התפשטות ובידול של קודמן מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R תאים

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבצע מודיפיקציה גנטית לתאי myeloid 32D-G-CSF-R של עכברים על ידי ביטוי יתר או השתקה של הגן המדובר, וקביעת ההשפעה של שינויים אלו על השכפול והדיפרנציאציה הנויטרופילית של שלב התאים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההמטולוגיה, כגון האופן שבו החלבון הנחקר עשוי להיות מעורב בצמיחה ובדיפרנציאציה של תאי מוצא מיאלואידיים. היתרון המרכזי של שלב תאים זה הוא שיש לו יכולת שכפול בלתי מוגבלת, הוא רגיש למניפולציות גנטיות, עלותו נמוכה יחסית, והוא מאפשר מידה של פישוט ביולוגי הנדרשת בגישות ניסיוניות מסוימות. את הפרוצדורה ידגים היום פטר דנאק, סטודנט לדוקטורט במעבדה שלי.

הכינו 250 milliliters של מצע RPMI-1640 המועשר ב-10% fetal bovine serum שעבר אינאקטיבציה בחום ו-10 nanograms per milliliter של murine interleukin-3. לאחר מכן, הכינו 50 milliliters של מצע דיפרנציאציה.

בצלחת פטרי בקוטר 16 סנטימטר, זרע תרחיף של תאים בודדים של תאי Bosc23 ב-18 מיליליטר של מצע DMEM מועשר ב-10% fetal bovine serum. דגור למשך כ-24 שעות עד שהצפיפות (confluency) תגיע ל-80%. לאחר מכן, ערבב את מבנה הרטרו-וירוס MSCV, וקטור אריזה PCL-echo, poly-ethylenimine ומצע עם ריכוז סרום מופחת ללא אנטיביוטיקה. דגור תערובת זו ב-Flowbox בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, החלף בזהירות את מצע התרבית של תאי Bosc23 ב-16 מיליליטר של מצע DMEM שחומם מראש והועשר ב-2% fetal bovine serum שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בשלב הבא, הוסף את תערובת הרטרו-וירוס בטיפות על תאי Bosc23. לאחר מכן, דגור את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

עם סיום הדגירה, שאבו את מצע התרבית של Bosc23 והוסיפו 18 milliliters של מצע DMEM שחומם מראש עם 10% fetal bovine serum. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 48 hours. השתמשו בפיפטה סרולוגית של 25 milliliter כדי להעביר את המצע המכיל את נגיף ה-Bosc23 אל מבחנה קונית של 50 milliliter. אחסנו את המבחנה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר מכן, הוסיפו 18 milliliters של מצע DMEM שחומם מראש עם 10% fetal bovine serum לתאי Bosc23 וגדלו את התאים למשך 24 hours.

סובבו את העל-נוזל הוויראלי בצנטריפוגה ב-1,500 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חלקו את הנגיף לאליקוטים והקפיאו אותו בהקפאה מהירה (snap freeze) באמצעות חנקן נוזלי לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.

בכל באר של פלטה בעלת שישה בארות, זרעו תאי NIH/3T3 בשלושה מיליליטר של מצע DMEM מועשר ב-10% fetal bovine serum לצורך תיתור של נגיף אחד. גדלו את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. למחרת, דללו את הנגיף עם מצע שחומם מראש, ללא שימוש ב-vortex כדי למנוע ערבוב חזק של החלקיקים הנגיפיים. שאבו את מצע התרבית מתאי ה-NIH/3T3 והוסיפו מיליליטר אחד של הנגיף המדולל לכל באר. דגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך הלילה. למחרת, שאבו בזהירות את המצע הנגיפי המדולל והחליפו אותו בשני מיליליטר של מצע DMEM עם 10% fetal bovine serum, ודגרו שוב בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך הלילה. לאחר הדגירה, שאבו את המצע הישן והחליפו אותו במצע DMEM המכיל puromycin בריכוז של שני מיקרוגרם למילליליטר. המשיכו לגדל את התאים בכל שלושה ימים, או כאשר המצע הופך לצהוב, והחליפו אותו במצע טרי המכיל puromycin.

בין היום ה-10 ל-12 לאחר ההדבקה, שאבו את המצע מהבארים ושטפו בעדינות עם phosphate buffered saline. לאחר מכן, צבעו עם מיליליטר אחד של תמיסת crystal violet בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר הצביעה, שטפו בזהירות פעמיים עם phosphate buffered saline. ספרו תחת מיקרוסקופ את המספר הכולל של המושבות הכחולות בכל באר.

זריעו את תאי 32D-G-CSF-R בצלחת שש-בארים. הוסיפו וירוס בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) שבין 10 ל-40. לאחר מכן, הוסיפו פוליב renormalization (polybrene) לתאים עד לריכוז סופי של 8 µg/mL והדגרירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שש שעות. לאחר ההדגירה, רכזו את התאים לשפופרת של 15 ml וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 450 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. תאי 32D עלולים לאבד חלקית את יכולתם להתמיין אם יגודלו בריכוזים הגבוהים ממיליון תאים ל-ml, ולכן חשוב מאוד לפצל את התאים בזמן ולהימנע מצפיפות יתר של התרביות.

שפפו את העלייה (supernatant) ותלה את התאים בבקבוק תרבית T25 המכיל שישה מיליליטר של מצע RPMI-1640 המועשר ב-10% fetal bovine serum שעבר אינאקטיבציה בחום ו-10 nanograms per milliliter של murine interleukin-3. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות.

שטפו את תאי 32D-G-CSF-R פעמיים עם מצע RPMI-1640 ללא ציטוקינים. לאחר מכן, זרעו את התאים במיליליטר אחד של מצע דיפרנציאציה בלוחית בעלת 24 בארות ביום אפס, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. התאים יזדקקו לשבעה עד תשעה ימים כדי להבדיל (differentiate) לגרנולוציטים בוגרים. לאחר מכן, ספרו את מספר התאים באמצעות trypan blue כדי להוציא תאים מתים מהספירה.

מכיוון ש-IL-3 עשוי לעכב את תהליך ההתמיינות, קריטי ביותר להסיר את כל עקבות הציטוקין לפני תרביות התאים ב-GCSF.

בצעו Cytospin לתאים על גשרי זכוכית במכשיר צנטריפוגה עם המתאמים המתאימים ב-20 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, קבעו את התאים במתנול למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והניחו לתאים להתייבש. צבעו את התאים באמצעות צביעת May-Grunwald Giemsa לפי פרוטוקול היצרן. לאחר הצביעה, הדגימו את התאים שספגו את הצבע באמצעות הגדלה של 40X.

על סמך מורפולוגיה תאית, כמת את מספר הבלסטים, התאים בעלי בידול בינוני והגרנולוציטים הבשלים בקרב התאים הצבועים.

מוצג כאן ייצוג גרפי המדגים פרוליפרציה של תאי 32D-G-CSF-R במצעים המכילים interleukin-3 וגורם מעורר מושבות גרנולוציטים. ציר ה-x מייצג את ימי הטיפול, וציר ה-y מייצג את מספר התאים בסקאלה לוגריתמית. הגרף השחור מראה פרוליפרציה כאשר התאים גודלים במצע המכיל interleukin-3. הגרף הכחול מראה ירידה בפרוליפרציה של התאים כאשר הם גודלים במצע המכיל גורם מעורר מושבות גרנולוציטים.

מוצגים כאן תרשימי עוגה מייצגים וצביעת May-Grunwald Giemsa המראים את הפרופורציה ומורפולוגיית הדיפרנציאציה של תאי 32D-G-CSF-R במצע המכיל granulocyte colony stimulating factor. תרשימי העוגה מדגימים את הפרופורציה של בלאסטים, תאים בעלי דיפרנציאציה בינונית ונויטרופילים במהלך טיפול ב-granulocyte colony stimulating factor ביום אפס, שניים, ארבעה ושש. תאים שנצבעו ב-Giemsa ביום אפס הם בעלי גרעינים גדולים אופייניים וציטופלזמה כהה. ביום השישי, גודל הגרעין מצטמצם והציטופלזמה מורחבת אך אינה כהה.

מוצגים כאן תרשימי עוגה מייצגים המראים שיעור גבוה יותר של תאי בלאסט (blast cells) כאשר בוצע טרנסדוקציה עם חלבוני היתוך BCR-ABL בהשוואה לווקטור MSCV ביקורת, במצע המכיל גורם מעורר לקולוניות גרנולוציטים (granulocyte colony stimulating factor). צביעת גימזה (Giemsa) בפאנל התחתון מייצגת את התאים לאחר טרנסדוקציה עם חלבוני ביקורת או חלבוני היתוך BCR-ABL.

התאים עברו דיפרנציאציה נויטרופילית ביום השישי כאשר הותעו עם וקטור בקרה MSCV, אך תאים שהותעו עם BCR-ABL הראו בעיקר תאי בלאסט ולא נויטרופילים בוגרים.

ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן לבצעה ביומיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לגדל את תאי 32D-G-CSF receptor בריכוזים המצוינים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות נדידה (migration assays) וניסויי הישרדות כדי לענות על שאלות נוספות. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של האופן שבו יש לטפל בקו התאים 32D-G-CSF receptor, כולל מניפולציה גנטית באמצעות טרנסדוקציה לנטיווירלית ורטרווירלית, הרחבה, דיפרנציאציה והערכה של הפרוליפרציה והדיפרנציאציה של תאים אלו. אל תשכחו שעבודה עם וירוסים עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות והרכבת משקפי מגן בעת ביצוע פרוצדורה זו.