימה הראשונה על המיקרוסקופ.
בעזרת העינית, התמקד ידנית בדגימה כדי לבחור תא עם ביטוי GFP מתון. התקרב לתא שנבחר ובחר את אזור העניין שברצונך לצלם. כוונן את המיקוד כך שמישור ה-XY של התא הקרוב ביותר לכיסוי יהיה ממוקד.
לאחר מכן, תחת הכרטיסייה Acquire של התוכנה, סמן את האפשרות Between Frames בחלונית Sequential Scan כדי להגדיר את רכישת התמונה לרכישת פריימים רציפה. הגדר את עוצמת הלייזר STED עבור כל פלואורופור והשתמש במוט ההחלקה כדי להתאים את עוצמות הלייזר בהתאם לפלואורופורים המשמשים בניסוי. כדי להגדיל את הרזולוציה ולהפחית את אות הרקע, פתח את הגדרות הרכישה והשתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור ערך גדול מאחד כדי להגדיל את ממוצע הקו ו/או המסגרת.
בדוק את אפשרות הרווח עבור כל פלואורופור ואת הערכים הספציפיים לצבירת זמן כדי לרכוש את האות הפלואורסצנטי המתאים עבור STED מגודר בזמן ולהגדיל את עוצמת הלייזר STED כדי לשפר את הרזולוציה. זה קריטי לייעל את צבירת זמן הרכישה עבור דגימת המיקרוסקופ והפלואורופורים המשמשים לשיפור הרזולוציה מבלי לאבד יותר מדי מהאות הפלואורסצנטי. לאחר מכן רכוש באופן ידני מספר תמונות כדי להבטיח שחזור ולבטל את פיתול התמונות באמצעות חבילת תוכנת דה-קונבולוציה בהתאם להוראות היצרן.
עבור תאי לימפומה מסוג B A20, התפשטו על נוגדנים אימונוגלובולינים משותקים. מיקרוסקופיה STED המשמשת בשילוב עם תוכנת דה-קונבולוציה מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של מבני שלד ציטו מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית בלבד. למרות שדה-קונבולוציה של תמונות קונפוקליות מניבה שיפור משמעותי ברזולוציה של התמונה, תמונות STED לא מפותלות מספקות מידע מבני מפורט יותר מאשר תמונות קונפוקליות לא מפותלות.
ניתן להשתמש ב-STED בצבע יחיד גם כדי לרכוש תמונות תלת מימדיות ברזולוציה גבוהה של כל רשת השלד התא-ציטולוגי של תאי B. בתמונות STED צבעוניות אלה, ניתן להבחין בצביעה של הטבעת ההיקפית של האקטין הדנדריטי בשילוב עם צביעת מיקרו-צינורות. בעת שימוש בתאים שהועברו עם חלבוני היתוך פלואורסצנטיים, השגת רמות ביטוי אופטימליות והימנעות מחפצים עקב ביטוי יתר הם שיקולים משמעותיים, בעוד שביטוי נמוך מדי של חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי מביא גם לתמונות באיכות ירודה.
התמקדות זהירה, שתכלול את כל אזור העניין, היא גם חיונית. לדוגמה, בתמונה זו, רק חלקים מרשת המיקרו-צינורות היו בתוך מישור המוקד הקרוב ביותר לכיסוי, מה שמנע ניתוח מלא של הדגימה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך יומיים.
יום אחד להכנת הדגימה והצביעה ויום אחד להדמיית STED. חשוב לזכור לטטר את כמות הפלזמה שבה יש להשתמש כדי להעביר את התאים כך שתקבל ביטוי מספיק של חלבון פלואורסצנטי לזיהוי במהלך הדמיה תוך הימנעות מביטוי יתר של חפצים. בעקבות הליך זה, ניתן לגרום לביטוי של חלבוני היתוך פלואורסצנטיים שונים כדי להקל על לוקליזציה של חלבונים אחרים המווסתים את הדינמיקה והארגון של השלד התא, או כדי לדמיין את ההתפלגות התת-תאית של חלבונים המעורבים בתהליכים תאיים אחרים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ STED להדמיה של מבנים ושלד חלבונים המעורבים ביצירת סינפסות חיסוניות. אל תשכח שעבודה עם מקבעים כמו גלוטרלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה בקולטים אדים כימיים בעת שימוש בריאגנטים מסוג זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיית STED להדמיה של מבני אקטין, מיקרוטובוליים וחלבונים הנקשרים לקצה החיובי של המיקרוטובוליים בתאי B. הוא משמש כמודל לחקר השלב הראשוני של היווצרות הסינפסה החיסונית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- הבנת ארגון השלד התאי היא קריטית במהלך הפעלת תאי B.
- היווצרות סינפסה חיסונית היא תהליך מרכזי בתגובה החיסונית.
- מיקרוסקופיית STED מאפשרת דימוי ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים.
- ניתן להחיל שיטה זו גם על סוגים אחרים של תאי מערכת החיסון.
מטרת המחקר
- צביעה והדמיה של שלד התא המורכב מאקטין ומיקרוטובוליים בסינפסה החיסונית של תאי B.
- בחינת הארגון מחדש של שלד התא במהלך היווצרות הסינפסה החיסונית.
- שיפור ההבנה של מנגנוני ההפעלה של תאי B.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיית STED רב-צבעית לדימות סימולטני.
- פרוטוקולי צביעה למבני אקטין ומיקרוטובולים.
- אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ עבור מספר פלואורופורים.
- יישום על תאי B הפרוסים על לוחות כיסוי מצופים בנוגדי גוף.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של רשתות actin ומיקרוטובולי ברזולוציית ננומטרים.
- תובנות לגבי הארגון המרחבי של השלד התאי במהלך היווצרות הסינפסה החיסונית.
- הדגמה של ישימות השיטה לתאי מערכת חיסון אחרים.
- זיהוי חלבונים מרכזיים הקשורים לשלד התאי המעורבים בהפעלה של תאי B.
מסקנות
- מיקרוסקופיית STED היא כלי רב עוצמה לחקר הדינמיקה של השלד התאי.
- השיטה מספקת תובנות בעלות ערך לגבי תהליכי הפעלה של תאי מערכת החיסון.
- ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה נוספת עבור משתמשים חדשים בטכניקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות ברזולוציה גבוהה (Super-resolution) של דינמיקת השלד התאי בסינפסה החיסונית של תאי B מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית בשלבים מוקדמים של גילוי אימונולוגי. ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של ארגון מחדש של אקטין ומיקרוטובולו מספקת מידע לתיקוף מטרות ותומכת בביטחון חיזוי במסלולי איתות חיסוניים. יכולת זו מחזקת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד לתוכניות פרה-קליניות של מודולציה חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של עיצוב מחדש של השלד התאי במהלך הפעלת תאי B לצורך בדיקה של היפותזות מכניסטיות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי חשיפת מערכות יחסים מרחביות בין אקטין, מיקרוטובוליים וחלבונים רגולטוריים.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת הרצף והתיאום של אירועי היווצרות הסינפסה החיסונית.
- משפר את הביטחון החזוי באסטרטגיות של מודולציה של מסלולים לטרגט של תאי מערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק פרוטוקולי דימיון מאושרים לכימות שינויים בשלד התא בתגובה למודולטורים פוטנציאליים.
- מאפשר הערכה כמותית הניתנת לשחזור של ארגון האקטין והמיקרוטובוליים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- תומך במוכנות לסריקה על ידי מתן אפשרות לגילוי מולטיפלקסי של חלבוני שלד התא וחלבון סיגנלינג.
- מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה על פני סוגי תאי חיסון שונים, כולל T-cells ו-NK cells, לצורך פיתוח רחב יותר של בדיקות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים פלטי תצלומי שלד התא למודלים של הפעלה חיסונית הרלוונטיים למחלה.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי במערכת in vitro ועד לאימות פרה-קליני של מודולטורים של הסינפסה החיסונית.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת ראיות מכניסטיות למעורבות המטרה.
- משפר את הפחתת הסיכונים החזויית (predictive de-risking) עבור אסטרטגיות של מודולציה חיסונית במחקר תרגומי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול מיקרוסקופיית STED זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח ברזולוציה גבוהה של היווצרות סינפסים חיסוניים ודינמיקה של השלד התאי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תיאום השלד התאי במהלך הפעלת תאי B והרכבת הסינפסה החיסונית.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על ארגון השלד התאי.
- אנליטיקה: מספק מדידות מרחביות בקנה מידה ננומטרי להשוואת סידורי האקטין והמיקרוטובול תחת תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין עיצוב מחדש של השלד התאי in vitro למודלים של הפעלה חיסונית הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית של דימוי הניתנת להתאמה לסוגי תאי חיסון ותוכניות מחקר מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דימוי ברזולוציה גבוהה לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרת מנגנוני הסינפסה החיסונית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תוכניות מודולציה חיסונית מותאם סיכונים, המבוסס על תובנות מכניסטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת ובביולוגיה של השלד התאי.
- מחייב גישה למיקרוסקופ STED ולתוכנת דה-קונבולוציה (deconvolution) תואמת.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות ופרמטרי הדימות בין הצוותים השונים לצורך הדירות (reproducibility).
- יש לבצע אופטימיזציה של פרוטוקולי הטרנספקציה והצביעה עבור כל סוג תא וחלבון נחקר.
- בקרה קפדנית של רמות הביטוי של החלבון הפלואורסצנטי היא קריטית למניעת ארטיפקטים של דימות.
